一種利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法

2023-05-30 03:49:11

專利名稱：一種利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術育種領域，具體涉及一種利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法。
背景技術：
一品紅(Euphorbia pulcherrima willd),原產墨西哥和中美洲熱帶，為大戟科(Euphorbiaceae)大戟屬常綠、半常綠多年生直立灌木，其自然「花」期11月至翌年3月，恰逢冬季節日，主要觀賞部位頂端輪生的葉狀苞片碩大色豔，是歐美國家的傳統盆花之一。我國一品紅大規模商業化生產始於1998年，由於新優品種和先進栽培技術的引進，市場份額逐年增加，是近來來我國國慶、元旦、春節的重要消費花卉之一。目前國際上已有具有不同株型、苞片顏色、成熟期的數百個品種上市，而我國使用 的一品紅品種均由國外引進，尚處於起步階段的一品紅育種工作與世界一品紅育種存在巨大差距，亦與逐年擴大的一品紅消費市場形成鮮明反差。雜交是轉移優良性狀或基因，獲得植物新類型和選育有價值的新品種的有效方法之一。雜交亦是一品紅選育新品種的有效手段，目前國內通過雜交育種方法選育一品紅新品種僅現東莞市農業種子研究所報導黃子峰等通過改變一品紅自然花期，用『威望』和『金獎』雜交選育出一品紅新品種『紅荷』和『閃亮』。本課題組近年來亦在從事一品紅雜交育種工作的研究，雜交育種過程中發現在溫室溫度控制在25V以後，一品紅雌花比例仍然較少，雜交後胚後期發育不正常成為制約一品紅雜種獲得的主要因素。自1904年Ehanning用十字花科菔屬植物作為試材進行胚離體培養首獲成功後，幼胚拯救技術作為克服受精後胚胎敗育最有效的手段之一，已在小麥、油菜等大田作物以及果樹、蔬菜、花卉等園藝作物雜交育種領域廣泛應用，而在一品紅雜交育種中尚未見相關報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用受精後的幼胚離體拯救培養獲得一品紅雜交後代的方法，以提高一品紅雜交育種成功率，縮短一品紅雜交育種周期。為實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案—種利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法，其內容包括(I)胚珠剝取取一品紅雜交授粉後15 22d的子房，流水下衝洗5min，在無菌條件下，用體積比75%的乙醇浸泡lmin，再用質量百分比為O. I %升汞溶液中消毒lOmin，無菌水衝洗4 5次後用鑷子撕撥開子房壁，輕輕剝出胚珠；(2)誘導培養在無菌條件下，迅速將剝出的胚珠接種到MS+NAA O. 5mg/L+6_BA
O.5mg/L培養基，培養基pH 5. 6-5. 8、蔗糖60g/L、瓊脂6g/L，在溫度20 25°C、光周期10 12h/d、光照強度1500 20001uX下培養誘導胚芽萌發；(3)繼代、增殖與生根培養30 45d後轉入MS+NAA O. 05mg/L+6_BA O. lmg/L培養基中繼代培養，得到幼苗後切取莖段和頂芽轉入MS+NAA O. lmg/L+6-BA O. 5mg/L培養基中擴繁，待增殖數量達到目標數量時轉入1/2MS+NAA O. lmg/L培養基上生根。上述培養基pH 5. 6 5. 8、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L，培養條件同(2)；(4)移栽將根系發育良好的無菌苗在室內自然光下開瓶煉苗3 4d，鑷子夾取試管苗洗淨附著在表面的培養基，移栽到泥炭珍珠巖蛭石=I I I的穴盤中，置於溫室中保持90 95%相對溼度、20 25°C溫度培養，30d左右帶土上盆移栽，正常管理。對上述技術方案進行進一步闡述I、在本發明中所述的人工雜交授粉在晴天上午11:00 12:00進行，採集父本新鮮花粉，用毛筆輕輕授到母本呈倒「八」字狀的柱頭上；次日重複授粉一次；溫室環境溫度不低於25 °C，正常管理。 2、在本發明中所述的一品紅雜交父母本為通過遮光或者補光調節控制花期、花期保持一致的親本。3、在本發明中所述的父本花粉為當日父本柱頭散粉的新鮮花粉。