含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法
2023-05-29 21:47:41
含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法
【專利摘要】含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，通過在該含有胰液成分的生物試樣中添加至少一種以上的具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑，對該生物試樣中的蛋白酶的酶活性進行抑制。此外，該含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑是具有氟磺醯基的化合物，具有蛋白酶抑制活性且為了抑制該生物試樣中的蛋白酶而被添加到含有胰液成分的生物試樣中。進而，該含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒，含有至少1種以上的具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑，被用於保存含有胰液成分的生物試樣。
【專利說明】含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用於抑制含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的酶活性的方法，對胰液或十二指腸液中的來自胰液的成分的分解的抑制有效的蛋白酶抑制劑、及含有該蛋白酶抑制劑的胰液等生物試樣保存用試劑盒。
[0002]本申請基於2011年9月13日在日本提出的日本特願2011-199357號主張優先權，在此引用該內名
【背景技術】
[0003]體液是用於獲知臟器狀態的重要的生物試樣。胰液也是用於了解胰腺狀態的重要的生物試樣，可以用於細胞診斷、碳酸氫鹽測定、細菌檢查、由蛋白質和/或核酸等組成的標誌物的檢查等。在研究中，也在廣泛進行胰腺癌等胰腺相關疾病的新標記物的探索。
[0004]由於胰液是消化液，因此含有各種各樣的消化酶。已經知道這些消化酶雖然在胰腺內以非活性狀態存在，在排出到十二指腸後活化。胰液中的消化酶，在由十二指腸上皮細胞分泌的小腸腸激酶的作用下，進行分解級聯反應。已知胰液中含有的胰蛋白酶原在小腸腸激酶的作用下活化，變成胰蛋白酶，進而該胰蛋白酶成為誘因，將胰凝乳蛋白酶原、酯酶原等各種消化酶(蛋白酶)活化。另外，據說胰蛋白酶原佔胰液總蛋白量的約12%左右(例如，參照非專利文獻2)。通過這些各種消化酶的活化，胰液中含有的蛋白質、核酸、脂質、細胞等生物分子在排出到十二指腸之後被分解、變性。因此，在對排向十二指腸的胰液進行細胞檢查、生物分子測定等 檢查、研究發揮作用的場合，擔心胰液中的作為目的物的細胞、蛋白質等會受到蛋白酶的影響，導致不能進行準確地測定。因此，如何抑制排出到十二指腸的胰液中的蛋白酶活性變得重要。
[0005]作為以往為使胰液、十二指腸液中的各種分解酶的活性降低的方法之一，已有將採集到的胰液在冷卻狀態下保存，通過避開酶活性的最適溫度來抑制活性的方法。一般而言，需要將採集到的胰液等立即置入冰中，並且，也需要迅速對該胰液等進行檢查(例如，參照非專利文獻I)。但是，在該方法中，一旦胰液等的溫度升高，有可能再次進行酶反應。因此，通常使採集到的胰液總是保存在低溫下，處理繁雜。此外，根據蛋白質的種類不同，即使是低溫有時也會進行分解，因此單純在低溫下保存，對於抑制來自胰液成分的分解/變性等是不充分的。
[0006]已經公開為了測定胰液中的蛋白質，在於內窺鏡下採集到的胰液0.5mL中添加抑肽酶0.2mL進行冷凍保存的方法(例如，參照非專利文獻2)。通過冷凍保存，在保存期間內可以抑制胰液中幾乎全部的蛋白酶的活性，可以穩定保存該胰液中的細胞、蛋白質等。但是，冷凍保存的胰液需要在測定前進行溶解，有時會再次進行溶解後的細胞、蛋白質等的分解。並且，在冷凍保存中作為解析對象的分子本身也有可能受損。
[0007]此外，作為保存生物試樣、特別是保存血液的方法，已經公開在含有至少兩種以上的蛋白酶抑制劑的容器中直接採集血液的方法(例如參見專利文獻I。)。通過使採集到的血液立即與蛋白酶抑制劑接觸，可以防止血液中的蛋白質的分解等。在該方法中，使用絲氨酸蛋白酶抑制劑和其他蛋白酶抑制劑，例如，將血液採集到含有AEBSF、抑肽酶、亮抑酶肽等絲氨酸蛋白酶抑制劑和E-64等半胱氨酸蛋白酶等的容器中。
[0008]現有技術文獻
[0009]專利文獻
[0010]專利文獻1:日本專利第4496407號公報
[0011]非專利文獻
[0012]非專利文獻1:勝沼等I人、「分析」、1978年、第10卷、第682~689頁。
[0013]非專利文獻2:橫山等8人、Pancreas、2002年、第24卷、第4號、第344~347頁
【發明內容】
