人可溶性腺苷酸環化酶的晶體結構的製作方法

2023-06-24 02:46:46

專利名稱：：人可溶性腺苷酸環化酶的晶體結構的製作方法
技術領域：
：本發明涉及人可溶性腺苷酸環化酶(solubleadenylatecyclase，solAC)的催化結構域、其結晶方法、solAC的晶體及其三維結構、在存在配體的情況下solAC的晶體、及其用途。
背景技術：
：腺苷酸環化酶環磷酸腺苷(Cyclicadenosine3』，5』-monophosphate，cAMP)是一種遍在性第二信使，其調節多種重要的生理學過程，包括基因表達、細胞生長、心臟功能、染色體分離和細胞代謝(Robison，G.A.Butcher，R.W.andSutherland，E.W.(1968)Annu.Rev.Biochem.37，149-174；Rodbell，M.(1980)Nature，284，17-22)。其通過6種不同家族的酶自ATP合成而來，其中之一是腺苷酸環化酶或腺苷醯環化酶(AC)。儘管這些家族都能夠自ATP產生cAMP，但它們之間沒有序列相似性。I類存在於腸道細菌中並調節代謝物抑制，而II類存在於病原體如炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa)和百日咳博得特氏菌(Bordetellapertusis)中。IV、V和VI類分別存在於嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrohila)、棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)和艾特利根瘤菌(Rhhizobiumetil)。III類環化酶也稱為通用類型，是唯一既見於真核細胞也存在於細菌和古細菌中的類型。哺乳動物細胞表達兩種不同類型的這些酶已經被充分表徵的跨膜腺苷酸環化酶(tmAC)和最近才發現的可溶性腺苷酸環化酶(solAC)(Shenoy，A.V.andVisweswariah，S.S(2004)FEBSLett.561，11-21)。tmAC是質膜結合蛋白質。所有9個被鑑定的tmAC異構體(I-IX)均被激素和神經遞質刺激並被Gs蛋白的α亞基活化，且除了IX型以外，均被二萜類福司柯林(forskolin)刺激。通過它們對Gi、Go和Gzα-亞基以及Gβ，γ亞基、PKC和Ca2+/鈣調蛋白的不同應答可對它們加以區分。正是這種調節多樣性使得不同的tmAC在細胞內正確地應答於來自神經遞質和激素的細胞間信號。tmAC類具有的共同結構的組成為一個短的細胞質N-末端，隨後為疏水性區域串聯重複，其通常為6個跨膜螺旋的形式，以及一細胞漿區域。兩個細胞漿結構域分別稱為C1和C2，它們之間(～50％相同性)以及與tmAC家族的9種不同成員之間(～50-90％相同性)具有很大程度的同源性。酶活性需要C1和C2結合形成互補的異二聚體。由於難以純化到具有活性的蛋白質，在很長的時間內一直不知道這些酶的機制和調節的生物化學特徵。一個重要的突破來自於開發了可溶性tmAC系統，其中細胞漿結構域的節段被獨立地表達為可溶性重組蛋白。在體外，C1和C2均傾向於以頭尾界面發生自結合，產生無活性的(C1)和低活性的(C2)同二聚體，但當它們混合後產生具有完全活性的、保留其調節特性的異二聚體。因此，C2同二聚體和CiC2異二聚體應答於福司柯林刺激，而C1同二聚體是無活性的。可溶性tmAC系統使得能夠對酶進行X線晶體研究，由此得知了與牛Gsα形成複合物的大鼠II型C2同二聚體和犬V型C1/大鼠II型C2異二聚體的結構(Zhang，G.Liu，Y.Ruoho，A.E.andHurley，J.H.(1997)Nature，386，247-253；Tesmer，J.J.G，Sunahara，R.K.Gilman，A.G.andSprang，S.R.(1997)Science278，1907-1916；Tesmer，J.J.G，Sunahara，R.K.Johnson，R.A.Gosselin，G.Gilman，A.G.andSprang，S.R(1999)Science，285，756-760)。此類系統的構建一直很困難，其中主要的挑戰之一是確定C1和C2構建體的起始點。儘管該家族之間具有顯著的序列同源性，且僅僅基於序列同源性的構建體設計是一個有用的起始點，但要獲得對蛋白酶裂解作用具有穩定性的、可溶性的和功能性的蛋白質絕不僅僅是常規的工作(Beeler，J.A.andTang，W-J.(2004)MethodsinMol.Biol，237，39-53)。可溶性腺苷酸環化酶功能、表徵和純化最早於1975年報導，在來自大鼠睪丸的細胞質級分中存在新的可溶形式的腺苷酸環化酶(「solAC」)。其與tmAC類不同的是，其對Mn2+離子存在特異性的需求，且其活性不受黃體生成素(LH)或卵泡刺激素(FSH)的刺激(Braun，T.andDods，R.F.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，1097-1101)。由於Mn2+離子能夠活化該酶且該酶對G蛋白調節表現出不敏感，這促使Buck及其同事在1999年採用生化方法和色譜方法來表徵該酶。他們鑑定了一種可溶性蛋白質，分子量為48kDa，不過以PCR分離的全長solAC基因顯示，其讀碼框編碼一種分子量為187KDa的更大的酶。該48kD的具有酶活性的分子被發現位於該全長蛋白質的N端部分內，提示其可能是該蛋白質的蛋白酶裂解片段。PCR和RNase保護分析研究發現了在嚙齒類胚系中兩種替代性剪接轉錄物產生所述短的和全長的酶的證據(Jaiswal，B.S.andConti，M.(2001)J.Biol.Chem.276，31698-31708)。將solAC讀碼框與其他序列比較發現，該48KDa分子含有兩個區域，它們與各種腺苷酸環化酶催化結構域具有顯著的胺基酸同源性，而最密切相關的序列是來自藍細菌(cyanobacteria)(Anabaenaspirulensis的cyaB1、cyaB2和cyaA，以及鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)的cyaC)和粘菌(橙色標樁菌(Stigmatellaaurantiaca)的cyaA和cyaA)的那些序列(Buck，J.Sinclair，M.L.Schapal，L.Cann，M.J.andLevin，L.R.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，79-84)。進一步的分析發現，solAC的催化結構域僅與tmAC的催化結構域C1和C2具有15至25％的序列相同性。逆轉錄酶PCR證實solAC在絕大多數檢測的組織中表達，包括眼睫狀突、角膜內皮、脈絡叢、腎臟和附睪(Mittag，T.W，Guo，W-BandKobayashi(1993)Am.J.Physiol264，F1060-F1064；Zippin，J.HLevin，L.R.andBuck(2001)TrendsEndocrinolMetab，12366-370)。不過，Northern印記分析和原位雜交提示，高度表達僅存在於雄性生殖細胞(Sinclair，M.L.Wang，X-Y，Matia，M.Conti，M.Buck，J.Wolgemuth，D.J.andLevin，L.R.(2000)Mol.Reprod.Dev.56，6-11)。已經證實，solAC不僅是一種可溶性酶，還特異性定向於細胞器，包括線粒體、中心體、有絲分裂紡錘體、中間體和細胞核，因此認為其與cAMP信號傳導的效應物關係密切(Zippin，J.H.Chen，Y.Nahirney，P.Kamenetsky，M.Wuttke，M.S.Fishman，D.A.Levin，L.RandBuck，J.(2003)FasebJournal，17，82-84；Litvin，T.N.Kamenetsky，M，Zarifyan，A.Buck，J.andLevinL.R.(2003)J.Biol.Chem.278，15922-15926)。可溶性AC受到Ca2+和HCO3-的調節，提示通過這些細胞內信號分子的調變導致solAC介導針對細胞內在事件的cAMP依賴性應答。作為迄今在哺乳動物中鑑定到的唯一一種作為碳酸氫根/二氧化碳化學感受器的酶，solAC被認為不僅在精子獲能超活化運動性和頂體反應中，也在腎臟液體重吸收、睫狀體和脈絡叢的液體分泌、以及應答於營養信號的代謝調節中發揮關鍵作用(Litvin，T.N.Kamenetsky，M，Zarifyan，A.Buck，J.andLevinL.R.(2003)J.Biol.Chem.278，15922-15926)。闡明一種蛋白質的結構需要有足量的純化蛋白質的來源以便能夠產生晶體。許多蛋白質，既便是在重組生產系統中表達時，也很難以可溶性、具有活性且非聚集蛋白質的形式得以純化。多種不同的細菌腺苷酸環化酶已經以可溶性形式在大腸桿菌中表達。具體而言，細菌腺苷酸環化酶魚腥藻屬(Anabaena)cyaB、分枝桿菌Rv1264和標樁菌屬(Stigmatella)cyaB已經以可溶性形式表達於大腸桿菌(Cannetal.(2003)，J.Biol.Chem，278，35033-35038；Kanacheret.Al.(2002)EMBOJ.21，-3672-3680；Linderetal.(2002)J.Biol.Chem，277，15271-15276)。大腸桿菌已經被用於表達布魯斯錐蟲(Trypanosomabrucei)腺苷酸環化酶，形式為包涵體(Bieger，B.andEssen，L-O.(2000)ActaCryst.D56，359-362)。大腸桿菌也被用於表達N端以His標記的大鼠跨膜腺苷酸環化酶的C2結構域。所述蛋白質以可溶性形式表達(Yan，S-Zetal.(1996)J.Biol.Chem，271，10941-10945)。Sunahara，R.K等還以N端His標記的融合蛋白的形式表達了犬的V型腺苷酸環化酶C1結構域((1997)J.Biol.Chem.272，22265-22271)。闡明solAC的機制和生物化學特性的障礙在於難以獲得足量的純度足夠高的材料。表達和收集以上提及的其他形式的腺苷酸環化酶的條件均各不相同，提示不同形式的腺苷酸環化酶需要精確而不同的條件才能產生顯著量的蛋白質。在重組表達之前，一種純化solAC的方法需要處理數百個大鼠的睪丸(950)才能獲得足夠的蛋白質(～3μg)用於研究該酶的性質(Buck，J.Sinclair，M.L.andLevin，L.R.(2003)MethodsinEnzymol.345，95-105)。純化過程涉及多個步驟，起始於細胞裂解物，其包括20mMTris-HCl，pH7.5，1mMDTT和蛋白酶抑制劑。經過6個不同的柱純化後，該酶的濃縮級分被加到HPLC柱上，並以20mMTris-HCl，pH6.8，1mMDTT洗脫，洗脫梯度為0-0.1MNaCl。曾認為降低pH—這是在這一時期首次進行的—引起了顯著的富集(約60倍)活性增強。回收的solAC蛋白質的最終產量為大約3μg，不過其中包括一種62KDa的無關的汙染蛋白質，因此，這種製備方法即使擴大規模仍然不太可能適合於產生晶體。也已經在HEK293細胞中表達了重組的全長和催化結構域大鼠solAC。這些構建體被用於確定由所述兩種替代性轉錄物編碼的酶的特性以及它們彼此之間的相對活性和與來源於組織的等價物之間的相對活性。通過離心使重組細胞裂解物澄清，隨後上樣於SephacrylS-200柱。儘管沒有報導產量，但它們足以確認所述重組物在活性、大小和免疫反應性方面與表達於睪丸的solAC是相當的(Jaiswal，B.S.andConti，M.(2001)J.Biol.Chem.276，31698-31708)。