本發明經過以下多項對比試驗，優選總結出上述最佳的技術參數I、幼胚的選擇試驗分別選擇雜交授粉後4、6、8、10、12、15、18、22d等不同發育時期的子房，無菌條件下，用體積比75%的乙醇浸泡lmin，再用質量百分比為O. 1%升汞溶液中消毒lOmin，無菌水衝洗4 5次後用鑷子撕撥開子房壁，輕輕剝出不同發育時期的胚珠後接種到誘導培養基MS+NAA O. 5mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖 60g/L+瓊脂 6g/L(pH 5. 6-5. 8)上培養，觀察統計胚珠誘導萌發情況。結果表明授粉後15、18、22d的胚珠可被誘導萌發。2、幼胚離體培養誘導培養基的選擇(I)NAA和6_BA 2激素濃度篩選以人工授粉後15d的一品紅雜交胚珠為材料，MS為基本培養基，NAA和6-BA分別設置O. 1,0. 5、I. Omg/L進行2因素3水平全面試驗，結果表明O. 5mg/L NAA與O. 5mg/L 6-BA組合為適宜的誘導培養基，30d後可誘導一品紅雜種胚萌發並生長。(2)蔗糖濃度的選擇以MS+NAA O. 5mg/L+6-BA O. 5mg/L為培養基，設置30、60、90g/L3個蔗糖濃度，接種15d雜種胚珠篩選適宜蔗糖濃度，結果表明添加60g/L的蔗糖可促進胚珠萌發。3、繼代、增殖與生根培養培養基成分選擇試驗:MS為基本培養基,統一添加鹿糖30g/L，設置pH5. 6 5. 8，分別進行試驗(I)和(2) : (I)繼代培養基篩選試驗以誘導萌發的幼胚為材料，分別接種到添加濃度為O. 05,0. 1,0. 5mg/L NAA和6-BA2因素3水平全面試驗的培養基中進行篩選，結果表明NAAO. 05mg/L+6-BA O. lmg/L為較合適的壯苗、繼代培養基；⑵增殖培養基篩選試驗分別設置NAA 0,0. 1,0. 5mg/L,6-BA O. I、O. 5、I. Omg/L 3個濃度進行2因素3水平全面試驗，得出NAA O. lmg/L,6-BA O. 5mg/L激素組合適宜增殖培養；⑶生根培養基篩選試驗基本培養基設MS、1/2MS兩個水平，NAA設置0、0. 1,0. 53個濃度進行全面試驗，結果表明1/2MS+NAA0. lmg/L為適宜的生根培養基。由上述本發明提供的技術方案可看出，本發明克服了一品紅雜交後胚發育後期敗育導致雜種獲得難的現象，可有效提高一品紅雜交育種成功率，並縮短一品紅雜交後代生長周期。
具體實施例方式為進一步了解本發明的發明內容及功效，茲例舉以下實施例，實施例中所使用的實驗方法若無特殊說明均為常規方法實施例一一品紅人工雜交授粉15d後的胚珠幼胚拯救方法I、人工雜交授粉選取確定一品紅雜交父母本，通過遮光或者補光調節控制花期、花期保持一致。授粉于晴天上午11:00 12:00進行，採集父本柱頭當日散粉的新鮮花粉，用毛筆輕輕授到母本呈倒「八」字狀的柱頭上；次日重複授粉一次。溫室環境溫度不低於25 °C，正常管理。2、雜種胚珠的剝取及誘導培養取一品紅雜交授粉後發育15d的子房，流水下衝洗5min,在無菌條件下,用體積比75%的乙醇浸泡lmin,再用質量百分比為O. 1%升萊溶液中消毒lOmin，無菌水衝洗4 5次後用鑷子撕撥開子房壁，輕輕剝出胚珠後迅速接種到MS+NAA O. 5mg/L+6-BA O. 5mg/L 培養基上培養，培養基 pH 5. 6-5. 8、蔗糖 60g/L、瓊脂 6g/L，在溫度20 25°C、光周期10 12h/d、光照強度1500 20001ux。培養誘導胚珠先生成愈傷組織後經愈傷組織萌發胚芽。
3、繼代、增殖與生根培養45d後轉入MS+NAA O. 05mg/L+6_BA O. lmg/L培養基中繼代培養，得到幼苗後切取莖段和頂芽轉入MS+NAA O. lmg/L+6-BA O. 5mg/L培養基中擴繁，待增殖數量達到目標數量時轉入1/2MS+NAA O. lmg/L培養基上生根。上述培養基pH5. 6 5. 8、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L，培養條件為溫度20 25°C、光周期10 12h/d、光照強度 1500 20001ux。4、移栽將根系發育良好的無菌苗在室內自然光下開瓶煉苗3 4d，鑷子夾取試管苗洗淨附著在表面的培養基，移栽到泥炭珍珠巖蛭石=I I I的穴盤中，置於溫室中保持90 95%相對溼度、20 25°C溫度培養，30d左右帶土上盆移栽，正常管理。實施例二一品紅人工雜交授粉22d後的胚珠幼胚拯救方法I項同實施例一。