一種穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法

2023-05-30 03:11:26 3

專利名稱：一種穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法
一種穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法技術領域一種穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法，屬於生物製品 的分離純化技術領域。本發明涉及一種以陽離子交換色譜和疏水色譜為主要技 術手段的穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法。
技術背景穀氨醯胺轉胺酶(Transglutaminase,簡稱TGase)是一種催化醯基轉移反 應的轉移酶，能催化蛋白質分子內、分子間發生交聯、蛋白質和胺基酸之間的 連接以及蛋白'質分子內穀氨醯胺基的水解反應，從而直接改變蛋白質本身以及 蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白質的營養價 值，生產出滿足人們需求的新型蛋白食品。現在己經廣泛應用在許多方面在 食品加工過程中，可以保護食品蛋白質中的賴氨酸避免發生化學反應，從而保 護限制性胺基酸，提高食品的營養價值；在肉製品加工中，谷氮酸胺轉胺酶的 交聯作用將一些低價值的碎肉進行重組，從而改善其外觀、結構、風味，以提 高其營養價值和市場價值；在水產品保鮮中，可通過形成可食性的薄膜，包埋 脂類物質；在乳製品加工中，提高蛋白質的營養性；在醫藥工業中，穀氨酸胺 轉胺酶包埋脂類或脂溶性物質，形成耐熱耐水性的膜；在非肉類的豆類食品中， 提高食品的彈性和持水能力；在紡織行業，還被用來提高蠶絲織物以及羊毛織 物的品質。 'Tgase發酵過程中以酶原(Pro-TGase)的形式分泌，Pro-TGase須經過穀氨醯 胺轉氨酶激活蛋白酶(TGase-activatingprotease)的切割活化，獲得成熟的具有 活性的TGase.而這一激活過程受一種分子量12kDa的蛋白質抑制，即穀氨醯胺 轉胺酶激活蛋白酶抑制因子。這一抑制因子對TGase活化過程起調控作用，但 具體的調控機制目前還不清楚。對穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子調控機 制的研究將極大的促進發酵生產TGase水平。穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制 因子的分離純化是對其調控機制研究的基礎，因此，採用簡單有效的方法對谷 氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子進行分離純化成為研究的熱點。 發明內容本發明的目的是提供一種穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化 方法，採用陽離子交換色譜和疏水色譜為主要技術手段，有效簡便的分離純化 吸水鏈黴菌所產穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子，使之達到電泳純，為進
行進一步的調控機制研究奠定基礎。本發明的技術方案 一種穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化 方法，工藝步驟為(1) 乙醇沉澱將吸水鏈黴菌(&re/ towyca /^groscc^cw) WSH03 — 13的發酵液離心去除 菌體後，加入乙醇至終濃度為70 %，緩慢攪拌使之完全溶解，並於fC靜置10-20 min， 10000 rpm冷凍離心15-30 min，收集蛋白沉澱，將沉澱復溶於適量pH 5.0 的HAc-NaAc緩衝液中，製成上樣液。發酵所用菌種吸水鏈黴菌(5^eptomyces/^gra"opz'c^) WSH03 — 13巳在中 國專利ZL03152956.9公開，授權公告號CN 1208452 C，授權公告日2005年6 月29日。(2) 陽離子交換色譜採用Fractogel EMD S03—陽離子交換柱以pH 5.0的HAc-NaAc緩衝液平衡， 將1個柱體積的上樣液以0.5-1 mL/min的速度加入陽離子交換色譜中，用pH 5.0 的含0-1M NaCl梯度的HAc-NaAc緩衝液以同樣的速度洗脫至280 nm紫外吸收 峰為0，穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的活性部分在梯度洗脫時的第一個 出峰，收集活性峰；(3) 疏水色譜陽離子交換柱上獲得的活性部分用pH 7.0的Tris-HCl緩衝液平衡過夜， Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱以10個柱體積含有10 %NaCl的pH 7.0的 Tris-HCl緩衝液平衡，將1個柱體積的上樣液以0.5-1 mL/min,的速度加入疏水色 譜中，用pH7.0的Tris-HCl緩衝液以同樣的速度洗脫至280 nm紫外吸收峰為0， 再以1個柱體積的去離子水洗脫，收集活性峰，即為所需要的電泳純穀氨醯胺 轉胺酶激活蛋白酶抑制因子溶液。本發明的有益效果(1) 分離工藝簡單，周期短。本分離純化工藝由酒精沉澱、陽離子交換色 譜和疏水色譜三部分組成，硫酸銨沉澱約為1 h，陽離子交換色譜約為3 h，疏 水色譜約為3h。(2) 作用條件溫和，見效快。穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子疏水性 很強，必須用沒有離子強度的去離子水才能將其洗脫，因此不用經過高鹽洗脫、 梯度洗脫等步驟，可以直接用pH 7.0的Tris-HCl緩衝液將所有雜蛋白去除，隨 後用去離子水洗脫，以減少操作時間。