重組表達方法允許對表達的蛋白質進行標記以便於回收。Litvin等((2003)J.Biol.Chem.278，15922-15926)公開了在杆狀病毒Hi5細胞中產生具有GST標記的重組人solAC催化結構域。將產生所述蛋白質的細胞裂解於PBS，pH7.4，1mMEDTA，1mMDTT和蛋白酶抑制劑混合物中。將裂解物上樣於穀胱甘肽瓊脂糖4B柱，並以50mMTrisHClpH8.0、10mM還原型穀胱甘肽、10μg/ml抑肽酶和10ug/ml亮抑蛋白酶肽洗脫。將裂解物上樣於Superdex200HR10/30柱，並將樣品儲存於50％甘油中。終樣品含有額外的GST帶，感興趣的蛋白質沒有自標記物裂解下來。作者沒有指明產量，儘管它們足以用於酶學研究，但產量似乎很低。另一種標記物是6組氨酸標記物，Chen等((2000)Science289，625-628)使用其表達solAC催化結構域(胺基酸1至469位)。該標記物被融合於C端。使用Bac-to-BacTM杆狀病毒ExpressionSystem(LifeTechnologies)將所述蛋白質異源性表達於昆蟲HiFive細胞，並在Ni2+-NTA瓊脂糖樹脂(Qiagen)上通過層析純化蛋白質。沒有公開條件和蛋白質的產量，但其量足以確定碳酸氫根對重組酶活性的影響不是由於pH的影響。他們還發現亞硫酸氫根離子能夠模擬solAC碳酸氫根的刺激，而氯化物或硫酸根或磷酸根則不能。儘管對solAC已經有了這些以往的研究，但純的重組哺乳動物蛋白質的終產量仍然很低，因此無法進行結構研究。SolAC同源物結構已經報導了在存在或不存在HCO3-時與ATP類似物、Mg2+或Ca2+相複合的來自鈍頂螺旋藻的solAC同源物CyaC一系列結構。他們發現鈣離子佔據了第一個金屬結合位點，且似乎介導核苷酸在該活性位點的開放構象中的結合。碳酸氫根的存在引起該活性位點關閉，儘管其也募集了一第二金屬離子。底物類似物的磷酸根基團在該活性位點內重排它們的構象，這可能有助於產物的形成和釋放。由於該酶的apo形式還沒有解決，有可能該酶還存在其他的構象，且有可能那些觀察到的構象代表了反應途徑中俘獲的分子(Steegborn，C.Litvin，T.Levin，L.R.Buck，J.andWu，H.(2005)Nat.Struc.AndMol.Biol.12，32-37，Tesmer，J.J.G(2005)Nat.Struc.AndMol.Biol.12，7-8)。SolAC和雄性避孕細胞cAMP濃度的改變已經被認為與精子對受孕過程的調節有關，特別是與成熟、獲能、運動性以及與配子的融合有關。儘管這些事件是相關的，但對其中潛在的機制所知甚少。為確定不同腺苷酸環化酶在調變這些過程中的具體作用，對精子的研究提示，solAC即使不是起著關鍵作用，也是起著重要的作用(deLamirande，E.LeClerc，P.andGagnon，C.(1997)Mol.Hum.Reprod.3，175-194；Jaiswal，B.J.andConti，M.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，10676-10681；Xie，F.andConti，M.(2004)DevelopmentalBiol.265，196-206；Chen，Y.Cann，M.J.Litvin，T.N.Iourgenko，V.Sinclair，M.L.Levin，L.R.andBuck，J.(2000)Science289，625-628)。solAC在受孕中的作用的明確證據來自於在小鼠中破壞solAC基因導致精子活動力嚴重受損而造成其不育這一情況。SolAC缺陷型雄性動物的睪丸和附睪的發育正常，且其他已知表達solAC的器官未顯示明顯的異常。雌性solAC缺陷型小鼠不出現表型，並產生正常大小的幼仔，幼仔是野生型的或者是雜合子小鼠。SolAC缺陷型雄性可正常交配，但由於精子缺乏前向運動而不能生育。對突變精子的體外研究發現，給精子加載cAMP可使之恢復正常活動力，不過突變的精子還是不能使卵母細胞受孕(Esposito，G.Jaiswal，B.S.Xie，F.Krajnc-Franken，M.A.M.Robben，T.J.A.A，Strik，A.M.Kuil，C，Philipsen，R.L.A.vanDuin，M.Conti，M.andGossen，J.A.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，2993-2998)。儘管solAC在受孕中起著關鍵的作用，但有證據表明一些tmAC也可能參與這一過程。完好的小鼠精子的免疫定位化顯示頂體區域和鞭毛區域富含tmACII、III和VIII，而tmACI和IV以較低的程度存在於中段和頂體。由於IVF基質中的一些成分已知可通過G-蛋白偶聯的受體起作用，因此很可能它們的作用是通過tmAC而調變的(Baxendale，R.W.andFraser，L(2003)Mol.Reprod.andDev.66，181-189)。solAC、腫瘤學、炎症和其他過程cAMP參與影響細胞增殖、細胞分化和細胞凋亡的信號轉導途徑。已知這些途徑的異常可導致一些病理情況例如癌症。可以提及的多種癌症包括下文G(vii)節所列出的那些。因此，可以將通過升高或降低solAC的活性而調變cAMP的濃度視為一種治療性或預防性槓桿。最近的研究提示solAC通過cAMP依賴性的鳥苷三磷酸酶類Rap-1的調變而參與TNF誘導的中性粒細胞活化和NGF介導的神經突發生(neuritogenesis)(Han，H.Stessin，A.M.Roberts，J.Hess，K.C.Gautam，N.Kamenetsky，M.Lou，O.Hyde，E.Nathan，N.Muller，W.A.Buck，J.Levin，L.R.andNathan，C.(2005)J.Exp.Med.202，353-361；Stessin，A.M.Zippin，J.H.Kamenetsky，M.Hess，K.C.Buck，J.andLevin，L.R.(2006).J.Biol.Chem.10，1074)。因此，通過活化或者抑制solAC而對這些過程進行下遊調節可能具有治療用途。TNF的過量產生或者不受調節的產生被認為介導或者加重了多種炎症性疾病和病症，包括類風溼性關節炎(Mainietal.APMIS，105(4)257-263)、類風溼性脊柱炎、骨關節炎、痛風性關節炎及其他關節炎病症；敗血症、感染性休克、內毒素性休克、革蘭氏陰性敗血症、中毒性休克症候群、成人呼吸窘迫症候群、腦型瘧疾、慢性肺部炎症性疾病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、哮喘、肺纖維化和細菌性肺炎、矽肺、肺結節病、骨重吸收疾病、再灌注損傷、移植物抗宿主反應、同種異體移植排異反應、感染引起的發熱和肌痛感染(例如流感)引起的發熱和肌痛、1型單純皰疹病毒(HSV-1)、HSV-2、巨細胞病毒(CMV)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人類皰疹病毒-6(HHV-6)、HHV-7、HHV-8、假性狂犬病、鼻氣管炎和繼發於感染或惡性疾病的惡病質、繼發於獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)的惡病質、AIDS、ARC(AIDS相關症候群)、疤痕形成、疤痕組織形成、Crohn氏病、潰瘍性結腸炎、或pyresis。由於solAC抑制劑抑制TNF所引起的效應，因此可以預見solAC抑制劑可用於治療上述列舉的疾病。還已知cAMP刺激房水形成(青光眼)和自胰腺的胰島分泌胰島素(糖尿病)。這兩個過程均受到碳酸氫根濃度的調節，這將它們與solAC直接聯繫起來。蛋白質結晶化蛋白質化學領域已知，使蛋白質形成結晶是一個不確定的和困難的過程，是否會成功是無法預料的。顯然，蛋白質結晶化是目前確定蛋白質結構的主要障礙。為此，蛋白質結晶化本身已經成為一個研究學科，而非僅僅是蛋白質晶體實驗室的延伸。許多文獻均描述了與產生蛋白質晶體有關的困難(KierzekAM.andZielenkiewiczP.(2001)BiophysicalChemistry，91，1-20Modelsofproteincrystalgrowth；WiencekJM(1999)AnnuRevBiomedEng.1，505-534NewStrategiesforcrystalgrowth；Service，R.Science(2002)Nov1；298，948-50Structuralgenomics.TappingDNAforstructuresproducesatrickle；ChayenN.JStructFunctGenomics(2003)4(2-3)115-20Proteincrystallizationforgenomicsthroughputversusoutput)。Wiencek強調需要合理的方法學和方案以產生適合用於確定蛋白質結構的單一的、高質量的蛋白質晶體，並提及缺乏蛋白質結晶化的基本方法，而蛋白質結晶化對於確定結構而言通常是關鍵步驟。對於合理的方法的需求，討論了影響蛋白質溶解度、成核作用和晶體生長的各種變量，包括溫度、壓力、pH、電解質、反抽提溶劑(antisolvents)和可溶性合成聚合物對蛋白質溶解度的影響。還描述了多種物理化學技術(包括雷射散射、X-線散射和X-線衍射以及原子力顯微鏡檢查)及其在研究晶體生長和成核作用速度中的用途，以及多種晶體生長技術，例如蒸汽擴散(vapourdiffusion)、自由界面擴散、透析、批生長(batchgrowth)和引晶(seeding)等技術。還討論了測量蛋白質晶體質量及其影響因素。Wiencek的結論是，蛋白質結晶化仍有很多方面是不清楚的，而我們在理解蛋白質結晶化方面的重大進展將會對基於蛋白質結晶學本身的各方面應用產生顯著的影響，這是因為結構生物學很大程度上取決於對蛋白質分子進行結晶的能力。類似地，Kierzek等也承認，產生大而高度有序的蛋白質晶體仍然是通過X線結晶學來確定蛋白質結構的主要障礙，這是因為對於蛋白質結晶化的物理化學方面還不了解。他們對形成用於解釋迄今收集到的有關蛋白質晶體生長的實驗數據的模型的各種嘗試進行了綜述，但卻指出還沒有任何令人滿意的蛋白質結晶化的模型，其原因在於該問題極為複雜，結晶化過程在時間和大小尺度上均橫跨多個數量級的範圍，這對於絕大多數計算機模擬方法來說是難以做到的。Kierzek等的結論是，對當前晶體生長領域中正在測試的範圍廣泛的各種方法進行某種整合有賴於實驗方法和理論方法方面都有進一步的進展。Service(ibid)討論了與蛋白質結晶化和結構確定相關的問題。其給出的實例之一是美國的一個探索性課題，該課題的目的是通過對蛋白質結晶化中涉及的大量步驟進行自動化而加快確定結構的過程。據記載，這一課題在其過程的各個階段均遭遇各種困難在經鑑定用於確定結構的1870種蛋白質靶中，僅僅產生了23個完整的蛋白質結構。Service稱其他課題的結果與此相近，因此在全世界範圍內的各種結構基因組學課題所研究的大約18,000種蛋白質中，僅獲得了大約200蛋白質的結構。該文章於是給出了結構確定過程中一些不同的點，所有這些點均引起一些問題。起始點，即誘使大腸桿菌和其他宿主細胞以表達正確的蛋白質並使它們成為可溶形式，被認為是最大的問題的之一。然後討論了與使得蛋白質形成適合用於X線研究的晶體有關的持續存在的問題結晶化以及隨後晶體的最佳化被認為是這個過程中的主要困難。實際上，該文章稱每一個步驟的損失均很嚴重。即使能夠得到晶體，還需要解決晶體的結構，而這並不是一個常規的過程，也無法預期其是否會成功。NISGC聯盟的文章對此進行了闡述。與用於結晶化和結構確定的大量靶蛋白相比，被克隆並隨後以可溶性蛋白質的形式被表達的數目實際上很低。