2、雜種胚珠的剝取及誘導培養取一品紅雜交授粉後發育22d的子房，流水下衝洗5min,在無菌條件下,用體積比75%的乙醇浸泡lmin,再用質量百分比為O. 1%升萊溶液中消毒lOmin，無菌水衝洗4 5次後用鑷子撕撥開子房壁，輕輕剝出胚珠後迅速接種到MS+NAA O. 5mg/L+6-BA O. 5mg/L 培養基上培養，培養基 pH 5. 6-5. 8、蔗糖 60g/L、瓊脂 6g/L，在溫度20 25°C、光周期10 12h/d、光照強度1500 20001ux。培養直接誘導幼胚萌發出胚芽。3、繼代、增殖與生根培養30d後轉入MS+NAA O. 05mg/L+6_BA O. lmg/L培養基中繼代培養，得到幼苗後切取莖段和頂芽轉入MS+NAA O. lmg/L+6-BA O. 5mg/L培養基中擴繁，待增殖數量達到目標數量時轉入1/2MS+NAA O. lmg/L培養基上生根。上述培養基pH5. 6 5. 8、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L，培養條件為溫度20 25°C、光周期10 12h/d、光照強度 1500 20001ux。4項同實施例一。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，不是對本發明的具體限制，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)胚珠剝取取一品紅雜交授粉後15 22d的子房，流水下衝洗5min，在無菌條件下，用體積比75%的乙醇浸泡lmin，再用質量百分比為0. I %升汞溶液中消毒lOmin，無菌水衝洗4 5次後用鑷子撕撥開子房壁，輕輕剝出胚珠； (2)誘導培養在無菌條件下，迅速將剝出的胚珠接種到MS+NAA0. 5mg/L+6-BA0. 5mg/L培養基，培養基pH 5. 6-5. 8、蔗糖60g/L、瓊脂6g/L，在溫度20 25°C、光周期10 12h/d、光照強度1500 20001uX下培養誘導胚芽萌發； (3)繼代、增殖與生根培養30 45d後轉入MS+NAA0. 05mg/L+6-BA 0. lmg/L培養基中繼代培養，得到幼苗後切取莖段和頂芽轉入MS+NAA 0. lmg/L+6-BA 0. 5mg/L培養基中擴繁，待增殖數量達到目標數量時轉入1/2MS+NAA 0. lmg/L培養基上生根。上述培養基pH5. 6 5. 8、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L，培養條件同(2); (4)移栽將根系發育良好的無菌苗在室內自然光下開瓶煉苗3 4d，鑷子夾取試管苗洗淨附著在表面的培養基，移栽到泥炭珍珠巖蛭石=I I I的穴盤中，置於溫室中保持90 95%相對溼度、20 25 °C溫度培養，30d左右帶土上盆移栽，正常管理。
2.根據權利要求I所述的利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法，其特徵在於所述的人工雜交授粉在晴天上午11:00 12:00進行，採集父本新鮮花粉，用毛筆輕輕授到母本呈倒「八」字狀的柱頭上；次日重複授粉一次；溫室環境溫度不低於25°C，正常管理。
3.根據權利要求I所述的利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法，其特徵在於所述的一品紅雜交父母本為通過遮光或者補光調節控制花期、花期保持一致的親本。
4.根據權利要求I所述的利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法，其特徵在於所述的父本花粉為當日父本柱頭散粉的新鮮花粉。
全文摘要
本發明公開了一種利用幼胚拯救獲得一品紅雜交後代的方法。該方法取人工雜交授粉後15～22d的胚珠採用離體培養進行幼胚拯救，具體步驟包括(1)胚珠剝取，(2)誘導培養，(3)繼代、增殖與生根培養，(4)移栽。該發明有效避免了一品紅雜種胚早衰，提高了一品紅雜交後代的雜種成活率，縮短了一品紅雜交後代的培育周期，可在一品紅雜交育種中應用。
文檔編號A01G31/00GK102845312SQ20121038822
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月12日 優先權日2012年10月12日
發明者李暢, 蘇家樂, 劉曉青, 陳尚平, 何麗斯 申請人:江蘇省農業科學院