圖1經乙醇沉澱初步分離的樣品使用陽離子交換柱的分離效果。 圖2經陽離子交換柱初步分離的樣品使用疏水柱的分離效果。
具體實施方式
以疏水色譜為主要手段對角質酶進行分離純化，其具體步驟如下 (1 )吸水鏈黴菌發酵生產含穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的發酵液以吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus) WSH03 — 13為出發菌株，將培養 至對數生長期的種子接入發酵培養基中，32。C培養30 h，得到含穀氨醯胺轉胺 酶激活蛋白酶抑制因子的發酵液。(2) 乙醇沉澱將發酵液離心去除菌體後，加入乙醇至終濃度為70%，並緩慢攪拌使之完 全溶解，並於4。C靜置10-20 min， 10000 rpm冷凍離心15-30 min，收集蛋白沉 澱，將沉澱復溶於適量pH5.0的HAc-NaAc緩衝液中，製成上樣液。(3) 陽離子交換色譜採用Fmctogel EMD SOr陽離子交換柱以pH 5.0的HAc-NaAc緩衝液平衡， 將1個柱體積的上樣液以0.5-1 mL/min的速度加入陽離子交換色譜中，用pH 5.0 的含0-1M NaCi梯度的HAc-NaAc緩衝液以同樣的速度洗脫至280 nm紫外吸收 峰為0，穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的活性部分存在於梯度洗脫時的第 一個出峰，收集活性峰，分離效果如圖l。(4) 疏水色譜陽離子柱獲得的活性部分用pH 7.0的Tris-HCl緩衝液平衡過夜。Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱以10個柱體積含有10 %NaCl的pH 7.0的Tris-HCl 緩衝液平衡，將1個柱體積的上樣液以0.5-1 mL/min的速度加入疏水色譜中， 用pH7.0的Tris-HCl緩衝液以同樣的速度洗脫至280nm紫外吸收峰為0，再以 1個柱體積的去離子水洗脫，收集活性峰，即為所製備的電泳純穀氨醯胺轉胺酶 激活蛋白酶抑制因子溶液，分離效果如圖2。
權利要求
1、 一種穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法，其特徵是工 藝歩驟為(1) 乙醇沉澱將吸水鏈黴菌(5^印tomycw /zygmycopz'cM) WSH03 — 13的發酵液離心去除 菌體後，加入乙醇至終濃度為70 %，緩慢攪拌使之完全溶解，並於fC靜置10-20 min， 10000rpm冷凍離心15-30min，收集蛋白沉澱，將沉澱復溶於適量pH 5.0 的HAc-NaAc緩衝液中，製成上樣液；(2) 陽離子交換色譜採用Fractogel EMD S03—陽離子交換柱以pH 5.0的HAc-NaAc緩衝液平衡， 將1個柱體積的上樣液以0.5-1 mL/min的速度加入陽離子交換色譜中，用pH 5.0 的含0-1M NaCl梯度的HAc-NaAc緩衝液以同樣的速度洗脫至280 nm紫外吸收 峰為0，穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的活性部分在梯度洗脫時的第一個 出峰，收集活性峰；(3) 疏水色譜陽離子交換柱上獲得的活性部分用pH 7.0的Tris-HCl緩衝液平衡過夜， Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱以10個柱體積含有10 %NaCl的pH 7.0的 Tris-HCl緩衝液平衡，將1個柱體積的上樣液以0.5-1 mL/min的速度加入疏水色 譜中，用pH 7.0的Tris-HCl緩衝液以同樣的速度洗脫至280 nm紫外吸收峰為0， 再以1個柱體積的去離子水洗脫，收集活性峰，即為所製備,的電泳純穀氨醯胺 轉胺酶激活蛋白酶抑制因子溶液。 '
全文摘要
一種穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法，屬於生物製品的分離純化技術領域。本發明採用吸水鏈黴菌為出發菌株，經液體深層發酵製備的穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子，在經過乙醇沉澱、陽離子交換色譜和疏水色譜之後，得到了電泳純的穀氨醯胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子溶液，可用於後續的蛋白質測序和性質研究。該方法步驟簡單，酶純度高，是一種簡便有效的酶分離純化方法。
文檔編號C07K1/36GK101121747SQ20071002372
公開日2008年2月13日 申請日期2007年7月6日 優先權日2007年7月6日
發明者敬 吳, 堵國成, 張東旭, 堅 陳 申請人:江南大學