並不總是能夠進行進一步純化，且既便是在純化後，所純化的蛋白質也只有一小部分被結晶化。即使如此，僅僅一部分這些蛋白質結晶化產生適合用於通過X線結晶學進行蛋白質結構確定單一的、高質量的蛋白質晶體。在5187種靶蛋白中，聯盟成員克隆了其中的1675種，並將1295種表達為蛋白質，而其中只有773種是可溶性的。其中被純化的蛋白質為719種，但被結晶化的僅有94種。他們目前已經確定了50種的結構，其中僅有22種是通過X線分析確定的。Chayen(ibid)的圖1給出了相似的圖示。Chayen將其注意力放在結構基因組學所涉及的眾多步驟中的結晶化步驟上，並討論了產生用於通過X線結晶學進行結構確定的高質量蛋白質晶體的困難。這種困難造成在所產生的蛋白質中目前僅有一小部分進行了結構確定這一事實。通常認為蛋白質分子在溶液中的結晶化是確定蛋白質結構過程的障礙，其中的原因很多蛋白質是複雜的分子，而其與溶液中的其他蛋白質分子以及小分子的特異性和非特異性相互作用的微妙平衡是難以預測的。每種蛋白質均在一組獨特的條件下發生結晶，而這是難以事先預測的。簡單地使得蛋白質過飽和以便將其自溶液中分離的方法是行不通的，在絕大多數情況下，這樣做得到的是無定型沉澱物。目前使用的沉澱劑有很多，一般是不同的鹽、以及聚乙二醇，但其他的也是已知的。此外，還可加入例如金屬和去垢劑等添加劑以調變溶液中的蛋白質的行為。已知有多種試劑盒，如來自HamptonResearch的那些，它們試圖儘可能多地覆蓋結晶化領域的各種參數，不過在大多數情況下它們僅僅是用於優化結晶的沉澱物和晶體的起始點，並不適合於衍射分析。有關溶解性、為實現正確的摺疊或活性而對金屬離子的依賴性、與其他分子的相互作用以及其他已知信息等蛋白質行為的知識有助於實現成功的結晶化。既便如此，蛋白質的結晶化通常仍然被認為是一個耗時的過程，其中下一步的實驗要建立在以往的嘗試所獲得的結果上。在獲得了蛋白質晶體的情況下，它們也不一定總是適合用於衍射分析它們的解析度(resolution)可能有限，而且隨後可能難以對其進行改進以使其達到按分析所需的解析度發生衍射的程度。造成晶體內解析度有限的因素有多種。可以是因為晶體內部蛋白質固有的運動，即使形成其他的晶體，這一問題也是很難克服的。也可以是因為晶體內溶劑含量太高，結果導致弱的散射。或者，也可能是因為晶格內部的缺陷，這意味著衍射的X線在晶格內部的單元至單元之間不能完全同相。這些問題中的任何一個或它們的組合均意味著晶體並不適合用於結構確定。一些蛋白質從未結晶化，在進行了合理的嘗試之後，有必要檢查蛋白質本身，並考慮是否可以製備各個結構域、不同的N或C端截短形式、或點突變。通常很難預測如何以此方式對蛋白質進行再遺傳工程化以改善其結晶化能力。有時，在結晶化混合物中加入配體對於產生合適的晶體十分關鍵。我們對結晶化機制的理解仍然是不完善的，而且參與結晶化過程的蛋白質結構的因素還不很清楚。
發明內容本發明涉及人可溶性腺苷酸環化酶催化結構域的晶體結構，其使得能夠對底物和輔因子在酶中的結合位置進行研究和確定。因此，在一個方面，本發明提供表1所示的可溶性腺苷酸環化酶的三維apo(即無配體形式的)結構及其用途。在第二個方面，本發明提供表2以及表3、4和5所示的在存在配體情況下可溶性腺苷酸環化酶的三維結構。在廣泛的方面，本發明提供solAC的結構及其在對配體與所述solAC結構的相互作用進行建模中的用途，所述配體例如為潛在的已有的藥用化合物或其他分子結構、前體藥物、solAC調變劑或底物、或此類化合物、調變劑或底物的片段。以下將討論這些和其他方面以及本發明的實施方式。本發明的上述方面，無論是單獨地還是組合地，均構成本發明的優勢特徵。圖1顯示了三種化合物，它們均結合solAC。該圖顯示了表3-5所用的源自變好系統。圖2顯示了碳酸氫根與solAC的三個殘基的結合相互作用。表格說明表1給出了solAC的結構的坐標數據。表2給出了與AMPCPP形成複合物的solAC的結構的坐標數據。表3給出了與碳酸氫根形成複合物的solAC的結構的坐標數據。表4給出了與5-苯基-2H-[1，2，4]三唑-3-巰基(化合物1)形成複合物的solAC的結構的坐標數據。表5給出了與N-(3-苯氧基-苯基)-草醯酸形成複合物的solAC的結構的坐標數據。表6solAC的活性位點殘基。表7solAC的與腺苷部分相互作用的活性位點殘基。表8solAC的碳酸氫根結合位點。表9solAC的通道(Channel)結合位點。表10solAC的亞袋結合位點(Sub-pocketbindingsite)。表11替代性solAC結合位點殘基。表12哺乳動物可溶性腺苷酸環化酶的完整序列之間的百分比相同性。表13哺乳動物可溶性腺苷酸環化酶的催化結構域之間的百分比相同性。表14solAC表達構建體。表15solAC裂解緩衝液。表16用於解析solAC結構的重原子衍生物。發明詳述定義選定的坐標在此所述的本發明的各個方面(如配體適配、同源性建模和結構解析、數據存儲裝置、計算機輔助操作坐標等等)均使用了表1、表2、表3、表4或表5給出的solAC結構坐標、或衍生自表1、表2、表3、表4或表5的solAC結構坐標、或參照表1、表2、表3、表4或表5的坐標而得到的solAC結構坐標。在本發明的所有方面，本領域人員能夠理解的是，在本發明的許多應用中，不一定需要使用表1、表2、表3、表4或表5中的所有坐標，而是僅使用他們的一部分，例如代表與特定用途有關的特別感興趣的原子的一組坐標。這樣的一部分坐標被稱為「選定的坐標」。在提及本發明的選定的坐標時，其是指例如所述solAC結構的至少5個、優選地至少10個、更優選地至少50個、以及甚至更優選地至少100個、例如至少500個或者至少1000個蛋白質原子。優選地所述選定的坐標涉及至少30個不同的胺基酸殘基(即可以存在來自30個不同殘基的至少一種原子)、更優選地涉及至少60個殘基、且甚至更優選地涉及至少100個或150個殘基。任選地，所述選定的坐標包括表1、表2、表3、表4或表5所示的一或多個配體或水分子的原子。腺苷酸環化酶總體而言具有一種雙結構域結構，這兩個結構域彼此具有相當程度的結構同源性，並類似於一種假二聚體。可溶性腺苷酸環化酶與藍細菌的III型腺苷酸環化酶關係最密切，後者以對稱同二聚體的形式發揮功能。所述同二聚體中的2個單體，或者所述假二聚體中的2個結構域，彼此可具有不同的方向，這取決於它們的活性中心的成分。因此，選定的坐標可以僅僅是N端結構域(殘基1-246)的那些坐標或者僅僅是C端結構域(殘基247-468)的那些坐標。另一方面，選定的坐標可以包括一或多個胺基酸殘基的原子或由其組成，所述原子是我們已經鑑定為構成如下文所述的solAC活性位點的主鏈或側鏈原子，且特別是表6中的那些(更特別地是表7中的那些)。在優選的實施方式中，當選定的坐標包括來自表6中所鑑定的殘基組、且更優選地來自表7中所鑑定的殘基組的至少一種原子時，所述選定的坐標包括來自這些優選組的至少2個、例如至少3個、更優選地至少4個、甚至更優選地至少5個、且最優選地所有胺基酸的至少一種原子。更優選地，所述選定的坐標包含來自這些殘基組的至少10個、更優選地25個、更優選地50個原子，其中至少一種原子來自所述組的每一成員。在另一方面，選定的坐標可以包括在表8、9、10、或11中所示的一或多個胺基酸殘基的原子或者由其組成。在另一個實施方式中，當選定的坐標包括來自表8、9、10、或11中所鑑定的殘基組的至少一種原子時，所述選定的坐標包括來自各表的至少2個、例如至少3個、更優選地至少4個、甚至更優選地至少5個、且最優選地所有胺基酸的至少一種原子。更優選地，選定的坐標包括來自這些殘基組的至少10個、更優選地25個、更優選地50個原子，其中至少一種原子來自這些表格中的任一表格所示的組的各個成員。或者，選定的坐標可以包括來自表6至11中的任一或者全體的至少10個、更優選地25個、更優選地50個原子，例如至少100個原子。在一個方面，選定的坐標可包括選自表6的胺基酸殘基(例如表7的殘基)的一或多個坐標和選自表8、9、10、或11的胺基酸殘基的一或多個坐標。在一個方面，選定的坐標至少來自表6(優選地表7)和表8。這些選定的坐標組在設計、開發和分析那些佔據ATP和碳酸氫根結合位點的配體中可能特別具有優勢。在另一方面，表8的優選殘基亞組是Lys95、Val167和Arg176。在此所述的本發明涉及表8殘基的胺基酸坐標的用途的方面中，也預期了來自這一亞組殘基的坐標的用途。此外，還預期了被鑑定為具有特異性配體相互作用的原子的坐標的用途(表1的原子1525，2585，2600，2729；表2的1525，2588，2603和2732；表3的937，1505，1508和1578；表4的1516，2678，2692和2821；表5的1516，2670，2684和2813)。在另一方面，表9的優選殘基亞組是His164、Phe165和Val335。在此所述的本發明涉及表9殘基的胺基酸坐標的用途的方面中，也預期了來自這一亞組殘基的坐標的用途。此外，還預期了被鑑定為具有特異性配體相互作用的原子的坐標的用途(表1的原子2536，2546，2565和5295；表2的原子2539，2549，2568和5298；表3的原子1482，1486，1489和2866；表4的原子2628，2639，2657和5413；表5的原子2620，2631，2649和5392)。在又一方面，選定的坐標可包括solAC的額外的部分螺旋結構域的一或多個胺基酸殘基的原子或者由其組成，與tmAC相比，該結構域似乎是solAC所獨有的。因此選定的坐標可包括殘基Met1至Tyr26或Lys219至Gly284的至少一種原子。優選地，選定的坐標包括殘基Ile13至His19、Phe226至Phe236、Asp258至Tyr268或Glu271至Ile277的至少一種原子。在這種情況中，更優選地，選定的坐標包括來自這些優選坐標的至少2個、例如至少3個、更優選地至少4個、甚至更優選地至少5個、例如至少10個以及最優選地所有胺基酸的至少一種原子。更優選地，選定的坐標包括來自這一組殘基的至少10個、更優選地25個、更優選地50個原子，其中所述原子來自不同胺基酸的前述優選值。選定的坐標優選地包括至少大約5％、更優選地至少大約10％的Cα原子。或者，或額外地，選定的坐標包括至少大約10％、更優選地至少大約20％、甚至更優選地至少大約30％的選自氮原子、Cα原子、C端氧原子和羰基氧原子的任意組合的主鏈原子。因此，下文所有提及「選定的坐標」之處，除非明確另外指出，均應按照如上所述進行理解。均方根差(rmsd)蛋白質結構相似性常規使用均方根差(rmsd)來表示和測量，其測量的是兩組原子之間空間定位的差異。均方根差測量的是最佳重疊之後等價的原子之間的距離。均方根差可基於所有原子、基於殘基主鏈原子(即蛋白質胺基酸殘基的氮-碳-碳主鏈原子)、僅基於主鏈原子(即蛋白質胺基酸殘基的氮-碳-氧-碳主鏈原子)、僅基於基因側鏈原子、或者更加常見的是僅基於Cα原子來計算。比較蛋白質結構的方法可參見MethodsofEnzymology，vol115，pg397-420。Rossman和Argos給出了計算均方根差的必要的最小二乘法代數(J.Biol.Chem.vol250，pp7525(1975))，不過現在已經有了更快的方法，見Kabsch(ActaCrystallogr.SectionA，A92，922(1976))；ActaCryst.A34，827-828(1978))，Hendrickson(ActaCrystallogr.SectionA，A35，158(1979))；McLachan(J.Mol.Biol.vol128，pp49(1979))和Kearsley(ActaCrystallogr.SectionA，A45，208(1989))。一些算法使用的是一種重複運算，其中將一個分子相對於其他分子進行移動，例如參見Ferro和Hermans(FerroandHermans，ActaCrystallographic，A33，345-347(1977))。