[0014]發明要解決的問題
[0015]為了使採集到的胰液、十二指腸液等穩定且容易處理，可以認為與專利文獻I中所記載的方法同樣地在採集到的體液中添加蛋白酶抑制劑的方法是有用的。
[0016]但是，在血液中和胰液中含有的蛋白酶的種類差異很大。因此，即使在胰液、十二指腸液等含有胰液成分的體液中添加專利文獻I中記載的有效地降低血液中的蛋白酶活性的蛋白酶抑制劑，也不能抑制該體液中的蛋白酶的活性。
[0017]本發明的目的在於，提供能夠有效抑制胰液、十二指腸液等含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶活性的蛋白酶抑制劑，使用該抑制劑的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法及含有該蛋白酶抑制劑的胰液等生物試樣保存用試劑盒。
`[0018]用於解決問題的方案
[0019]本發明人等為了解決上述課題進行了銳意研究，結果發現具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑對胰液中含有的蛋白酶的活性抑制效果最高，從而完成了本發明。
[0020](I)本發明的第一方式是一種含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，其通過在含有胰液成分的生物試樣中添加至少I種以上的具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑，對該生物試樣中的蛋白酶的酶活性進行抑制。
[0021](2)在前述(I)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑優選為選自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟磺醯)苯甲酸、3_(氟磺醯)苯甲酸、2-氨基苯磺醯氟、3-氨基苯磺醯氟、4-氨基苯磺醯氟、2-硝基苯磺醯氟、3-硝基苯磺醯氟及4-硝基苯磺醯氟組成的組中的I種以上的化合物。
[0022](3)在前述(I)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑優選為選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的I種以上的化合物。
[0023](4)在前述(I)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑優選為選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的2種以上。
[0024](5)在前述(I)~(4)的任一項的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，優選按照PMSF的最終濃度為ImM以上、AEBSF的最終濃度為4mM以上、或p-APMSF的最終濃度為2mM以上的方式，在所述生物試樣中添加PMSF、AEBSF或p-APMSF。
[0025](6)在前述(I)~(5)的任一項的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，優選在所述生物試樣中進而添加至少I種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑。[0026](7)在前述(6)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有磺醯基的蛋白酶抑制劑優選為胺基酸氯甲基酮類。
[0027](8)在前述(6)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有磺醯基的蛋白酶抑制劑優選為選自由TLCK及TPCK組成的組中的I種以上。
[0028](9)在前述(6)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有磺醯基的蛋白酶抑制劑優選為TLCK。
[0029](10)在前述(I)~(9)的任一項的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中，所述生物試樣優選為胰液或十二指腸液。
[0030](I I)本發明的第二方式是含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑，其是具有氟磺醯基的化合物，具有蛋白酶抑制活性且為了抑制該生物試樣中的蛋白酶而被添加在含有胰液成分的生物試樣中。
[0031](12)前述(11)的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑優選為選自由PMSF、AEBSF, p-APMSF、4-(氟磺醯)苯甲酸、3_(氟磺醯)苯甲酸、2-氨基苯磺醯氟、3-氨基苯磺醯氟、4-氨基苯磺醯氟、2-硝基苯磺醯氟、3-硝基苯磺醯氟及4-硝基苯磺醯氟組成的組中的化合物。
