一株防治植物根結線蟲的木糖氧化無色桿菌及其應用的製作方法
2023-06-24 02:32:26 3
本發明屬於植物病害生物防治技術領域，具體涉及一種防治植物線蟲病害的無色桿菌及其應用。
背景技術：
根結線蟲因其世界範圍性的地理分布以及廣泛的寄主範圍，對許多重要的經濟作物造成嚴重危害，被認為是世界範圍內最重要的病原物之一。據估計，最常見的種可以侵染超過5500種植物。根結線蟲的寄主遍及糧食、油料、蔬菜、果樹等作物，例如番茄、生菜、黃瓜、花生、菸草、柑橘等植物都可被根結線蟲侵染。植物根系發病後多個根結連在一起,形成大小不一的腫瘤，發病晚期根變得粗糙且容易腐爛。根部畸形導致整個植物運輸系統受損，從而導致植株地上部分出現發育不良、矮化、黃化以及果實畸形等症狀，更加嚴重時則導致植株死亡。
線蟲病害在生產上已成為一類重要的頑固性病害，控制該病害的發生與蔓延是確保作物產量與品質而急需解決的問題。目前根結線蟲病的防治主要有以下3種方法，即農業防治、化學防治和生物防治。
種植抗性品種是一種重要的控制線蟲病害發生的農業措施，而抗病品種的缺乏限制了它的發展，而且部分抗性品種並沒有很全面的應用。部分番茄抗性品種的種植與其它防治手段的聯合使用雖然已經取得了一定的效果，但是因為有些品種在一些國家當地產量低，所以推行後並沒有受到種植者們的歡迎。
長期以來，我國農作物的病蟲害防治主要依賴化學農藥，現階段防治根結線蟲的主要方法還是依賴於化學藥劑。化學藥劑高效，易使用，但是由於農藥汙染較為嚴重，食品中農藥檢出率高達90％以上，這嚴重危害了消費者的身體健康。同時，由於食品農藥殘留問題導致我國農產品出口受阻，這對我國現代農業產業的發展構成了嚴重影響。因此，農藥殘留已成為食品安全生產中急需解決的問題。相比化學農藥，生物農藥具有安全、環保和無殘留等優點。注重低毒、高效和選擇性強的生物農藥開發已成為當前的研究熱點之一。
目前，許多研究者提倡並在重點研究開發利用生物防治技術來控制線蟲病害。生物防治措施既對環境友好，對人畜安全，又能有效控制病害的發生與蔓延所以頗受青睞。目前已經報導過的生防真菌有淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)、厚垣輪枝菌(Verticillium chlamydosporium)、被毛孢(Hissutella spp.)、綠色木黴(Trichoderma viride)等，殺線效果較好的生防細菌有巴氏桿菌(Pasteuria spp.)、芽孢桿菌(Bacillus spp.)和假單胞菌(Pseudomonas spp.)、除蟲鏈黴菌(Streptomyces avermitilis)等。
迄今為止，利用細菌防治線蟲病害的報導不少，但是關於利用木糖氧化無色桿菌防治植物線蟲病害研究尚未被報導過。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是提供一種木糖氧化無色桿菌Achromobacter xylosoxidans AH-5(本發明或稱為AH-5菌株)，該菌株對根結線蟲病有較強的防治效果。該菌株已於2016年9月5日送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類命名：Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏編號：CCTCC NO：M 2016458；地址：中國武漢武漢大學。
本發明的第二個目的是在於提供了一種Achromobacter xylosoxidans AH-5在製備防治根結線蟲病生物製劑藥物中的應用，特別適合於根結線蟲病的防治。
本發明最後一個目的在於提供了一種Achromobacter xylosoxidans AH-5在促進豌豆生長中的應用。
為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施：
一種Achromobacter xylosoxidans AH-5，通過以下方式獲得：