其他方法則直接定位最佳適配，例如Kabsch的算法。用於確定均方根差的程序包括MNYFIT(其是一種稱為COMPOSER的程序集合的一部分，Sutcliffe，M.J.Haneef，I.Carney，D.andBlundell，T.L.(1987)ProteinEngineering，1，377-384)、MAPS(Lu，G.AnApproachforMultipleAlignmentofProteinStructures(1998，inmanuscriptandonhttp://bioinfo1.mbfys.lu.se/TOP/maps.html))。當比較明顯不同的坐標組時，更常見的是僅基於Cα原子計算均方根差值。但是，在分析側鏈運動時，也可基於所有原子計算均方根差。例如LSQKAB(CollaborativeComputationalProject4.TheCCP4SuiteProgramsforProteinCrystallography，ActaCrystallographica，D50，(1994)，760-763)、QUANTA(Jonesetal.ActaCrystallographyA47(1991)，110-119，並可購自Accelrys，SanDiego，CA)、Insight(可購自Accelrys，SanDiego，CA)、Sybyl_(可購自Tripos，Inc.StLouis)、O(Jonesetal.ActaCrystallographica，A47，(1991)，110-119)等程序以及其他一些坐標適配程序也可用於計算均方根差值。在例如LSQKAB和O程序中，用戶可定義為進行計算而配對的兩種蛋白質的殘基。或者，可通過產生兩種蛋白質的序列比對而確定殘基的配對，序列比對的程序詳見D節。然後根據這一比對和計算的均方根差值可重疊原子坐標。程序Sequoia(C.M.Bruns，I.Hubatsch，M.Ridderstr_m，B.Mannervik，andJ.A.Tainer(1999)HumanGlutathioneTransferaseA4-4CrystalStructuresandMutagenesisRevealtheBasisofHighCatalyticEfficiencywithToxicLipidPeroxidationProducts，JournalofMolecularBiology288(3)427-439)進行同源性蛋白質序列的比對並重疊同源性蛋白質原子坐標。比對之後可採用上述的程序計算均方根差。對應相同或者高度相同的序列，可採用人工方法或者如上所述的自動方法進行蛋白質結構比對。另一種方法可以不必考慮序列而產生蛋白質原子坐標重疊。在此所述的本發明的各個方面公開了表1、表2、表3、表4或表5中所有的或選定的坐標。類似地也公開了使用表1、表2、表3、表4或表5中所有的或選定的坐標而得到的結構及其用途，或者衍生自表1、表2、表3、表4或表5中所有的或選定的坐標的結構及其用途。在這些方面，表中的坐標可以變化，但均方根差不超過1.5_、優選地不超過1.4_、更優選地不超過1.2_、更優選地不超過1.0_、例如優選地不超過0.7_、更優選地不超過0.5_、更優選地不超過0.2_、甚至更優選地不超過0.1_。因此，除非另有指明，否則本文中所有對表1、表2、表3、表4或表5的坐標的引用均應被理解為包括不超過1.5_的均方根差變化，且變化的優選值已經在前面一段中給出。類似地，引用數值小於不超過1.5_的均方根差變化同樣應該理解為包括前面句子中給出的優選的、更窄的界限。為了避免歧義，在此對小於所述不超過1.5_的具體_數值以下的均方根差值的引用，應該被理解為包括不超過所述具體數值的上述優選的、更窄的界限。優選地，參照Cα原子計算均方根差，條件是在使用選定的坐標的情況下，它們包括至少大約5％、優選地至少大約10％的此類原子。如果選定的坐標不包括所述至少大約5％，可參照所有4種主鏈原子計算均方根差，條件是它們包括至少大約10％、優選地至少大約20％、且更加優選地至少大約30％的所述選定的坐標。如果選定的坐標包括90％或更多的側鏈原子，可以參照所有選定的坐標計算均方根差。配體在此，配體是一種虛擬的或者物理的結構，包括一或多個原子，能夠結合或者相互作用於本發明的solAC結構。此類原子包括有機分子中的那些原子，例如碳、氧、氫、氮、磷和硫，以及常見於生物學系統的金屬離子，例如鐵、鈣、鎂、錳、硒等等。用於本發明的配體可以是小的化學分子，它們的三維結構是現有技術中已知的，例如見於CambridgeStructuralDatabase(www.ccdc.cam.ac.uk)，其中有超過250,000種分子的結構，或者可以是基於特定的結構或其他標準已經設計或者選定其結構的配體。這些以及其他結構可用於例如目的在於篩選配體本發明的多個方面，用於開發與solAC相互作用的新的化合物，以調變例如活化或抑制其功能。對本領域人員顯而易見的是，儘管虛擬分子形式的配體可以做到與本發明的solAC結構的一或多個蛋白質原子相互作用，但這種相互作用在物理化合物本身與solAC之間可能並不發生。與solAC的催化結構域的一或多個原子結合或相互作用的配體特別有價值。配體可以是酶或者所述酶的底物的調變劑(如活化劑或抑制劑)。一種這樣的底物可以是前體藥物，通過腺苷酸環化酶的作用可將其轉化為活性藥物。配體結合通常通過非共價相互作用(但不排除其他方式)，例如通過氫鍵或類似方式。對本領域人員顯而易見的是，在基於計算機的分析方法或類似方法的情況中提及配體時，其指的是虛擬的分子結構，而在其他情況中(例如浸滲(soaking)solAC晶體等等)，配體是化合物。在本發明的一些方面中，通過計算機建模技術鑑定配體，然後再以化合物的形式提供，用於進一步分析。對化合物的分析，例如通過浸滲實驗或共結晶化實驗，通常會導致產生更多的配體，然後可通過本發明的基於計算機的方法對它們進行分析。可自多種來源獲得用於浸滲或共結晶化的候選配體。例如，可使用作為潛在的腺苷酸環化酶抑制劑而開發的化合物，以便證實其與solAC的相互作用，並由此改進配體以增強或者調變其活性。此類配體可包括下文會提到的腺嘌呤核苷酸類似物。或者，許多合成化合物文庫可購自不同的公司，包括MaybridgeChemicalCo.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，N.J.)、BrandonAssociates(Merrimack，N.H.)、和Microsource(NewMilford，Conn.)，而稀有化合物文庫可自Aldrich(Milwaukee，Wis.)獲得。組合文庫也是已知的並可製備。或者，也有細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物的文庫，例如PanLaboratories(Bothell，Wash.)或MycoSearch(N.C.)，其也可以通過本領域熟知的方法容易地製備。建議將分離自天然來源例如動物、細菌、真菌、包括葉子和樹皮的植物來源以及海洋樣品的化合物作為候選物，分析是否存在潛在的可藥用物質。可以理解，待篩選的藥用物質也可以自化學組合物或者人造化合物中衍生或合成而得到。特別有價值的配體是那些為製藥用途而開發的化合物。此類配體通常是有機分子，其分子量典型地為大約100至2000Da、更優選地為大約100至1000Da。此類配體包括肽及其衍生物、類固醇類化合物、抗炎藥物、抗癌藥物、抗菌或者抗病毒藥物、神經科藥物等等。原則上製藥領域正在開發的任何化合物均可用於本發明，以便促進其開發或進行進一步合理性藥物設計以改進其特性。其他有價值的配體是腺嘌呤核苷酸及其類似物。腺嘌呤核苷酸是腺苷的任何磷酸酯，即一磷酸腺苷(AMP)、ADP和ATP中的任一種。腺嘌呤核苷酸的類似物是保留腺嘌呤核苷酸的特徵性結構的任何化合物，例如核苷酸的片段或者核苷酸的分子變體，其能夠結合solAC的ATP結合袋。特徵性結構指的是所述類似物包含一或多個的嘌呤鹼基結構、糖殘基、以及單、二或三磷酸酯結構或其類似物。腺嘌呤核苷酸的片段包括任何一種腺苷磷酸酯的任何分子片段，所述片段能夠結合solAC的ATP結合袋。因此，腺嘌呤核苷酸的片段的實例為腺嘌呤(鹼基)、腺苷(核苷)、核糖(糖)、以及任何一種核糖磷酸酯(如核糖5』單磷酸酯、核糖5』二磷酸酯和核糖5』三磷酸酯中的任一種)。在腺嘌呤核苷酸的分子變體中，嘌呤鹼基結構可以是腺嘌呤衍生物，例如在8位發生取代的腺嘌呤(例如以滷素原子取代，產生8-溴ATP或8-溴AMP，或者以烷基取代)，或其中的環含有雜原子，或其中的鹼基是開環類似物，例如在ZMP(AICA核糖單磷酸酯)中。或者，或額外地，糖殘基結構可包括，例如，2』或3』羥基的修飾，例如被其他基團取代或基團的環化。此外，類似物的磷酸酯部分可以被修飾，例如以便為γ和β磷酸酯之間(例如腺苷-5′-[(β，γ)-亞氨基]三磷酸酯，AMPPNP)或為β和α磷酸酯之間(例如腺苷-5′-[(α，β)-亞甲基]三磷酸酯，AMPCPP)提供非水解基團。許多銷售商提供大量的類似物，例如JenaBioscienceGmbH(Jena，Germany)。此外，臨床上也在使用大量的腺嘌呤核苷類似物，也不是在抗病毒領域。例如，阿糖腺苷(也稱為腺嘌呤阿糖胞苷，或ara-A)是一種用於通過導向病毒聚合酶來治療皰疹病毒的腺嘌呤核苷類似物，而9-(3-羥基-2-膦醯基-甲氧基丙基)-腺嘌呤(也稱為HPMPA)是一種具有抗HIV活性的腺嘌呤衍生物(Pauwels，R.Balzarini，J.Schols，D.Baba，M.Desmyter，J.Rosenberg，I.Holy，A.DeClercq，E.PhosphonylmethoxyethylPurineDerivatives，ANewClassOfAnti-HumanImmunodeficiencyVirusAgents.AntimicrobAgentsChemother32(7)1025-1030(1988))。這些衍生物中有一些在體內被磷酸化成為三磷酸酯。腺嘌呤核苷酸及其類似物可用作配體，可對其進一步修飾以增強或降低它們與solAC的相互作用，例如用於開發新的藥物化合物。配體還可以是具有碳酸氫根或亞硫酸根類似物部分的化合物，這樣所述部分能夠與一或多個參與碳酸氫根結合的solAC原子配位。A.蛋白質晶體本發明提供人可溶性腺苷酸環化酶催化結構域的晶體。在又一方面，本發明提供可溶性腺苷酸環化酶催化結構域的晶體，所述晶體包含SEQIDNO3的第1至468位殘基或其具有1至10個胺基酸的取代、缺失或插入的變體。所述晶體可具有SEQIDNO3，任選地不包括His6標籤(即SEQIDNO3的1至469位)或其中His6標籤被具有4至20個胺基酸的標籤取代。所述標籤可包含更少或更多數量的組氨酸殘基，例如可以是His4、His5、His7或His8標籤。晶體可包含SEQIDNO3的1-468位殘基的等位基因或變體，仍保留在如本文所述的條件下形成晶體的能力。此類變體包括那些具有大量胺基酸取代的變體，例如將1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸以等量或者更少數量的胺基酸取代。下文進一步討論了包括突變體在內的變體的更多實例。在一個實施方式中，在此所述的本發明的晶體具有空間群P63，晶胞尺度為a＝b＝99.5_、c＝97.4_、和α＝β＝90.0°，γ＝120.0°。晶胞尺度可有5％的可變性。因此，具體的實例為a＝b＝99.51_、c＝97.13_；a＝b＝99.424_、c＝97.390_(如表1所示)；a＝b＝99.651_、c＝96.522(如表2所示)；a＝b＝99.673_、c＝96.824(如表3所示)；a＝b＝99.569_、c＝98.470(如表4所示)；a＝b＝99.291_、c＝97.753(如表5所示)。