[0032](13)前述(11)的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑優選為選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的化合物。
[0033](14)本發明的第三方式是蛋白酶抑制劑混合物，其含有至少I種以上的前述
(11)~(13)中任一項的生物試樣用蛋白酶抑制劑。
[0034](15)前述(14)的蛋白酶抑制劑混合物進而優選為含有至少I種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑。
[0035](16)本發明的第四方式是含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒，其含有至少I種以上的具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑，被用於保存含有胰液成分的生物試樣。
[0036](17)前述(16)的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒，進而優選為含有至少I種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑。
[0037](18)前述(16)或(17)的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒，進而優選含有具有用於儲存所採集的體液的儲存部的保存用容器，並且在所述儲存部預先包含所述具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑。
[0038]發明的效果
[0039]本發明的第二方式的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑及本發明的第三方式的蛋白酶抑制劑混合物能夠非常有效地抑制胰液、十二指腸等含有胰液成分的生物試樣中含有的蛋白酶。因此，使用該蛋白酶抑制劑的本發明的第一方式的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，可以有效抑制含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的活性。因此，通過該抑制方法，可以抑制來自胰液的成分的分解等，可以穩定地保存含有胰液成分的生物試樣。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1是表示PMSF、AEBSF及p-APMSF的化學式的圖。
[0041]圖2是表示在實施例1中由各胰酶溶液測定的螢光量的圖。[0042]圖3是表示在實施例2中各試樣溶液的S100P的測定結果的圖。
[0043]圖4是表示在實施例3中由各試樣溶液測定的螢光量的圖。
[0044]圖5是表示在實施例4中由各試樣溶液測定的螢光量的圖。
[0045]圖6是表示在實施例5中由各試樣溶液測定的螢光量的圖。
[0046]圖7是表示在實施例5中由各試樣溶液測定的螢光量的圖。
[0047]圖8是表示在實施例6中各試樣溶液的蛋白酶活性(相對值:%)的結果的圖。
[0048]圖9是表示在實施例7中添加了 PMSF的各試樣溶液的蛋白酶活性(相對值:%)的結果的圖。
[0049]圖10是表示在實施例7中添加了 AEBSF的各試樣溶液的蛋白酶活性(相對值:%)的結果的圖。
[0050]圖11是表示在實施例7中添加了 P-APMSF各的試樣溶液的蛋白酶活性(相對值:%)的結果的圖。
[0051]圖12是表示在實施例8中由添加了 I種蛋白酶抑制劑的各試樣溶液測定的螢光量的圖。
[0052]圖13是表示在實施例8中由添加了 2種蛋白酶抑制劑的各試樣溶液測定的螢光量的圖。
[0053]圖14是表示在實施例9中由添加了各種蛋白酶抑制劑的各試樣溶液測定的螢光量的圖。
【具體實施方式】
[0054]胰液是指從胰管排出的體液。在本發明及本申請說明書中，所謂的含有胰液成分的生物試樣是指含有包含來自胰液的成分的體液的試樣。作為含有來自胰液的成分的體液，可以列舉通過導管直接從胰腺採集到的胰液、在十二指腸採集到的液體(十二指腸液)等。在十二指腸液中，除了含有胰液，還含有同樣地從乳頭部排出的膽汁、原本就存在於十二指腸的液體、血液等。關於胰液、十二指腸液，可以通過常用方法進行採集。
[0055]
[0056]本發明的第二方式的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑(以下，有時稱作「本發明的蛋白酶抑制劑」)，其特徵在於，其是具有氟磺醯基的化合物，具有蛋白酶抑制活性且為了抑制該生物試樣中的蛋白酶而被添加到含有胰液成分的生物試樣中。
