經由β-丙內酯處理的殘留細胞DNA水平降低的細胞衍生病毒疫苗的製作方法
2023-05-29 19:50:26 1
經由β-丙內酯處理的殘留細胞DNA水平降低的細胞衍生病毒疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明涉及用於治療或預防病毒感染的疫苗產品。本發明還提供減少與細胞培養物疫苗製備有關的汙染物的方法。用DNA烷基化劑，例如β-丙內酯(BPL)處理使殘留的功能細胞培養物DNA降解，從而提供了含有免疫原性蛋白並且基本上不含殘留的功能細胞培養物DNA的疫苗，所述蛋白衍生自用細胞培養物繁殖的病毒。
【專利說明】經由（3-丙內酯處理的殘留細胞DNA水平降低的細胞衍生 病毒疫苗
[0001] 本申請是2006. 11.01提交的CN 200680046034. 8,題為"經由0-丙內酯處理的 殘留細胞DNA水平降低的細胞衍生病毒疫苗"的分案申請。
[0002] 本文引用的所有文件和在線信息通過引用方式全文納入。
【技術領域】
[0003] 本發明提供雜質減少的改良細胞培養產物和方法。具體地說，本發明提供一種改 良方法以使會與細胞培養物產生的產物維持結合的任何殘留功能細胞培養物DNA降解。按 照本發明，用DNA烷基化劑，例如0 -丙內酯（BPL)處理以使殘留的功能細胞培養物DNA降 解。可採用該方法處理包括疫苗和重組蛋白在內的各種細胞培養產物。
【背景技術】
[0004] 商業生產病毒疫苗通常需要大量病毒作為抗原來源。可以在細胞培養系統中培養 和複製種子病毒（seed virus)以獲得疫苗生產所用的商業數量的病毒。適用於病毒複製 的細胞培養系統包括哺乳動物細胞、鳥類細胞或昆蟲細胞，但對於病毒疫苗特別優選哺乳 動物細胞培養系統，從而確保病毒抗原蛋白質能正確糖基化和摺疊。出於相似的原因，重組 蛋白質表達也同樣優選哺乳動物細胞培養系統。
[0005] 如果未修飾細胞培養物的天然狀態，其複製能力有限，因而對產生商業疫苗或重 組蛋白質所需數量的材料而言行不通且無效。因此，出於生產目的，優選將細胞修飾成"連 續"或"無限增殖"的細胞系，從而增加它們能分裂的次數。許多這種修飾所用的機制類似 於致癌細胞所涉及的那些機制。因此，關注的是應該除去在這些系統中產生的疫苗或重組 蛋白產物的最終製劑中細胞培養過程的任何殘留物質，例如宿主細胞DNA。
[0006] 除去殘留宿主細胞DNA的標準方法是採用DNA酶處理。歐洲專利0870508和 美國專利5948410披露了這種類型的常規方法，其涉及兩步處理，首先用DNA酶（例如， Benzonase)，然後用陽離子洗絛劑（例如，CTAB)。
[0007] 目前降低該風險的努力集中在減少殘留宿主細胞DNA的總濃度。本發明的目的是 通過消除任何殘留宿主細胞DNA的功能而進一步降低風險。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明提供雜質減少的改良細胞培養產物和方法。具體地說，本發明提供一種改 良方法以使能與細胞培養物產生的產物維持結合的任何殘留功能細胞培養物DNA降解。按 照本發明，用DNA烷基化劑，例如0 -丙內酯（BPL)處理以使殘留的功能細胞培養物DNA降 解。可採用該方法處理包括疫苗和重組蛋白在內的各種細胞培養產物。
[0010] 本發明包括一種疫苗，其包含衍生自用細胞培養物增殖的病毒的免疫原性蛋白， 其中所述疫苗基本上不含殘留的功能細胞培養物DNA。此外，本發明涉及在細胞培養物中表 達的重組蛋白，最終重組蛋白製劑基本上不含殘留的功能細胞培養物DNA。
[0011] 可用烷基化劑處理來消除任何殘留宿主細胞DNA的功能，所述烷基化劑能將要轉 移入人受者染色體中，或者為受者DNA複製機制所識別的DNA切割成足夠小的部分，因而其 不能編碼功能蛋白。降解的殘留細胞培養物DNA的長度優選短於500個鹼基對。降解的殘 留細胞培養物DNA的長度更優選短於200個鹼基對。
[0012] 發明詳述
[0013] 本發明提供雜質減少的改良細胞培養產物和方法。具體地說，本發明提供一種改 良方法以使與細胞培養物產生的產物維持結合的任何殘留功能細胞培養物DNA降解。按照 本發明，用DNA烷基化劑，例如0-丙內酯（BPL)處理以使殘留的功能細胞培養物DNA降解。 可採用該方法處理包括疫苗和重組蛋白在內的各種細胞培養產物。
[0014] 本發明包括一種疫苗，其包含衍生自用細胞培養物增殖的病毒的免疫原性蛋白， 其中所述疫苗基本上不含殘留的功能細胞培養物DNA。此外，本發明涉及在細胞培養物中表 達的重組蛋白，最終重組蛋白製劑基本上不含殘留的功能細胞培養物DNA。
[0015] 可用烷基化劑處理來消除任何殘留宿主細胞DNA的功能，所述烷基化劑能將要轉 移入人受者染色體中，或者為受者DNA複製機制所識別的DNA切割成足夠小的部分，因而其 不能編碼功能蛋白。降解的（無功能的）殘留細胞培養物DNA的長度優選短於1000個鹼 基對（例如，短於 1000、800、700、600、500、400、300、200、150、100、75 或 50 個鹼基對）。降 解的殘留細胞培養物DNA的長度優選短於500個鹼基對。降解的殘留細胞培養物DNA的長 度更優選短於200個鹼基對。