更通常而言，晶胞晶體尺度可在如下範圍104.475_＞a＝b＞94.525_，102.27_＞c＞92.53_。可採用所附實施例中描述的方法獲得此類晶體。本發明提供在沒有任何活性位點結合配體情況下生長成的solAC催化結構域晶體。因此本發明也包括solAC催化結構域的apo晶體。在此舉例說明的用於提供solAC晶體或共結晶通常可以提供可以大約3.5_或更好的解析度而分辨的solAC催化結構域晶體或共結晶。本發明因此還提供具有3.5_或更好的解析度的solAC催化結構域晶體或共結晶。在又一方面，本發明提供製備solAC催化結構域蛋白質晶體、特別是包含solAC的催化結構域或其變體的序列的solAC蛋白的方法，所述方法包括通過懸滴蒸汽擴散而生長晶體。本發明另一方面提供其中已經浸滲了配體的solAC催化結構域。此外，本發明提供用於製備solAC催化結構域與配體形成的複合體的晶體的方法，所述方法包括取得solAC催化結構域的晶體並將配體浸滲於其中。(i)突變體突變體是這樣一種solAC催化結構域蛋白，其特徵為在野生型solAC中進行至少一種胺基酸的取代、插入或缺失。此突變體可通過例如定點誘變或者摻入天然或非天然胺基酸而製備。本發明包括「突變體」，其中「突變體」指的是通過將天然或合成的solAC中的至少一個胺基酸殘基以不同的胺基酸殘基取代和/或通過在天然多肽內部或相應於solAC的多肽的N端和/或C端添加和/或缺失胺基酸殘基而獲得的多肽，且所述多肽與其所來源於的solAC具有基本上相同的三維結構。具有基本上相同的三維結構指的是具有一組原子結構坐標，所述原子結構坐標與表1、表2、表3、表4或表5的坐標的均方根差(rmsd)小於大約1.5_。突變體可以具有但不必需具有酶活性或催化活性。為了產生同源物或突變體，可將所述蛋白質中的胺基酸用特性相似的其他胺基酸取代，所述特性例如是疏水性、疏水運動、抗原性、形成或打開α-螺旋或β-摺疊結構的傾向性等等。在蛋白質的取代變體中，蛋白質序列中的至少一個胺基酸已經被去除，並在該位置插入了不同的殘基。胺基酸取代典型地涉及單個殘基，但也可以是成簇的，這取決於功能上的約束，例如晶體接觸的約束。優選地，胺基酸取代包括保守性胺基酸取代。在插入性胺基酸變體中，引入了一或多個胺基酸。這可以是氨基端和/或羧基端融合體，也可以是內部序列。氨基端和/或羧基端融合體的實例是親和標籤(如MBP或GST標籤)或表位標籤。不明顯幹擾solAC的三維結構的胺基酸取代、缺失和添加部分取決於solAC中發生取代、添加或缺失的區域。在分子的高度可變區域中，非保守性取代以及保守性取代均是可以的，而不會明顯破壞分子的三維結構。在高度保守的區域或者含有明顯的二級結構的區域中，保守性胺基酸取代是優選的。保守性胺基酸取代是本領域熟知的，包括基於有關胺基酸殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性上的相似性而作出的取代。例如，帶負電荷的胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸；帶正電荷的胺基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似的親水性值的不帶電極性首基的胺基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬醯胺、穀氨醯胺；絲氨酸、蘇氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。其他保守性胺基酸取代是本領域熟知的。在一些情況下，為了在編碼所述多肽的cDNA中產生方便的克隆位點以有助於純化所述多肽等而取代、缺失和/或添加胺基酸殘基可以是特別有利或方便的。此類不明顯改變solAC的三維結構的取代、缺失和/或添加對於本領域人員是顯然的。如上所述，本發明預期的突變體不必顯示出酶活性。實際上，幹擾solAC的催化活性但不明顯改變催化區域的三維結構的胺基酸取代、添加或缺失是本發明所特別預期的。此類結晶的多肽或自其獲得的原子結構坐標可用於鑑定那些與所述蛋白質結合的配體。本領域人員能夠容易地鑑定那些用於突變的殘基，並可通過定點誘變引入這些突變，例如採用Stratagene的QuikChangeTM定點誘變試劑盒或者盒誘變方法(見例如Ausubeletal.eds.CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，Inc.NewYork，andSambrooketal.MolecularCloningaLaboratoryManual，2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，(1989))。(ii)等位基因本發明預期「等位基因」，其中等位基因是由Bateson和Saunders於1902年為孟德爾遺傳學中彼此並列的性狀而創造的術語。現在該術語等位基因用於一種基因的兩種或者多種並列形式，它們導致產生不同的基因產物，且因此產生不同的表型。等位基因含有核苷酸改變，這些改變已經被發現可影響轉錄、剪接、翻譯、轉錄後修飾或翻譯後修飾，或者導致至少一個胺基酸改變。典型地，solAC的等位基因變體與相應的具體舉例說明的solAC蛋白將具有至少75％的序列相同性(更優選地，至少80％、85％、90％或95％的序列相同性)，其中序列相同性通過將所述多核苷酸的核苷酸序列對齊以達到最大的重疊和相同且序列缺口最少時比較所述核苷酸序列而確定的。更通常地，等位基因形式包含在野生型蛋白質中發生1-10個胺基酸改變、特別是1或2個胺基酸改變，或在DNA序列中發生1-30個核苷酸改變。在本發明所涉及的solAC-配體複合體以及solAC的突變體、同源物、類似物、等位基因形式、物種變體蛋白質的範圍內，可以形成此類蛋白質的晶體。本領域人員能夠認識到，在此提供的使solAC結晶化的條件可用於形成此類晶體。或者，本領域人員能夠基於這些條件來鑑定用於形成晶體的改良的條件。因此本發明涉及solAC晶體的各個方面可擴展至產生同源物、等位基因形式和物種變體的solAC突變體的晶體。(iii)solAC的純化為了獲得用於結晶化的足量蛋白質，有必要建立用於高水平表達和回收solAC的方案。在一個實施方式中，本發明提供用於產生solAC(例如包含SEQIDNO3的1-469位殘基的solAC或其突變體或變體)的方法，所述solAC任選地融合於C端或N端的標籤，所述方法包括在真核細胞培養物中表達所述solAC；在緩衝液中裂解培養物中的細胞，所述緩衝液包括10-100mMTrispH7.4-8.0(4℃)，0.3-0.5MNaCl，0-20％(v/v)甘油和2-5mMβ-巰基乙醇；和自培養物中回收solAC。更優選地，所述方法包括在緩衝液中裂解培養物中的細胞，所述緩衝液包括40-60mMTrispH7.4-7.6(4℃)，0.3-0.4MNaCl，5-15％(v/v)甘油和2-5mMβ-巰基乙醇；和自培養物中回收solAC。甚至更優選地，在所述培養物細胞中表達後，所述方法包括在緩衝液中裂解培養物中的細胞，所述緩衝液包括50mMTrispH7.5(4℃)，0.3MNaCl，10％(v/v)甘油和2-5mMβ-巰基乙醇；和自培養物中回收solAC。在上述方法中，真核細胞培養物可以使哺乳動物或昆蟲細胞培養物，特別是昆蟲細胞培養物。在一個實施方式中，solAC包含組氨酸標籤(例如包括大約4-10個、如6個組氨酸標籤)殘基，且回收solAC的步驟包括使solAC與螯合柱在用於所述標籤與柱結合的條件下結合，然後自所述柱洗脫所述蛋白質。在另一個實施方式中，所述solAC可包含GST標籤。本發明還提供組合物，其包含位於緩衝液中的solAC，特別是SEQIDNO3的solAC或其突變體或變體，所述緩衝液包括50mMTrispH7.5(4℃)，330mMNaCl，10％(v/v)甘油和1mMβ-巰基乙醇。在優選的實施方式中，所述solAC的濃度為10至40mg/ml，例如20至40mg/ml。優選地，所述solAC在這些優選的濃度仍保留單體形式。(iv)solAC的結晶化為了產生solAC催化結構域蛋白晶體，將最終的蛋白質在緩衝液中濃縮至～8-15mg/ml，所述緩衝液例如包括50mMTris，pH7.5，330mM氯化鈉，1mMβ-巰基乙醇和10％甘油，可使用商品化的濃縮裝置。通過懸滴或沉滴方法開始蛋白質結晶化，並通過針對多種蒸汽擴散緩衝組合物在4℃進行蒸汽擴散而使蛋白質結晶化。可採用微引晶(Microseeding)。在懸滴或沉滴中常規使用1∶1的蛋白質溶液和蒸汽擴散緩衝液，本發明也使用這一比率，除非另有指明。懸滴或沉滴的體積通常為大約0.5至2μl、例如大約1至2μl、優選地1μl。也可採用微批量(microbatch)方法進行結晶化。典型地，蒸汽擴散緩衝液包含100mM醋酸鈉pH4.8，200mM檸檬酸三鈉，14-17％PEG4000，10％甘油和3mMβ-巰基乙醇。可使用HamptonResearchScreening試劑盒、聚乙二醇(PEG)/離子篩、PEG柵、硫酸銨柵、PEG/硫酸銨柵或等等來準備結晶化的嘗試條件。可在結晶化條件中加入經確定可影響結晶化的添加劑。可在優化初步結晶化條件過程中使用添加劑篩，其中存在的添加劑可有助於樣品的結晶化，且所述添加劑可改善晶體的質量，例如在蛋白質結晶化中使用甘油、多元醇和其他蛋白質穩定劑的HamptonResearch添加劑篩(R.Sousa.Acta.Cryst.(1995)D51，271-277)或者二價陽離子(Trakhanov，S.andQuiocho，F.A.ProteinScience(1995)4，9，1914-1919)。此外，可在結晶化條件中加入去垢劑以改善結晶化表現，例如HamptonResearch的去垢劑篩中的離子型、非離子型以及兼性離子去垢劑(McPherson，A.etal.Theeffectsofneutraldetergentsonthecrystallizationofsolubleproteins，J.CrystalGrowth(1986)76，547-553)。此外還可使用引晶方法改善晶體質量。這些包括微引晶、條紋引晶(streakseeding)和大引晶(macroseeding)。可使用商品化引晶製備試劑盒，例如HamptonResearch的那些。B.晶體坐標在又一方面，本發明還提供可溶性腺苷酸環化酶催化結構域的晶體，其具有表1所示的三維原子坐標。表1給出了非對稱單元形式的、鑑定為包括原子1至7273的分子A的可溶性腺苷酸環化酶的催化結構域的原子坐標數據。在該表格的各行中，第二列表示原子編號，第三列表示原子，第四列為殘基類型，第五列為鏈別(chainidentification)(A或B)，第六列為殘基編號，第七、八和九列分別是所考慮的原子的X、Y、Z坐標，第十列是該原子的佔用(occupancy)，第十一列為該原子的溫度因子，第十二列為原子類型。表格中其餘的原子(7274-8726)是水，其原子以上述相同的格式鑑定。表1的原子坐標所定義的結構的優勢特徵在於它們具有大約1.7_的解析度。表2的原子坐標所定義的結構的優勢特徵在於它們具有大約1.9_的解析度。表3和表4的原子坐標所定義的結構的優勢特徵在於它們具有大約2.0_的解析度。表5的原子坐標所定義的結構的優勢特徵在於它們具有大約2.05_的解析度。表1的原子坐標所定義的結構的特別優勢在於它們描繪出一個具有未被配體佔據的活性位點的結構。在另一個方面，本發明還提供與分子AMPCPP形成複合體的可溶性腺苷酸環化酶催化結構域的晶體，其具有表2所示的三維結構。表2給出了solAC與AMPCPP的複合體的原子坐標，其中所述蛋白質被鑑定為包括編號為1-7289的原子的分子A，AMPCPP分子包括編號為7291-7339的原子，一個鈣離子被編號為7340，其餘的原子編號為7341-8307，它們均為水分子。