[0057]本發明的蛋白酶抑制劑只要是具有氟磺醯基且具有蛋白酶抑制活性的化合物就沒有特別的限制，但是優選具有氟磺醯基直接或通過碳原子數為I~6的烴基鍵合在苯環上的結構的化合物，優選為PMSF (苯甲基磺醯氟)，AEBSF (4- (2-氨乙基)-苯磺醯氟))，P-APMSF (對脒基苯基甲磺醯氟鹽酸鹽)，4-(氟磺醯)苯甲酸(CAS號:455-26-5)、3-(氟磺醯)苯甲酸(CAS號:454-95-5)、2_氨基苯磺醯氟(CAS號:392_86-9)、3_氨基苯磺醯氟(CAS號:368-50-3)、4_氨基苯磺醯氟(CAS號:98-62_4)、2-硝基苯磺醯氟(CAS號:433-98-7)、3-硝基苯磺醯氟(CAS號:349-78-0)或4-硝基苯磺醯氟(CAS號:349_96_2)，更優選為PMSF、AEBSF或p-APMSF。PMSF、AEBSF及p-APMSF的化學式如圖1所示。圖1中被虛線包圍的官能團是氟磺醯基。
[0058]本發明的蛋白酶抑制劑也可以作為由多種蛋白酶抑制劑組成的混合物中的有效成分之一。作為蛋白酶抑制劑混合物，可以是僅由本發明的蛋白酶抑制劑組成的物質，也可以是I種或2種以上的本發明的蛋白酶抑制劑與其他的蛋白酶抑制劑的混合物。作為其他的蛋白酶抑制劑，只要是不損害本發明的蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制活性的物質就沒有特別的限制，可以列舉例如抑肽酶、亮抑酶肽、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制劑、彈性酶抑制劑(elastatinal)、抗凝血酶等肽系蛋白酶抑制劑，EDTA等螯合劑,彈性蛋白酶酶抑制劑(Elastase Inhibitor), TLCK, TPCK,膜蛋白酶抑制劑，Ecotin, E.coli 等。此外，也可以使用甲磺酸加貝酯(FOY)、甲磺酸卡莫司他(Foipan)、甲磺酸萘莫司他(Futhan)、烏司他丁等胰腺炎治療藥。
[0059]作為與本發明的蛋白酶抑制劑組合使用的其他蛋白酶抑制劑，優選至少一種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑，更優選為胺基酸氯甲基酮類。作為該胺基酸氯甲基酮類，只要是具有蛋白酶抑制活性的物質就沒有特別的限制，可以列舉TLCK (N-a-甲苯磺醯-L-賴氨醯氯甲基酮)、TPCK (N-a-甲苯磺醯-L-苯丙氨酸氯甲基酮)等。在本發明中，特別優選選自由TLCK及TPCK組成的組中的I種以上物質，更優選為TLCK。
[0060]作為包含以本發明的蛋白酶抑制劑為首的多種蛋白酶抑制劑的混合物，優選含有2種以上的本發明的蛋白酶抑制劑，更優選含有2種以上的本發明的蛋白酶抑制劑和至少I種具有磺醯基的蛋白酶抑制劑，進而優選含有2種以上的本發明的蛋白酶抑制劑和至少I種具有蛋白酶抑制活性的胺基酸氯甲基酮類，特別優選含有選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的2種以上和選自由TLCK及TPCK組成的組中的I種以上。
[0061]
[0062]本發明的第一方式的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法(以下，有時稱作「本發明的蛋白酶抑制方法」)，其特徵在於，通過在含有胰液成分的生物試樣中添加至少I種以上的具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑(即、本發明的蛋白酶抑制劑)，抑制該生物試樣中的蛋白酶的酶活性。本發明的蛋白酶抑制劑與其他的蛋白酶抑制劑相比，對胰液、十二指腸液中含有的蛋白酶的抑制活性非常高。因此，通過在含有胰液成分的生物試樣中添加本發明的蛋白酶抑制劑，能夠簡便且`有效地抑制該生物試樣中的來自胰液、十二指腸液的蛋白酶引起的胰液成分的分解。
[0063]供於本發明的蛋白酶抑制方法的含有胰液成分的生物試樣，只要是含有包含來自胰液的成分的體液的試樣就可以。例如，可以是僅由含有來自胰液成分的體液組成的物質，也可以是以適當緩衝液等對該體液進行稀釋後的液體，也可以是在該體液或其稀釋液中添加了各種添加劑的物質。作為添加劑，可以列舉表面活性劑、核酸酶抑制劑、pH調整劑、pH指示劑等。作為供於本發明的蛋白酶抑制方法的含有胰液成分的生物試樣，優選為含有胰液、十二指腸液的試樣。具體而言，可以列舉胰液、十二指腸液、胰液或十二指腸液的稀釋液、或在這些液體中添加了前述各種添加劑的液體等。
[0064]在本發明的蛋白酶抑制方法中，可以在從生物體採集後被保存等的含有胰液成分的生物試樣中添加本發明的蛋白酶抑制劑，但是優選從生物體採集含有胰液成分的體液時到添加本發明的蛋白酶抑制劑時的間隔短，特別優選在剛從生物體採集後的胰液或十二指腸液中添加本發明的蛋白酶抑制劑。