申請人從中國安徽省土壤土樣中分離、篩選得到一株對根結線蟲具有較強防治效果的菌株，將其命名為AH-5。通過形態學、生理生化測定及分子生物學的鑑定，鑑定為木糖氧化無色桿菌Achromobacter xylosoxidans。
該菌株已於2016年9月5日送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類命名：Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏編號：CCTCC NO：M 2016458；地址：中國武漢武漢大學。
Achromobacter xylosoxidans AH-5菌株菌落特徵：菌落圓形，淺黃色，半透明，菌落凸起，革蘭氏染色後菌體呈現紅色，為陰性菌。
平板培養Achromobacter xylosoxidans AH-5使用的是NA培養基，該培養基組分及配方如下：蛋白腖5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，瓊脂20g，補充蒸餾水至1000mL，調pH至7.0，在121℃高壓蒸汽滅菌30min；35℃，暗培養。
一種木糖氧化無色桿菌AH-5在製備防治根結線蟲病生物製劑藥物中的應用，包括利用該菌株作為唯一有效成分或有效成分之一製備成防治植物線蟲病害的藥物。
本發明的保護內容還包括木糖氧化無色桿菌AH-5在製備生物殺線蟲劑的應用。
一種木糖氧化無色桿菌AH-5在促進豌豆生長中的應用，包括所述的木糖氧化無色桿菌AH-5發酵液用於製備豌豆促生長製劑。
與現有技術相比，本發明具有以下優點：
1.本發明篩選出一株防治根結線蟲病的新菌株AH-5，該菌株是一種木糖氧化無色桿菌，目前沒有關於該菌株防治根結線蟲病的相關報導。
2.利用該菌的發酵菌液，能有效地控制線蟲病害的發生和危害。本發明篩選出的AH-5菌株對根結線蟲在室內生測試驗中，AH-5發酵上清液對二齡幼蟲24h的致死率可達到92.4％；室內盆栽試驗結果表顯示，AH-5發酵菌液處理組的豌豆根系根結數明顯減少，40天後防效可達72.29％，60天後防效為41.75％。在豌豆根結線蟲病的大田試驗中，120天後AH-5處理組的豌豆根系根結數明顯減少，對根結線蟲病的防效高達43.59％。
3.在盆栽試驗、田間試驗中，AH-5菌株對豌豆有較好的促生作用，在株高、根長、根部鮮重方面均與對照組存在顯著差異(P≤5％)。
4.本發明使用的菌株對根結線蟲病防效較高，對人畜無毒；成本低。
5.本發明利用木糖氧化無色桿菌AH-5菌株的發酵菌液直接防治根結線蟲病，生產和使用均十分簡單，生產中沒有用到有機溶劑，降低了生產過程中和產品中的汙染，也不會產生溶劑中毒，具有生物農藥對人畜安全的優點。
附圖說明
圖1為菌株AH-5在牛肉膏蛋白腖平板上的菌落形態、革蘭氏染色圖片。
圖2為盆栽試驗中AH-5處理組與清水對照組60天豌豆根系圖片。
圖3為盆栽試驗中AH-5處理組與清水對照組60天豌豆植株圖片。
圖4為田間試驗中AH-5處理組與清水對照組120天豌豆植株圖片。
圖5為田間試驗中AH-5處理組與清水對照組120天豌豆根系圖片。
具體實施方式
本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規技術。本發明所用試劑或材料，如未特別說明，均來源於商業渠道。
實施例1：
AH-5菌株的分離及鑑定
1.1AH-5菌株的分離
申請人從中國安徽省土壤土樣中分離、篩選得到一株對根結線蟲具有較強防治效果的菌株，將其命名為AH-5。本發明的AH-5菌株的分離和純化採用稀釋塗布平板法、平板劃線法、生物測定法等方法。
1.2菌株的鑑定
1.2.1菌株的形態學鑑定
通過觀察菌落的顏色、形態、邊緣、透明度、光澤度、培養基的顏色等，並通過革蘭氏染色觀察個體形態特徵。
將AH-5菌株在牛肉膏蛋白腖培養基平板上劃線培養，從圖1中可以看到：AH-5菌落淺黃色、半透明、菌落凸起、無光澤、邊緣略整齊，無色素產生。鏡檢發現菌體呈杆狀，無芽孢，革蘭氏染色呈紅色，為陰性菌。
1.2.2菌株生理生化特徵檢測