在該表格的各行中，第二列表示原子編號，第三列表示原子，第四列為殘基類型，第五列為鏈別(chainidentification)(A或B)，第六列為殘基編號，第七、八和九列分別是所考慮的原子的X、Y、Z坐標，第十列是該原子的佔用，第十一列為該原子的溫度因子，第十二列為原子類型。表3給出了solAC與碳酸氫根的複合體的原子坐標數據。所述蛋白質被鑑定為包括編號為171-3909的原子的分子A。在該表格中，上述原子的前面是水分子(1-87和92-170)和碳酸氫根的原子(88-91)。表4給出了solAC與5-苯基-2H-[1，2，4]-三唑-3-硫醇(化合物1)的複合體的原子坐標數據，其中所述蛋白質被鑑定為包括編號為1-7499的原子的分子A，化合物1分子是原子7516-7534，而其後的分子是水。結構中還存在一個甘油分子，即原子7502至7514。表5給出了solAC與N-(3-苯氧基-苯基)-草醯酸(化合物2)的複合體的原子坐標數據，其中所述蛋白質被鑑定為包括編號為1-7478的原子的分子A，化合物2分子是原子7495-7523，而其後的分子是水。結構中還存在一個甘油分子，即原子7481至7493。關於solAC蛋白結構，表3-5各列的順序與表2一樣。表1、表2、表3、表4和表5均具有內部一致的格式。例如表1、2、4和5中，列出了各胺基酸殘基的原子的坐標，使得主鏈氮原子在第一，隨後是Cα主鏈碳原子，稱為CA，隨後是側鏈殘基的原子(根據標準的傳統方式命名)，而最後是蛋白質主鏈的碳和氧。表3中，蛋白質主鏈的碳和氧在側鏈殘基之前。表3還含有solAC結構的連續原子編號，而其他各表的編號採用計數蛋白質分子的氫原子的傳統方式。本領域人員也可採用或者偏好其他的文件格式，所述格式可包括這些原子的不同順序，或側鏈殘基和配體分子原子的不同命名。不過，採用不同文件格式來表示或者操作所述表格的坐標顯然屬於本發明的範圍。表1、表2、表3、表4或表5的坐標提供了以埃(Angstrom)為單位的原子位置測量值，保留3位小數。坐標是一組相關的位置，定義了一個三維的形狀，但本領域人員能夠理解的是，具有不同原點和/或坐標軸的一組完全不同的坐標卻可以定義相似的或相同的形狀。此外，如前面在「定義」部分所述，本領域人員能夠理解，改變所述結構的原子的相對原子位置使得均方根差小於1.5_，通常會得到與表1、表2、表3、表4或表5的結構基本相同的結構，無論是就其結構特徵而言，還是就其用於對solAC與配體之間的相互作用性進行基於結構的分析的用途而言。類似地，本領域人員能夠理解，改變各表中的水分子和/或配體分子的數量和/或位置一般不會影響所述結構用於對solAC與配體的相互作用進行基於結構的分析的用途。因此，對於在此所述的本發明個方面的目的，以下情況仍屬於本發明的範圍將表1、表2、表3、表4或表5的坐標轉移至不同的原點和/或坐標軸；所述結構的原子的相對原子位置或其選定的坐標發生變化，但使得所得到的改變的結構當重疊於表1、表2、表3、表4或表5所提供的坐標時，其均方根差小於1.5_；和/或水分子和/或配體分子的數目和/或位置發生變化。如上所述，表1、表2、表3、表4或表5的solAC結構的優選的選定的坐標可以是如下所述的已經被我們鑑定為構成solAC的活性位點的主鏈或側鏈原子的一或多個胺基酸殘基的原子。此類原子包括那些存在於表6、7、8、9、10或11(如表6、7或11)中所示的胺基酸中的原子的一或多個。各個表的優選的選定的坐標、或來自兩個或多個表的坐標的組合如在本申請其他部分所述一樣。通過表1或表2的坐標來描述可溶性腺苷酸環化酶的催化結構域結構。殘基Met1是在電子密度中能夠觀察到的第一個殘基，而Lys468是最後一個。靠近Met1的主鏈氮原子的電子密度峰可能是乙醯化引起的，沒有被建模。表1中不具有可判斷的主鏈密度的殘基是Trp135，Glu136，Glu137，Gly138，Leu139，Asp140，Phe350，Pro351，Gly352，Glu353，Lys354，Val355和Pro356。殘基Val469和C端His標籤在電子密度中是不可見的。靠近134位的首個斷點(firstbreak)的主鏈定義不清楚，而殘基132-134具有不均勻的(patchy)主鏈電子密度。殘基304-306和451-455的電子密度的定義不清楚。此外，模型周邊的一些殘基的側鏈被主觀放置，因為它們沒有可判斷的密度。Phe350在表2中是可見的。進一步解析了可溶性腺苷酸環化酶的催化結構域的結構，並且對於表1中的未被解析的殘基，這些結構中有一些也具有可判斷的密度，使得能夠獲得更加完整的表3，表4或表5的坐標數據。為了將本發明解決的哺乳動物可溶性腺苷酸環化酶的結構與以往發表的細菌可溶性腺苷酸環化酶的結構進行比較，計算了可溶性腺苷酸環化酶與鈍頂螺旋藻腺苷酸環化酶(PDBcode1wc1)(Steegborn，C.Litvin，T.Levin，L.R.Buck，J.andWu，H.(2005)Nat.Struc.AndMol.Biol.12，32-37)結構之間的均方根差。採用Comparer(SaliandBlundell(1990)JMolBiol.212，403-428)進行計算，以使所述結構和MNYFIT(Sutcliffeetal.1987)重疊，以使得重疊更加精確並計算均方根差。僅使用Cα原子的位置計算均方根差。將各個結構分解成其組成結構域以便進行重疊。這否定了結構域運動引起結構之間均方根差出現大的差異的問題。因此將可溶性腺苷酸環化酶的第一結構域(殘基36-216)重疊於鈍頂螺旋藻結構的B鏈，而將第二結構域(殘基287-465)重疊於C鏈。採用2.5_的截斷值來定義等價性(equivalence)(一個結構的Cα原子在被重疊的結構的Cα原子2.5_的範圍內即是等價的)。對於可溶性腺苷酸環化酶第一結構域，181個殘基中的116個被定義為與鈍頂螺旋藻結構的殘基等價，均方根差為1.2_。對於第二結構域，179個殘基中的127個被定義為與鈍頂螺旋藻結構的殘基等價，均方根差為1.4_。引起這些均方根差值以及以2.5_截斷值所鑑定到的低數目的等價殘基的原因在於連接二級結構元件的序列中有多個區域在長度和方向上有差異。對重疊的研究還發現螺旋α3的長度的差異，哺乳動物環化酶的螺旋α3要短幾個殘基，而這些分子的核心β-摺疊部分則很好地重疊，螺旋α2和α3的重疊差一些。因此，總體上，本發明的solAC結構的兩個結構域與鈍頂螺旋藻結構1wc1相比，總Cα原子的均方根差值明顯超過1.5_。這些酶的二級結構有一些不同，例如人可溶性腺苷酸環化酶與tmAC或鈍頂螺旋藻酶相比具有較短的β1鏈和較長的α1螺旋。solAC與tmAC類和鈍頂螺旋藻solAC兩者之間的主要區別在於存在一個額外的部分螺旋型結構域，其靠在假二聚體N端結構域的基底上。其由N端的殘基1-26組成，殘基1-12具有伸展的構象，13-19採用的是螺旋構象，其餘的殘基20-26與25-27延伸形成螺旋的一個轉彎。該結構域的其餘部分由殘基219-284形成。這包括將形成N端結構域中的β8、形成C端結構域中的β1、以及形成C端結構域中的α1的殘基。在殘基219-284中，殘基226-236、258-268和271-277形成3個螺旋。我們已經在solAC內部鑑定了若干個結合配體的區域。我們還發現，這些區域具有形成擴充的(expanded)配體結合位點的潛力，所述配體結合這些區域中的兩個或多個。我們鑑定區域為(a)ATP結合位點、(b)碳酸氫根結合位點、(c)通道結合位點、和(d)亞袋結合位點。此外，我們還鑑定了(e)，替代性的、潛在的別構位點。隨後的實施例中將對這些位點給出更加詳細的說明。(A)ATP結合位點此位點更多地被稱為solAC的活性位點，由活性位點殘基排列而成。下面的表6和7以單字母代碼的形式給出了本發明鑑定到的SolAC的活性位點殘基。表6solAC的活性位點殘基表7與腺苷部分相互作用的solAC的活性位點殘基。將與腺嘌呤基團形成氫鍵的殘基自排列成疏水袋側方的那些殘基中區分出來。(B)碳酸氫根結合位點我們對solAC結構的分析發現了一個碳酸氫根結合區域。SolAC的三個殘基與碳酸氫根離子相互作用，即Lys95、Val167和Arg176。使用一種具有帶負電荷的硫原子(該硫原子與HCO3-離子位於幾乎相同的位置)的化合物(5-苯基-2H-[1，2，4]-三唑-3-硫醇；″化合物1″)，我們鑑定到一個擴充的碳酸氫根結合位點，其形成一個大的袋，與ATP結合位點鄰近。該擴充的HCO3-結合位點指明了在設計solAC抑制劑或活化劑時可供開發的solAC結構的區域。表8給出了該擴充位點的殘基。表8碳酸氫根結合位點殘基在這些殘基中，我們發現1)Lys95的NZ與HCO3-的O1形成鹽橋(saltbridge)；2)Val167的主鏈NH與HCO3-的O1形成帶電氫鍵；3)Val167的主鏈羰基與HCO3-的OH形成氫鍵；4)Arg176的側鏈NH2與HCO3-的O3形成鹽橋；和5)Arg176的側鏈NH2與HCO3-的OH形成帶電氫鍵。在該擴充的碳酸氫根位點內，5-苯基-2H-[1，2，4]-三唑-3-硫醇的硫原子位於袋底部，並與Lys95的NZ形成鹽橋，且與Val167的主鏈NH和Phe336的主鏈NH形成帶電氫鍵。三唑的N6也與位於袋底部的Met337的主鏈羰基形成氫鍵。此外，三唑的N5與Arg176的NH2形成帶電氫鍵。化合物1的苯基伸入由Phe45、Lys95、Ala97、Ala100、Leu102和Phe336的側鏈所形成的化合物袋的主要為親脂性的區域內。在該化合物的苯基之後，該袋在敞開進入ATP結合位點之前輕度縮小。該擴充的HCO3-結合位點的形狀和在該化合物solAC複合體中所觀察到的相互作用的性質提示該位點適合於多種配體。(C)通道結合位點結合於solAC的N-(3-苯氧基-苯基)-草醯酸(″化合物2″)的晶體結構揭示了可能被開發用於藥物設計的solAC結構中的其他區域。化合物2的結合位點與化合物1中描述的擴充的HCO3-袋重疊，其使得化合物2的苯氧基佔據了與化合物1的苯基非常相似的位置。然而，化合物2誘導了位於HCO3-結合位點底部的Lys95的大的側鏈運動。該Lys95運動打開了HCO3-結合袋，形成一併入大的充水腔(cavity)的通道，然後開口於蛋白質表面與ATP結合位點相對的點上。以下殘基(表9)排列成這一新發現的通道表9通道結合位點化合物2的草醯酸基團最大程度地伸入該通道，與所述蛋白質形成若干相互作用1)化合物2的O3與His164的ND形成帶電氫鍵；2)化合物2的O1與Phe165的主鏈NH形成帶電氫鍵；3)化合物2的O5氫鍵結合於Val335的主鏈NH；和4)化合物2的醯胺N6氫鍵結合於Phe165的主鏈羰基。Lys95、Phe165、Leu166、Val167和Phe336的側鏈形成圍繞化合物2的中心苯胺基芳族環的親脂性環境。儘管化合物2的末端苯氧基結合於為化合物1所描述的相同的親脂性袋內，但由於化合物2引起包含Met337、Phe338、Asp339、Lys340和Gly341的環發生運動，該袋的環境被輕度改變。該環的運動將Phe338拖離ATP位點，到達化合物2的末端苯氧基的範德瓦耳斯距離範圍內。在apo、AMP-PNP和結合化合物1的solAC的結構中均沒有觀察到Phe338的這種運動。(D)亞袋結合位點對AMP-PNP複合體結構的進一步分析揭示，Phe338形成ATP位點的一端，靠近AMP-PNP核糖的羥基。Phe338的重新定位形成了與ATP結合位點鄰近的新的亞袋。該新的亞袋由以下殘基(表10)排列而成。表10亞袋殘基(E)solAC上的替代性結合位點solAC分子表面的疏水性裂縫形成了對稱相關分子N-末端的結合位點。N端甲硫氨酸的側鏈切入(slotinto)由Phe89、Phe230和Phe226的側鏈形成的疏水袋中。