[0065]作為胰液中含有的蛋白酶，有絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、羧肽酶等各種物質。因此，在此前被用於胰液等的蛋白酶抑制劑中，僅僅添加I種的場合得到的蛋白酶抑制效果非常有限，即使將多種蛋白酶抑制劑進行組合的場合也沒有得到充分的蛋白酶抑制效果的報告。與此相反，作為本發明的蛋白酶抑制劑，即使僅使用I種的場合，通過適當地調整添加量也能得到充分的蛋白酶抑制效果。
[0066]在本發明的蛋白酶抑制方法中使用的本發明的蛋白酶抑制劑，即使只有I種也能充分發揮蛋白酶抑制活性，但是優選將2種以上進行組合使用。此外，也可以與本發明的蛋白酶抑制劑組合使用I種或2種以上的其他蛋白酶抑制劑。作為本發明的蛋白酶抑制方法中使用的本發明的蛋白酶抑制劑，優選至少含有選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的一種以上物質，更優選組合含有選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的2種以上。由於胰液中含有活性不同的各種蛋白酶，因此通過混合使用多種蛋白酶抑制劑，可以期待更有效地抑制生物試樣中的蛋白酶活性。進而，可以期待與單獨使用的場合相比，以低濃度組合來抑制蛋白酶活性。
[0067]被添加到含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶抑制劑的量，只要是通過該蛋白酶抑制劑能夠發揮蛋白酶抑制效果的量就沒有特別的限制，可以考慮含有胰液成分的生物試樣的種類、使用的蛋白酶抑制劑的種類等，進行適當地調整。例如，在含有胰液成分的生物試樣中，作為蛋白酶抑制劑僅添加PMSF的場合，可以按照最終濃度為ImM以上，優選為5mM以上，更優選為IOmM以上的方式進行添加。此外，作為蛋白酶抑制劑僅使用AEBSF的場合，可以按照最終濃度為4mM以上，優選為IOmM以上，更優選為20mM以上的方式在含有胰液成分的生物試樣中添加AEBSF。作為蛋白酶抑制劑僅使用p-APMSF的場合，可以按照最終濃度為2mM以上，優選為5mM以上，更優選為IOmM以上的方式在含有胰液成分的生物試樣中添加 p-APMSF。
[0068]此外，作為與至少一種以上的具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑(本發明的蛋白酶抑制劑)組合使用的其 他蛋白酶抑制劑僅添加TLCK的場合，可以按照最終濃度為0.1mM以上、優選為ImM以上、更優選為5mM以上、進而優選為IOmM以上的方式進行添加。此外，作為該其他蛋白酶抑制劑僅添加TPCK的場合，可以按照最終濃度為0.1mM以上，優選為ImM以上，更優選為5mM以上，進而優選為IOmM以上的方式進行添加。
[0069]在本發明的蛋白酶抑制方法中，被添加到含有胰液成分的生物試樣中的本發明的蛋白酶抑制劑及其他蛋白酶抑制劑，可以是粉末狀、顆粒狀等的固體狀，也可以是使其溶解到合適的緩衝液等中的蛋白酶抑制劑溶液。此外，本發明的蛋白酶抑制劑和其他蛋白酶抑制劑，可以同時添加到含有胰液成分的生物試樣中，也可以先添加其中之一，然後再添加其他的。從能夠對生物試樣中的蛋白酶充分發揮抑制效果的觀點出發，優選將具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑和前述其他蛋白酶抑制劑同時進行添加。
[0070]通過在含有胰液成分的生物試樣中添加本發明的蛋白酶抑制劑，由於該生物試樣中含有的蛋白酶的活性被有效地抑制，因此可以顯著抑制該生物試樣中含有的胰液成分的分解/變性等。因此，作為蛋白酶被本發明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物試樣，對來自胰液成分的生物體成分可以更穩定地保存。此外，通過對蛋白酶被本發明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物試樣進行胰液成分解析，可以提高解析精度，得到可靠性高的結果。
[0071 ] 作為蛋白酶被本發明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物試樣，可以與其他生物試樣一樣，作為用於各種檢查的測定試樣。作為檢查對象的物質，只要是預期胰液或十二指腸液中含有的生物體成分就沒有特別的限制，可以是蛋白質，也可以是DNA、RNA等核酸，還可以是細胞。例如，該生物試樣可以在應用ELISA、免疫層析、雙向電泳、免疫印跡法、質譜分析法等的各種蛋白質分析中和在應用PCR、RT-PCR、用探針的雜交等的各種核酸解析中，在細胞計數、細胞診斷這樣的細胞解析等中使用。
[0072]