[0016] 本文所用的"功能DNA"或"功能RNA"表示能翻譯成功能蛋白質或轉移入哺乳動 物染色體中的核苷酸序列。通常，能翻譯成功能蛋白質的核苷酸序列需要啟動子區域、起始 密碼子、終止密碼子和功能蛋白質的內部編碼序列。如果DNA發生損傷，例如加入烷基化劑 所致，許多這些區域發生改變或遭破壞，從而不再進行翻譯或只進行到形成所需蛋白的寡 肽亞基。
[0017]"降解的殘留功能細胞培養物DNA"指不能翻譯成功能蛋白質或轉移入哺乳動物染 色體的功能DNA。"降解的殘留功能DNA"的長度優選短於1000個鹼基對，更優選短於500 個鹼基對，甚至更優選短於200個鹼基對，最優選短於100個鹼基對。可通過包括凝膠電泳 在內的標準技術測定降解的殘留功能DNA的長度。
[0018] 本發明提供基本上不含殘留的功能細胞培養物DNA的疫苗組合物和重組蛋白制 劑。本文所用的"基本上不含殘留的功能細胞培養物DNA"指某種組合物或製劑，其中每 0. 5ml檢測到短於200個鹼基對的殘留DNA片段少於10ng。可通過包括毛細管電泳與核酸 擴增技術在內的標準技術檢測任何殘留細胞培養物DNA的大小。
[0019] 本發明使用烷基化劑，例如BLP提供了減少凝聚作用和汙染物的額外益處。凝聚 物減少的疫苗製劑的免疫原性也增強。疫苗的免疫原性依賴於針對特定病毒表位的特異 性。如果蛋白質的表面與有害的分子結合或為之掩蓋或因凝聚作用而掩藏在大分子中，則 表位可能不易識別，因而在疫苗中的效率較低。此外，凝聚物減少的疫苗製劑可具有其它加 工益處。純化過程依賴於分離所需蛋白質，例如流感疫苗中的血凝素和神經氨酸酶。如果 蛋白質因存在凝聚物或交聯作用而在結構上得到修飾，它可能不能被識別，因此不能用柱 層析、過濾或離心除去。
[0020] 烷基化劑
[0021] 本發明所用的烷基化劑包括將烷基引入化合物的物質。烷基化劑優選單烷基化劑 (monoalkylating agent)，例如BPL。BPL是在許多疫苗的製備中廣泛用於滅活病毒的單燒 基化劑。BPL與包括核酸在內的各種生物分子反應，其中BPL通過烷化和脫嘌呤作用來修飾 結構。BPL通常如以下結構所示：
[0022]
【權利要求】
1. 一種流感疫苗，其包含衍生自用細胞培養物繁殖的流感病毒的免疫原性蛋白，其中 所述疫苗中殘留的細胞培養物DNA總量低於20ng/ml，降解的殘留細胞培養物DNA的長度短 於200個鹼基對。
2. 如權利要求1所述的疫苗，其特徵在於，用烷基化劑處理使任何殘留的細胞培養物 DNA降解。
3. 如權利要求2所述的疫苗，其特徵在於，所述烷基化劑對疫苗中的病毒滅活。
4. 如權利要求2或3所述的疫苗，其特徵在於，所述烷基化劑是0 -丙內酯（BPL)。
5. 如權利要求4所述的疫苗，其特徵在於，所述0-丙內酯（BPL)低於0.1%。
6. 如權利要求4所述的疫苗，其特徵在於，所述疫苗含有游離丙酸和BPL低於0. 01 %。
7. 如前任一權利要求所述的疫苗，其特徵在於，所述細胞培養物選自下組:MDCK細胞、 Vero細胞和PER. C. 6細胞。
8. 如前任一所述的疫苗，其特徵在於，還包含水包油乳液佐劑。
9. 如權利要求8所述的疫苗，其特徵在於，所述乳液中油滴的直徑是亞微米的。
10. 如權利要求9所述的疫苗，其特徵在於，所述水包油乳液佐劑包含角鯊烯、吐溫80 和司盤85。
11. 如權利要求8或9所述的疫苗，其特徵在於，所述水包油乳液佐劑包含角鯊烯、生育 酚和吐溫80。
12. 如前任一權利要求所述的疫苗，其特徵在於，所述疫苗包含裂解病毒顆粒或純化的 病毒蛋白形式。
13. 如前任一權利要求所述的疫苗，其特徵在於，任何殘留細胞培養物DNA的大小通過 毛細管電泳檢測。
14. 如前任一權利要求所述的疫苗，其特徵在於，所述疫苗是三價疫苗。
15. 如權利要求1-13任一所述的疫苗，其特徵在於，所述疫苗包含來自一種流感病毒 株的抗原。
16. 如前任一權利要求所述的疫苗，其特徵在於，所述疫苗含有少於5 y g/ml汞物質。
17. -種流感疫苗，其包含衍生自用細胞培養物繁殖的流感病毒的免疫原性蛋白，其中 所述疫苗用包含以下步驟的方法製備： (i) 用0 -丙內酯純化病毒顆粒，使殘留的功能細胞培養物DNA降解，以滅活病毒； (ii) 利用破裂濃度的溴化十六烷基三甲銨使完整病毒破裂或破碎；和 (iii) 分離該免疫原性蛋白。
【文檔編號】A61K39/145GK104474543SQ201410631136
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2006年11月1日 優先權日:2005年11月1日
【發明者】J·-P·格雷格森, H·科斯特 申請人:諾華疫苗和診斷有限兩合公司