殘基1-4的主鏈則切入一溝槽中，該溝槽的一側由螺旋2末端的殘基形成，而另一側由來自包括殘基編號Lys246、Asn247、Leu248和Leu249的環的殘基形成，相對於鈍頂螺旋藻腺苷酸環化酶而言，這些殘基位於solAC的一個額外的結構域中。儘管無意於受到任何理論的局限，表11所示的上述這些殘基可形成別構位點，且因此這可以成為solAC的配體的進一步的靶點。表11替代性結合位點殘基複合體結構浸滲了AMPCPP的可溶性腺苷酸環化酶的結構為該蛋白質的核苷酸結合袋提供了結構信息，特別是為核苷酸的腺苷部分的核苷酸結合袋。該結構於是可用於構建類似的結構與solAC的相互作用模型，用於設計更加有效的調變劑，例如抑制劑或活化劑。更一般性而言，浸滲了其他配體的可溶性腺苷酸環化酶的結構提供了該蛋白質的其他結合袋的結構信息。solAC殘基的鑑定和用途solAC的晶體結構已經使得能夠精確鑑定所有在ATP結合袋區域內排列成該酶結合位點的殘基(表6)。因此，在本發明的一個優選的方面，其中本發明預期了選定的坐標在本發明的方法中用途，此類選定的坐標將包括選自表6的胺基酸殘基的至少一個坐標、優選地至少一個側鏈坐標。更優選地，所述選定的坐標包括選自表7的胺基酸殘基的至少一個坐標、優選地至少一個側鏈坐標。表6的殘基特別適合於設計小分子配體。同樣優選的是，無論是選定特定胺基酸的所有原子還是僅僅某些原子，所述選定的坐標的至少5個、更優選地至少10個、且最優選地至少50個來自相應數目的不同胺基酸殘基的側鏈殘基。這些可以排他性地選自表6、7或11。在其他實施方式中，其中本發明預期選定的坐標在本發明的方法中的用途，此類選定的坐標將包括選自表6、7或11中的胺基酸殘基的至少一個坐標、優選地至少一個側鏈坐標。C.嵌合體使用嵌合蛋白來實現所需的特性在科技文獻中是常見的。因此，solAC的變體可以是嵌合體。特別相關的情況是改進活性位點以便提供代用系統以獲得結構信息。例如，Ikuta等(JBiolChem(2001)276，27548-27554)改進了cdk2的活性位點，這樣他們便能夠獲得其結構數據，以模擬目前尚無任何X線結構的cdk4的結構。以這種方式，他們能夠自嵌合蛋白獲得蛋白質/配體結構，用於設計cdk4抑制劑。以類似的方式，基於比較有關solAC異構體的一級序列，可以改進本發明的solAC的結合位點以模擬那些異構體。可使用嵌合蛋白的蛋白質結構或蛋白質/配體結構，基於結構篩選出作為該有關的solAC異構體的配體的化合物。即使在此所述的solAC與其他異構體之間的胺基酸序列相同性百分比在20至80％的範圍，solAC蛋白的總體摺疊仍然可以預期是非常相似的，結構元件具有相同的空間分布。D.同源性建模本發明還提供對其他蛋白質(下文稱為靶腺苷酸環化酶蛋白)進行同源性建模的手段。「同源性建模」指的是採用計算機輔助從頭預測結構的方法，基於處理來自表1、表2、表3、表4或表5的坐標數據或其選定的坐標，來預測有關的腺苷酸環化酶結構。「同源性建模」延及靶腺苷酸環化酶蛋白，它們是經所附實施例已經確定其結構的solAC蛋白的類似物或同源物。其也延及solAC蛋白本身的蛋白質突變體。術語「同源性區域」描述的是兩個序列中那些相同的或者具有相似的(例如脂肪族、芳香族、極性、帶負電荷的或帶正電荷的)側鏈化學基團的胺基酸殘基。同源性區域中相同的和相似的殘基有時被本領域人員分別描述為是「不變的」和「保守的」。總體而言，所述方法涉及通過胺基酸序列比對而比較solAC蛋白與靶蛋白的胺基酸序列。然後比較序列中的胺基酸並匯總具有同源性的胺基酸群體(方便地稱為「相應區域」)。該方法檢測多肽的保守區域並考慮胺基酸插入和或缺失。可採用商品化的算法確定胺基酸序列之間的同源性。算法BLAST、缺口BLAST、BLASTN、PSI-BLAST、BLAST2和WU-BLAST(由NationalCenterforBiotechnologyInformation提供)被廣泛用於此目的，並可比對兩種或更多的胺基酸序列的同源性區域。可使用這些方法的默認參數來確定solAC和待建模的其他靶蛋白的胺基酸序列之間的同源性程度。優選地用於本發明的是WU-BLAST(WashingtonUniversityBLAST)版本2.0軟體。用於若干UNIX平臺的WU-BLAST版本2.0可執行程序可自ftp://blast.wustl.edu/blast/executables下載。該程序基於WU-BLAST版本1.4，後者則基於公共領域NCBI-BLAST版本1.4(AltschulandGish，1996，Localalignmentstatistics，Doolittleed.MethodsinEnzymology266460-480；Altschuletal.1990，Basiclocalalignmentsearchtool，JournalofMolecularBiology215403-410；GishandStates，1993，Identificationofproteincodingregionsbydatabasesimilaritysearch，NatureGenetics3266-272；KarlinandAltschul，1993，Applicationsandstatisticsformultiplehigh-scoringsegmentsinmolecularsequences，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877；allofwhichareincorporatedbyreferenceherein)。在所有成套的搜索程序中，缺口比對常規對於資料庫搜索本身而言是完整的。如果需要可關閉缺口。對於長度1的缺口的默認罰分(Q)為，對於蛋白質和BLASTP，Q＝9；對於BLASTN，Q＝10；但可以變為任何整數。對於缺口延伸的默認的每殘基罰分(R)為，對於蛋白質和BLASTP，R＝2；而對於BLASTN，R＝10，但可以變為任何整數。為了比對序列，可使用Q和R的任何組合值，以便使得重疊和相同性最大化，而使得序列缺口最小化。默認胺基酸比較矩陣是BLOSUM62，但也可採用其他胺基酸比較矩陣，例如PAM。類似物被定義為具有相似的三維結構和/或功能的蛋白質，在序列水平極少有共同始祖的證據。同源物是具有共同始祖證據的蛋白質，即很可能是進化趨異的產物，並基於序列相同性的程度(通常表示為百分數)而分為遠、中和近亞組(sub-divisions)。同源物在此的定義為與人solAC具有至少大約20％、例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、優選地至少60％、更優選地至少70％、更優選地至少80％、更優選地至少90％且更優選地至少95％序列相同性的蛋白質。這包括solAC的多態性形式和物種形式，包括下文表12和13中提及的那些物種。表12和13顯示哺乳動物可溶性腺苷酸環化酶之間的百分比相同性。表12哺乳動物可溶性腺苷酸環化酶之間的百分比相同性。在整個序列上進行比較。表13哺乳動物可溶性腺苷酸環化酶之間的百分比相同性。僅在催化結構域序列之間進行比較。有兩種類型的同源物直系同源物(orthologues)和平行進化同源物(paralogues)。直系同源物被定義為不同生物體內的同源性基因，即所述基因具有與產生它們的物種形成事件同時存在的共同始祖。平行進化同源物被定義為相同生物體內的、源自基因/染色體/基因組複製的同源性基因，即基因的共同始祖出現於最近的物種形成事件之後。同源物還可以是solAC的多態性形式，例如(A)部分所述的等位基因或突變體或(D)部分所述的嵌合體。一旦將結構已知和結構未知的多肽的胺基酸序列進行比對，便將結構已知的多肽的計算機圖象中的保守胺基酸的結構轉移至結構未知的多肽的相應的胺基酸。例如，結構已知的胺基酸序列中的酪氨酸可以被替換為苯丙氨酸，即結構未知的胺基酸序列內相應的同源性胺基酸。可以採用標準的肽幾何學或者通過分子模擬技術如分子動力學來人工指定位於非保守區域的胺基酸的結構。通過採用分子動力學和/或能量最小化使得整個結構更加精確，從而完成方法的最後步驟。這樣的同源性建模本領域人員熟知的技術(見例如Greer，(Science，Vol.228，(1985)，1055)和Blundelletal.(Eur.J.Biochem，Vol.172，(1988)，513)。可採用這些參考文獻所公開的技術以及通常現有技術中存在的其他同源性建模技術實施本發明。因此，本發明提供同源性建模的方法，包括以下步驟(a)將三維結構未知的靶solAC蛋白的胺基酸序列的圖象與表1、表2、表3、表4或表5或其選定的坐標的solAC的胺基酸序列進行比對，以匹配胺基酸序列的同源性區域，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；(b)在表1、表2、表3、表4或表5或其選定的坐標所定義的solAC結構的相應區域上構建所述結構未知的靶solAC的相匹配的同源性區域的結構的模型，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；和(c)確定所述結構未知的靶solAC的構象，所述靶solAC基本上保留所述相匹配的同源性區域的結構。所述結構未知的靶solAC的構象例如是在結構未知的靶腺苷酸環化酶內部形成有利的相互作用的構象和/或形成低能量構象的構象。優選地通過計算機建模進行步驟(a)至(c)的一個或所有步驟。表1、表2、表3、表4或表5的坐標數據或其選定的坐標對其他腺苷酸環化酶的同源性建模是特別有利的。在此所述的在矽片上(insilico)使用solAC結構的本發明的各個方面可同等地應用於通過本發明的上述方面獲得的腺苷酸環化酶的同源物模型，並且這一用途形成本發明的另一個方面。因此，採用上述方法確定腺苷酸環化酶的構象後，該構象可用於在此所述的基於計算機的合理性藥物設計方法中。E.結構解析solAC的原子坐標數據也可用於解析其他靶腺苷酸環化酶蛋白的晶體結構，包括solAC的其他晶體形式、solAC的突變體、共複合體，其中這些靶腺苷酸環化酶蛋白的X線衍射數據或NMR譜數據已經產生，需要解釋以提供結構。對於solAC，該蛋白質可以一種以上的晶體形式結晶化。本發明提供的表1、表2、表3、表4或表5的數據或其選定的坐標特別有助於解析solAC的其他晶體形式。其還可用於解析solAC突變體、solAC共複合體、或與solAC的任何功能結構域具有顯著胺基酸序列同源性的任何其他蛋白質的晶體形式的結構。對於其他靶腺苷酸環化酶蛋白，特別是同源性哺乳動物可溶性腺苷酸環化酶，例如來自表12和13中提及的物種的那些，在產生了最初的X線衍射數據的情況下，本發明使得能夠更容易地獲得此類靶的結構。因此，在提供了靶蛋白質腺苷酸環化酶或三維結構未知的solAC的X線晶體學數據或NMR譜數據的情況下，來自表1、表2、表3、表4或表5的原子坐標數據可用於解釋上述數據，通過本領域熟知的技術，例如X線結晶學中的定相(phasing)以及NMR譜中的輔助峰分配，為其他腺苷酸環化酶提供可能的結構。可用於這些目的的一個方法是分子置換。在該方法中，可採用本發明的表1、表2、表3、表4或表5的所有或部分solAC結構坐標來確定未知的晶體結構，無論其是另一種晶體形式的solAC、solAC突變體、solAC嵌合體或solAC共複合體、或與solAC的任何功能結構域具有胺基酸序列同源性的靶腺苷酸環化酶蛋白的晶體。與試圖從頭開始確定這些結構相比，該方法可更快地且更高效地為未知晶體提供準確的結構形式。本領域已知的用於進行分子置換的電腦程式是CNX(BrungerA.T.AdamsP.D.RiceL.M.CurrentOpinioninStructuralBiology，Volume8，Issue5，October1998，Pages606-611(也可購自AccelrysSanDiego，CA)，MOLREP(A.Vagin，A.Teplyakov，MOLREPanautomatedprogramformolecularreplacement，J.Appl.Cryst.