採用酶試驗、藥物敏感試驗、胺基酸水解試驗、6.5％NaCl生長耐受試驗、產H2S試驗、尿素水解試驗等生理生化實驗測定。
AH-5部分生理生化實驗結果如表1。結果表明，細菌菌株AH-5生理生化特徵與無色桿菌屬生理生化特徵基本相似。
表1AH-5部分生理生化特徵
註：「+」表示陽性，「—」表示陰性。
1.2.3菌株AH-5的分子鑑定
將AH-5無菌操作臺中用接種環挑取單菌落於分裝好的NA液體培養基中，35℃，180rpm條件下震蕩培養12h，並利用細菌鑑定常用的細菌16SrDNA區通用引物：27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492r(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行菌液PCR擴增。PCR擴增程序為：95℃預變性5min，95℃30s、55℃30s、72℃45s，30個循環，72℃10min，4℃保存。PCR反應產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格後送生工公司測序。
經測序獲得菌株AH-5的16S rDNA序列大小為1437bp(其序列為SEQ ID NO.1所示)，通過Blast分析，選取與之同源性較高的菌株，利用軟體MEGA5.20進行系統發育分析、NJ法構建菌株的16S rDNA系統發育樹。結果表明AH-5與Achromobacter xylosoxidans聚在一個分支上，同源性為99％，結合菌株形態特徵和生理生化實驗，將AH-5鑑定為木糖氧化無色桿菌。
該菌株已於2016年9月5日送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類命名：Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏編號：CCTCC NO：M 2016458；地址：中國武漢武漢大學。
培養AH-5菌株使用的是NA培養液，其組分及配方如下：蛋白腖5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，補充蒸餾水至1000mL，調pH至7.0，在121℃高壓蒸汽滅菌30min。
搖瓶發酵參數條件：用挑針挑取細菌單個菌落，接種於裝有150mL NA培養液的三角瓶中，35℃，160rpm，搖培72h。將細菌菌液分裝入離心管中，8000r/min離心3min，將菌體與上清液分開，上清液過0.22μm的細菌過濾器，收集至另一離心管中。用於實施例2和實施例3。
實施例2：
AH-5菌株發酵上清液對根結線蟲卵孵化的影響
24孔板的每孔加入AH-5的上清液700μL，同時每孔中加入100個根結線蟲卵與細菌上清液均勻混合，重複三次，設置無菌水為對照；將裝有根結線蟲卵和AH-5上清液的24孔板放置在25℃恆溫箱中，7天後於體式顯微鏡下觀察，計數，並計算根結線蟲卵孵化率與相對抑制率。
表2AH-5發酵上清液對根結線蟲卵孵化的影響(7d，25℃)
註：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗，P≤0.05)
AH-5菌株發酵液對根結線蟲卵孵化的結果顯示：以ddH2O為對照組的CK在7天後卵的孵化率達到了86.5％，經AH-5發酵液處理的卵孵化率為77.4％，對根結線蟲卵的孵化無明顯的抑制作用(P≤0.05)，相對抑制率僅為10.5％(表2)，說明AH-5菌株發酵液不能夠有效的抑制根結線蟲卵的孵化。
實施例3：
AH-5菌株發酵上清液對根結線蟲二齡幼蟲的影響
24孔板的每孔加入AH-5的上清液700μL，每孔中加入100條根結線蟲二齡幼蟲與上清液均勻混合，重複三次，同時設置無菌水作為對照參考，將裝有根結線蟲卵和AH-5上清液的24孔板放置在25℃恆溫箱中，分別在12h與24h後於體式顯微鏡下觀察，並記錄結果。
表3AH-5發酵上清液對根結線蟲二齡幼蟲的影響(25℃)
註：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗，P≤0.05)