[0073]本發明的第四方式的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒(以下，有時稱作「本發明的保存用試劑盒」)，含有至少一種以上的具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑(即、本發明的蛋白酶抑制劑)，被用於保存含有胰液成分的生物試樣。通過使用該試劑盒，可以更簡便地抑制含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶。本發明的保存用試劑盒中含有的本發明的蛋白酶抑制劑，可以只是一種，也可以是2種以上的組合。此外，作為該試劑盒，進而優選含有至少I種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑，更優選含有至少一種以上的具有蛋白酶抑制活性的胺基酸氯甲基酮類。
[0074]此外，作為本發明的保存用試劑盒中含有的本發明的蛋白酶抑制劑，可以是冷凍乾燥粉末，也可以是將冷凍乾燥粉末與合適的賦形劑等一起成型的片劑或顆粒劑等，也可以是使其溶解到適當的緩衝液中的蛋白酶抑制劑溶液。
[0075]本發明的保存用試劑盒，進而，也可以含有用於將採集到的體液進行稀釋的緩衝液、其他蛋白酶抑制劑、表面活性劑、PH調整劑、pH指示劑等。作為表面活性劑、pH調整劑、PH指示劑等各種添加劑，可以使其預先溶解到稀釋用的緩衝液中。
[0076]另外，作為本發明的保存用試劑盒，也可以含有能夠與該容器的開口部結合的蓋子，所述蓋子能夠從填充 有該含有胰液成分的試樣的容器中滴加一定量的所調製的含有胰液成分的試樣(在含有胰液成分的生物試樣中添加本發明的保存用試劑盒中所含有的各種蛋白酶抑制劑，並根據需要添加其他成分而成的試樣)。
[0077]作為本發明的保存用試劑盒，進而，也可以含有具備用於儲存採集自生物體的胰液或十二指腸液等的體液的儲存部的保存用容器。這種場合，本發明的蛋白酶抑制劑及其他蛋白酶抑制劑優選預先包含在該儲存部。在該保存用容器上刻有刻度的場合，可以對被添加到該保存容器的生物試樣的量(在該保存容器內預先填充蛋白酶抑制劑的場合，生物試樣和蛋白酶抑制劑的總量)進行目視確認，甚至可以一眼了解蛋白酶抑制劑的最終濃度。
[0078]此外，含有胰液成分的生物試樣，一般經內窺鏡進行採集。因此，作為本發明的保存用試劑盒的組成品，也包含經內窺鏡採集含有胰液成分的生物試樣的採集器具。作為該採集器具，例如包括:在可以插入到內窺鏡裝置的導管上組裝了注射器的器具、前端配置有可以插入到內窺鏡裝置的吸收體的探針等。作為可以插入到內窺鏡裝置的導管，可以列舉例如:日本特開2011-5009號公報記載的標本採集管等。作為這些採集器具，優選具有預先分注了前述蛋白酶抑制劑的儲存部。
[0079][實施例]
[0080]接下來示出實施例等對本發明進行更詳細的說明，但是本發明不限於以下的實施例。
[0081][實施例1]
[0082]為了調查對胰液而言效果最好的蛋白酶抑制劑，從市售的8種蛋白酶抑制劑混合物中搜索對胰液的抑制效果最好的蛋白酶抑制劑混合物。使用的蛋白酶抑制劑混合物為:complete (Roche 公司產品)(抑制劑混合物 I)、Halt Pr otease Inhibitor Cocktail(Thermo 公司產品)(抑制劑混合物 2)、Protease In hibitor Cocktail (SIGMA 公司產品)(抑制劑混合物3)、Protease Inhibitor Mix (GE公司產品)(抑制劑混合物4)、ProteaseInhibitor Cocktail set I (M ERCK 公司產品)(抑制劑混合物 5)、Protease InhibitorCocktail set IKME RCK公司產品)(抑制劑混合物6)、Protease Inhibitor Cocktail setIII (ME RCK 公司產品)(抑制劑混合物 7)、及 Protease Inhibitor Cocktail (BioVision公司產品)(抑制劑混合物8)。
[0083]使用胰酶以活化狀態存在的、由豬胰腺製得的作為消化酶劑的「胰酶」作為模擬人工胰液，按照最終濃度為製造方的推薦濃度(IX)或推薦濃度的5倍濃度(5X)的方式添加各種蛋白酶抑制劑混合物後，測定了蛋白酶的活性。關於蛋白酶活性，使用EnzCheckProtease Assay Kits (Molecular Probes公司產品)進行測定。具體而言，在添加了各種蛋白酶抑制劑混合物的胰液溶液中添加試劑盒中附帶的螢光標識過的酪蛋白，在37°C下孵育2小時後，以Ex/Em = 485/535nm的螢光波長測定螢光量。此外，作為對照，對在胰酶中直接添加進行過螢光標識的酪蛋白的試樣溶液(無抑制劑、無DMS0)、在胰酶中按照達到與使各種蛋白酶抑制劑混合物為製造方推薦濃度(IX)而添加的場合同樣的DMSO添加量的方式添加DMSO的試樣溶液(無抑制劑、DMS01X)，及在胰酶中按照達到與使各種蛋白酶抑制劑混合物為製造方推薦濃度(5X )而添加的場合同樣的DMSO添加量的方式添加DMSO的試樣溶液(無抑制劑、DMS05X)，同樣地測定了蛋白酶活性。