AH-5菌株發酵上清液對根結線蟲二齡幼蟲的影響的實驗結果顯示：經過ddH2O處理後12h，24h的二齡幼蟲均無死亡，AH-5菌株發酵上清液處理組在處理後12h和24h後，對二齡幼蟲致死的死亡率分別為77.9％和92.4％(表3)。實驗證明AH-5菌株發酵上清液對根結線蟲二齡幼蟲致死率具有顯著效果(P≤0.05)。
實施例4：
AH-5菌株防治豌豆根結線蟲的溫室盆栽試驗
供試材料和方法：
豌豆：中豌六號
線蟲：南方根結線蟲Meloidogyne incognita
豌豆種子浸泡7-8個小時後播種於口徑為18cm、高為11cm的營養缽中，每營養缽1.5kg無線蟲土壤，出苗後每個營養缽留一棵豌豆苗。
AH-5液體發酵培養：發酵培養基為牛肉膏蛋白腖液體培養基(溶劑為水，蛋白腖5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，補充蒸餾水至1000mL，調pH至7.0，在121℃高壓蒸汽滅菌30min。)。挑取AH-5單菌落接種到裝有150mL NA液體培養基的三角瓶中，35℃，160rpm，搖培72h，得到AH-5發酵液。該AH-5發酵液中，AH-5的含量為2×109cfu/mL。
試驗設如下兩個處理：
AH-5處理組：待豌豆幼苗長出4片真葉後接種南方根結線蟲：將孵化的南方根結線蟲二齡幼蟲配製成100條/mL的線蟲懸浮液，取10mL均勻加入在植株根系周圍。同時在當天進行發酵液處理，用2×109cfu/mL的AH-5發酵液10mL灌根處理豌豆幼苗。實驗設3次重複，每個重複處理8株豌豆幼苗。然後放置在溫室中進行培養。培養30天後補施一次發酵液，正常田間管理。
對照組：將AH-5發酵液替換為等量的清水，其它實驗操作與AH-5處理組相同。
病害調查：分別距離第一次施藥40d和60d進行病害調查，拍照記錄。①豌豆生長情況的調查：測量並統計株高、地上部分鮮重(不含果實)、根部長度、根部鮮重等數據。②豌豆根結線蟲病發病情況調查：將豌豆植株的根剪下，將每組各處理的根收集在一起，剪碎並在榨汁機中打漿2次，第1次10s，第2次20s，先後用200目、325目的篩子過濾，蒸餾水衝洗篩子，收集留在325目篩子上的線蟲和卵；各處理每組各取1mL的懸液，置於自製的雙層玻片中觀察，對其中的根結線蟲與根結線蟲卵進行計數，並計算每棵豌豆根部中根結線蟲和根結線蟲卵的數量。
防治效果＝(對照組根結數—處理組根結數)/對照組根結數×100％
表4AH-5發酵液對豌豆生長情況的影響(40d)
註：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗，P≤0.05)
表5AH-5發酵液對豌豆生長情況的影響(60d)
註：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗，P≤0.05)
豌豆生長情況的調查結果表明：在第一次藥劑處理後40天進行豌豆幼苗的生長指標測定，發現豌豆株高、地上部分鮮重、根長經AH-5發酵液處理後相對清水處理組CK在0.05水平上具有顯著性差異，但是AH-5處理組的根重與CK組無顯著性差異(表4)；在60天時對豌豆幼苗生長指標進行統計分析時發現AH-5處理組的株高、地上部分鮮重均高於與CK組，並且在0.05水平上存在顯著性差異，而AH-5組的根長、根重指標高於CK組，但在0.05水平上無顯著性差異(表5)。實驗證明AH-5發酵液在豌豆生長有顯著地促進作用。
表6盆栽試驗中AH-5對根結線蟲的防治效果(40d)
註：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗，P≤0.05)
表7盆栽試驗中AH-5對根結線蟲的防治效果(60d)
註：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗，P≤0.05)