[0084]各種胰酶溶液的螢光量的測定結果如圖2所示。縱軸的螢光量表示分解的酪蛋白的量，將該值粗略算作蛋白酶活性的值。根據這些結果，發現抑制劑混合物4 (GE公司的Protease Inhibitor Mix)的抑制效果最好。
[0085][實施例2]
[0086]關於通過抑制蛋白酶活性對胰液中的蛋白質的保存穩定性產生怎樣的影響進行了研究。調查了在混合有通常存在於胰液中的SlOOP(鈣結合蛋白)和胰酶(模擬胰液)的溶液中，SlOOP在添加蛋白酶抑制劑的場合和無添加的場合能夠以怎樣的程度被保存。
[0087]具體而言，首先調製25ng/mL的SlOOP (標準品)溶液(試樣溶液I)、含有25ng/mL的SlOOP (標準品)及lmg/mL的胰酶的溶液(試樣溶液2)、含有25ng/mL的SlOOP (標準品)及lmg/mL的胰酶並且含有推薦濃度的2倍濃度(2X )的Protease Inhibitor Mix (GE公司產品)的溶液(試樣溶液3)、含有25ng/mL的SlOOP (標準品)及lmg/mL的胰酶並且含有推薦濃度的5倍濃度(5X )的complete (Roche公司產品)的溶液(試樣溶液4)。各種試樣溶液應用Circu Lex SlOOP ELISA Kit (Cyclex公司產品、目錄編號:CY_8060)附帶的緩衝液進行調製。通過將這些試樣溶液在25°C下進行16小時的孵育使其反應。然後，對使用Circu Lex SlOOP ELISA Kit (Cyclex公司產品、目錄編號:CY_8060)附帶的緩衝液將各試樣溶液進行10倍稀釋而成的稀釋液，使用CircuLex SlOOP ELISA Kit檢測S100P。
[0088]各試樣溶液中的SlOOP的測定結果如圖3所示。結果，與未添加蛋白酶抑制劑混合物的試樣溶液2相比，添加了蛋白酶抑制劑混合物的試樣溶液3及4殘留的S100P的量多。此外，添加了比試樣溶液3中添加的蛋白酶抑制劑混合物具有更高蛋白酶抑制活性的蛋白酶抑制劑混合物(參照實施例1。)的試樣溶液4，其殘留的S100P的量比試樣溶液3更多。根據這些結果可知，通過在胰液中添加蛋白酶抑制劑，可以抑制胰液中的蛋白質的分解，更穩定地進行保存。此外，這也暗示蛋白酶活性與SlOOP的檢測濃度存在相關性。
[0089][實施例3]
[0090]研究了實施例1中的蛋白酶抑制活性最高的抑制劑混合物中含有的各種蛋白酶抑制劑中，對於胰液的蛋白酶而言哪種蛋白酶抑制劑具有最高的抑制活性。
[0091]Protease Inhibitor Mix(GE公司產品)中含有的絲氨酸蛋白酶抑制劑有抑肽酶、亮抑酶肽、PMSF, AEBSF4種(濃度非公開)。因此，按照使最終濃度為各蛋白酶抑制劑單劑的推薦最大濃度的方式進行調製，對4種抑制劑的組合共15種，與實施例1同樣地使用胰酶及2種胰液被檢體對蛋白酶活性進行測定。各試樣溶液中添加的蛋白酶抑制劑如表1所示。另外，推薦最大濃度如下:抑肽酶(Roche公司產品)為0.3 μ M、亮抑酶肽(Roche公司產品)為50yM、PMSF (Roche公司產品)為lmM、AEBSF (Roche公司產品)為4mM。此外，同樣地對未添加蛋白酶抑制劑的試樣溶液(對照試樣溶液I)、含有推薦濃度的抑制劑混合物I(Roche公司的complete)的試樣溶液(對照試樣溶液2)、含有推薦濃度的5倍濃度(5X )的抑制劑混合物I的試樣溶液(對照試樣溶液3)、含有推薦濃度的抑制劑混合物4 (GE公司產品Protease Inhibitor Mix)的試樣溶液(對照試樣溶液4)及含有推薦濃度的5倍濃度(5X )的抑制劑混合物4的試樣溶液(對照試樣溶液5)的蛋白酶活性進行測定。
[0092]表1
[0093]
【權利要求】
1.一種含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，其通過在含有胰液成分的生物試樣中添加至少I種以上的具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑，從而對該生物試樣中的蛋白酶的酶活性進行抑制。
2.根據權利要求1所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，所述具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑為選自由PMSF、AEBSF, p_APMSF、4_(氟磺醯)苯甲酸、3-(氟磺醯)苯甲酸、2-氨基苯磺醯氟、3-氨基苯磺醯氟、4-氨基苯磺醯氟、2-硝基苯磺醯氟、3-硝基苯磺醯氟及4-硝基苯磺醯氟組成的組中的I種以上。