AH-5發酵液對根結線蟲的防治效果證明：AH-5液體發酵培養物在沒有任何助劑填加的條件下，施用2次，40天時對豌豆根結線蟲病防效達72.29％(表6)，60天後對豌豆根結線蟲病防效仍達41.75％(表7)。經AH-5處理後的豌豆苗根系發達，根結少，植株生長正常，未發現明顯的藥害，對豌豆安全，具有良好的應用價值，該濃度已經達到產業化開發利用的濃度要求。
實施例5：
AH-5菌株防治豌豆根結線蟲的田間試驗
供試材料和方法：
豌豆：中豌六號
線蟲：南方根結線蟲Meloidogyne incognita
豌豆種子播種於線蟲病害較為嚴重的溫室大棚，每隴3行，每行6穴。出苗10d後間苗，每穴留一株豌豆幼苗。
AH-5液體發酵培養：發酵培養基為牛肉膏蛋白腖液體培養基(溶劑為水，蛋白腖5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，補充蒸餾水至1000mL，調pH至7.0，在121℃高壓蒸汽滅菌30min)。挑取AH-5單菌落接種到裝有150mL NA液體培養基的三角瓶中，35℃，160rpm，搖培72h，得到AH-5發酵液。該AH-5發酵液中，AH-5的含量為2×109cfu/mL。
實驗設如下兩個處理：
AH-5處理組：播種豌豆種子30d後，進行藥劑處理，用109cfu/mL的AH-5發酵液10mL灌根處理豌豆幼苗。1隴即一個重複，每隴共18株豌豆，實驗設3次重複，每個重複處理1隴豌豆幼苗，保持正常田間管理。
清水對照組(CK)：將AH-5發酵液替換為等量的清水，其它實驗操作與AH-5處理組相同。病害調查：120d後，對豌豆生長情況和發病狀況進行調查和拍照記錄，並進行數據統計分析。①豌豆生長情況的調查：測量並統計株高、地上部分鮮重(含果實)、根部長度、根部鮮重等數據。②豌豆根結線蟲病發病情況調查：將豌豆根系用清水輕輕衝洗乾淨後，觀察根系發病情況，對病害進行分級。
0級：無根結；
1級：有少數根結，佔全根系1％-25％；
2級：根系根結數量中等，佔全根系的26％-50％；
3級：根系根結數量多，佔全根的51％-75％；
4級：根系根結數量很多，佔全根系76％-100％
防治效果＝(對照組根結級數—處理組根結級數)/對照組根結級數×100％
表8田間試驗中AH-5發酵液對豌豆地上部分生長的影響(120d)
註：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗，P≤0.05)
豌豆地上部分生長情況的調查證明：通過調查120d後豌豆植株的生理指標發現，AH-5處理組豌豆植株的地上部分鮮重(含果實)為37.00g、株高為41.95mm、單株豆莢數為1.53個、單株豆莢重為2.10g，而CK組的地上部分鮮重(含果實)為21.34g、株高為32.11mm、單株豆莢數為1.13個、單株豆莢重為1.64g。數據統計分析發現，AH-5處理組的各項生長指標均明顯高於清水處理組(CK)，並且在0.05水平上存在顯著性差異(表8)，也證明AH-5發酵液在豌豆生長有顯著地促進作用。
表9AH-5發酵液對豌豆根結線蟲的田間防治效果(120d)
註：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗，P≤0.05)
AH-5發酵液對豌豆根結線蟲的田間防治效果證明：120d後對豌豆地下部分鮮重和根長測量統計，並對根結進行病害分級，並進行數據統計分析發現，AH-5處理組的地下部分鮮重為1.31g高於CK組的0.77g，並且在0.05水平上存在顯著性差異；AH-5處理組的單株根結病害級數僅為0.73，相對於CK組的1.30也顯著下降，AH-5發酵液對於豌豆根結線蟲的防治效果可達到43.59％(表9)。經AH-5處理後的豌豆苗根系發達，根結少，植株生長正常，未發現明顯的藥害(圖4，圖5)，對豌豆安全，具有良好的應用價值。
SEQUENCE LISTING
華中農業大學
一株防治植物根結線蟲的木糖氧化無色桿菌及其應用
一株防治植物根結線蟲的木糖氧化無色桿菌及其應用
1
PatentIn version 3.1
1
1437
DNA
人工序列
1
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