3.根據權利要求1所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，所述具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑為選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的I種以上。
4.根據權利要求1所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，所述具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑為選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的2種以上。
5.根據權利要求1~4的任一項所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，按照PMSF的最終濃度為ImM以上、AEBSF的最終濃度為4mM以上、或p-APMSF的最終濃度為2mM以上的方式，在所述生物試樣中添加PMSF、AEBSF或p-APMSF。
6.根據權利要求1~5的任一項所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，在所述生物試樣中進而添加至少I種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑。
7.根據權利要求6所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，所述具有磺醯基的蛋白酶抑制劑為胺基酸氯甲基酮類。
8.根據權利要求6所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，所述具有磺醯基的蛋白酶抑制劑為選自由TLCK及TPCK組成的組中的I種以上。
9.根據權利要求6所述的含有胰液`成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，所述具有磺醯基的蛋白酶抑制劑為TLCK。
10.根據權利要求1~9的任一項所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法，所述生物試樣為胰液或十二指腸液。
11.一種含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑，其是具有氟磺醯基的化合物，具有蛋白酶抑制活性且為了抑制該生物試樣中的蛋白酶而被添加在含有胰液成分的生物試樣中。
12.根據權利要求11所述的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑，其是選自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟磺醯)苯甲酸、3-(氟磺醯)苯甲酸、2-氨基苯磺醯氟、3-氨基苯磺醯氟、4-氨基苯磺醯氟、2-硝基苯磺醯氟、3-硝基苯磺醯氟及4-硝基苯磺醯氟組成的組中的化合物。
13.根據權利要求11所述的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑，其是選自由PMSF, AEBSF及p-APMSF組成的組中的化合物。
14.一種蛋白酶抑制劑混合物，其含有至少I種以上的權利要求11~13中任一項所述生物試樣用蛋白酶抑制劑。
15.根據權利要求14所述的蛋白酶抑制劑混合物，其進而含有至少I種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑。
16.一種含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒，其含有至少I種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑，被用於保存含有胰液成分的生物試樣。
17.根據權利要求16所述的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒，其進而含有至少I種以上的具有磺醯基的蛋白酶抑制劑。
18.根據權利要求16或17所述的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒，其進而含有具備用於儲存所採集的 體液的儲存部的保存用容器， 在所述儲存部預先包含所述具有氟磺醯基的蛋白酶抑制劑。
【文檔編號】C07C309/88GK103781904SQ201280043967
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年6月22日 優先權日:2011年9月13日
【發明者】片岡理惠, 中田真理, 守屋奈緒 申請人:奧林巴斯株式會社