(1997)30，1022-1025，partoftheCCP4suite)或AMoRe(Navaza，J.(1994)。AMoReanautomatedpackageformolecularreplacement.ActaCryst.A50，157-163)。因此，本發明的另一個方面提供與確定蛋白質結構的方法，該方法包括提供表1、表2、表3、表4或表5的坐標或其選定的坐標，所述表1、表2、表3、表4或表5的坐標任選地有變化，但均方根差小於1.5_；和或者(a)使所述坐標在所述蛋白質的晶體晶胞中定位以便提供所述蛋白質的結構，或者(b)通過操作所述坐標來分配所述蛋白質的NMR譜峰。優選地，表1、表2、表3、表4或表5的坐標或其選定的坐標，包括表6至11中任一(例如表6、7或11)所示的胺基酸殘基的原子坐標。各表中優選的選定的坐標或來自兩個或多個表的坐標組合如本申請其他部分所述。本發明還可用於通過操作表1、表2、表3、表4或表5的數據而分配此類蛋白質的NMR譜峰。在本發明的一個優選的方面，所述坐標用於解析靶腺苷酸環化酶的結構，特別是solAC的同源物，例如其他腺苷酸環化酶，且特別是來自不同物種的solAC異構體。F.計算機系統在另一方面，本發明提供系統，特別是計算機系統，用於產生以下各項的結構和/或對其進行優化與solAC、solAC同源物或類似物相互作用的配體、solAC與配體的複合體、或solAC同源物或類似物與配體的複合體，所述系統含有計算機可讀數據，所述數據包含以下一或多項(a)表1、表2、表3、表4或表5的solAC坐標數據或其選定的坐標，所述數據定義solAC催化結構域的三維結構；(b)基於表1、表2、表3、表4或表5的坐標數據通過對所述靶進行同源性建模而產生的靶腺苷酸環化酶蛋白的原子坐標數據；(c)通過參照表1、表2、表3、表4或表5的坐標數據解釋X線晶體學數據或NMR數據而產生的靶腺苷酸環化酶蛋白的原子坐標數據；(d)可自(b)或(c)的原子坐標數據導出的結構因素數據；和(e)表1、表2、表3、表4或表5的原子坐標數據或其選定的坐標，所述原子坐標數據任選地有變化，但均方根差小於1.5_。例如，所述計算機系統可包括(i)計算機可讀數據存儲介質，其包括編碼有所述計算機可讀數據的數據存儲材料；(ii)工作內存，用於存儲處理所述計算機可讀數據的指令；和(iii)中央處理器，其偶聯於所述工作內存並偶聯於所述計算機可讀數據存儲介質，用於處理所述計算機可讀數據並由此產生結構和/或進行合理性藥物設計。所述計算機系統可進一步包括偶聯於所述中央處理器的、用於顯示所述結構的顯示裝置。本發明還提供含有靶腺苷酸環化酶蛋白的原子坐標數據的此類系統，其中基於表1、表2、表3、表4或表5的數據或其選定的坐標所提供的初始數據，根據在此所述的本發明的方法已經產生了此類數據。此類數據有多種用途，包括產生結構以分析腺苷酸環化酶蛋白的作用機制和/或進行與solAC相互作用的配體的合理性藥物設計，例如被腺苷酸環化酶代謝的化合物。在另一方面，本發明提供計算機可讀存儲介質，包括編碼有計算機可讀數據的數據存儲材料，其中所述數據通過表1、表2、表3、表4或表5或其選定的坐標的solAC蛋白或solAC的同源物的結構坐標而定義，其中所述同源物包含的主鏈原子與來自所述表1、表2、表3、表4或表5或其選定的坐標的主鏈原子的均方根差小於1.5_。在又一方面，提供了計算機可讀存儲介質，其包括編碼有第一組計算機可讀數據的數據存儲材料，所述第一組計算機可讀數據包括由表1、表2、表3、表4或表5的結構或其選定的坐標所定義的solAC蛋白的結構坐標的至少一部分的傅立葉分析變換，所述表1、表2、表3、表4或表5的結構任選地有變化，但均方根差小於1.5_；所述數據當與包括結構未知的分子或分子複合體的X線衍射模式(pattern)的第二組機讀數據相組合時，利用由使用所述第一組數據和所述第二組數據的指令程序化的機器，可確定相應於第二組機讀數據的至少一部分結構坐標。在此，「計算機可讀介質」指的是計算機能夠直接閱讀或者存取的任何介質。此類介質包括但不限於磁性存儲介質如軟盤、硬碟存儲介質和磁帶；光學存儲介質例如光碟或CD-ROM；電存儲介質例如RAM和ROM；和上述類別的混合例如磁性/光學存儲介質。通過提供計算機可讀介質，可常規獲取到本發明的原子坐標數據以構建腺苷酸環化酶或其選定的坐標的模型。例如，RASMOL(Sayleetal.TIBS，Vol.20，(1995)，374)是一種公用計算機軟體包，其能夠用於獲取並分析原子坐標數據，用於結構確定和/或合理性藥物設計。在此，「計算機系統」指的是用於分析本發明的原子坐標數據的硬體、軟體和數據存儲裝置。本發明的基於計算機的系統的最少硬體包括中央處理器(CPU)、輸入裝置、輸出裝置和數據存儲裝置。希望提供顯示器以便顯示結構數據。數據存儲裝置可以是RAM或用於讀取本發明的計算機可讀介質的裝置。此類系統的實例是微電腦工作站。可來自SiliconGraphicsIncorporated和SunMicrosystems，運行Unixbased、WindowsXP或IBMOS/2作業系統。本發明還提供計算機可讀數據存儲介質，其包括編碼有第一組計算機可讀數據的數據存儲材料，所述第一組計算機可讀數據包括表1、表2、表3、表4或表5的solAC坐標或其選定的坐標；所述數據當與包括結構未知的分子或分子複合體的X線衍射模式的第二組機讀數據相組合時，利用由使用所述第一組數據和所述第二組數據的指令程序化的機器，可確定相應於第二組機讀數據的至少一部分電子密度。本發明的另一方面提供為產生與solAC、solAC同源物或類似物相互作用的配體、solAC與配體的複合體、或solAC同源物或類似物與配體的複合體的結構和/或對與solAC、solAC同源物或類似物相互作用的配體、solAC與配體的複合體、或solAC同源物或類似物與配體的複合體進行優化而提供數據的方法，所述方法包括(i)與遠程裝置建立通訊，所述遠程裝置含有(a)計算機可讀數據，包括表1、表2、表3、表4或表5的原子坐標數據或其選定的坐標，所述原子坐標數據任選地有變化，但均方根差小於1.5_，所述數據定義solAC催化結構域的三維結構或其選定的坐標；(b)基於(a)的數據通過對所述靶進行同源性建模而產生的靶腺苷酸環化酶同源物或類似物的原子坐標數據；(c)通過參照表1、表2、表3、表4或表5的數據來解釋X線晶體學數據或NMR數據而產生的蛋白質的原子坐標數據；和(d)可自(a)或(c)的原子坐標數據導出的結構因素數據；和(ii)接收來自所述遠程裝置的所述計算機可讀數據。在又一方面，本發明提供計算機用於產生solAC結構或solAC-配體複合體的三維圖象的用途，其中所述solAC結構來自表1、表2、表3、表4或表5或其選定的坐標，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_，其中所述計算機包括(i)計算機可讀數據存儲介質，其包括編碼有計算機可讀數據的數據存儲材料，其中所述數據包括表1、表2、表3、表4或表5的結構或其選定的坐標，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；(ii)將所述計算機可讀數據處理成所述三維圖象的指令。計算機還可包括用於顯示所述三維圖象的顯示裝置。接收自所述遠程裝置的計算機可讀數據，特別是當所述數據的形式為表1、表2、表3、表4或表5的原子坐標數據或其選定的坐標，且所述原子坐標數據任選地有變化，但均方根差小於1.5_時，可用於在此所述的本發明的方法，例如用於分析配體結構和solAC結構。因此，遠程裝置可包括例如本發明籤署各方面之一的計算機系統或計算機可讀介質。裝置可以在不同的國家或行政區，自該處收到計算機可讀數據。通訊可以通過網際網路、內部網、電子郵件等等，可通過有線或無線方式傳輸，例如地面電臺或衛星。典型地，通訊是電子的，但部分或全部通訊途徑可以是光學的，例如，通過光纖。G.本發明分結構的用途根據本發明獲得的晶體結構以及根據在此所述的方法獲得的靶腺苷酸環化酶蛋白的結構可用於多種藥物設計途徑。例如，可通過參照表1、表2、表3、表4或表5的坐標數據或其選定的坐標設計對solAC具有選擇性的配體，例如對solAC的核苷酸結合區域具有選擇性的配體。在一個方面，非環化核苷酸類似物AMPCPP能夠結合至多種不同腺苷酸環化酶的核苷酸結合袋中。使用本發明的solAC催化結構域的結構能夠設計出一些結構，與其他腺苷酸環化酶相比，它們對solAC具有更高的特異性。更通常地，本發明的結構可用於提供、設計、修飾或者分析solAC的調變劑。在此，solAC的「調變劑」指的是一種配體，其引起solAC蛋白的生物學活性水平的變化(即調變)。因此，調變涵蓋引起solAC活性升高或降低的生理學改變。在前一種情況中，調變可以稱為活化；對於後一種情況則是抑制。調變可以作為配體結合於solAC的ATP結合位點的結果而直接產生，或者可以間接地產生，例如通過配體結合於solAC的任何位點，由此影響solAC的活性或其與其他蛋白質的相互作用。所述相互作用可以包括與其他基因產物或蛋白質的相互作用，它們將solAC酶定位於特定的細胞器(例如線粒體、中心體、有絲分裂紡錘體、細胞核)，或引起solAC與效應分子(例如PKA)之間的相互作用，或者是酶活性的水平(例如通過別構機制、競爭抑制、活性位點失活、幹擾反饋抑制途徑等等)。因此，調變可以是由此類機制導致的solAC的過表達或低表達，以及配體結合於ATP結合位點、或碳酸氫根結合位點、或任何其他在此所述的位點所引起的高(或者低)活性。可相應地解釋所用的與solAC有關的術語「調變劑」、「調變作用」和「調變」。例如，可通過共結晶化、浸滲或計算配體對接而確定配體在結合袋中的結合方向的信息。這可指導對所設計的化學結構進行特定的修飾，以介導或控制配體與所述蛋白質的相互作用。此類修飾的目的可以是改進配體與solAC的相互作用，以便改善其治療作用。因此，確定solAC的三維結構為設計新的配體(例如與solAC相互作用的化合物)提供了基礎。例如，知道了solAC的三維結構，即可使用計算機建模程序設計不同的分子，用於與solAC的可能的或確定的活性位點相互作用，例如結合位點或solAC的其他結構或功能特徵。(i)獲得和分析晶體複合體在一種方法中，可通過實驗確定結合於solAC的配體的結構。這將是分析結合於solAC的配體的出發點，由此使得本領域人員能夠詳細了解特定的配體如何與solAC相互作用以及，例如，其與ATP競爭結合袋的機制。上述許多用於基於結構的藥物設計的技術和方法在一定階段依賴於X線分析以鑑定配體-蛋白質複合體中的配體的結合位置。這樣做的一個常規途徑是對複合體進行X線結晶學分析，產生差異傅立葉分析電子密度圖，並將特定的電子密度模式與配體相關聯。不過，為了產生所述的圖(有關解釋例如可見Blundelletal.inProteinCrystallography，AcademicPress，NewYork，LondonandSanFrancisco，(1976))，有必要事先知道蛋白質的3D結構(或者至少是蛋白質晶體的一組結構因子)。因此，確定solAC結構也使得能夠產生solAC-配體複合體的差異傅立葉分析電子密度圖，確定藥物的結合位置，並因此可極大地幫助合理性藥物設計的過程。因此，本發明提供用於確定結合於solAC的配體的結構的方法，所述方法包括提供solAC蛋白的晶體；以配體浸滲所述晶體以形成複合體；和採用表1、表2、表3、表4或表5的數據或其選定的坐標確定所述複合體的結構，所述數據任選地有變化，但均方根差不超過1.5_。或者，solAC和催化結構域與配體可以共結晶化。將純化的蛋白質樣品與潛在的配體溫育一段時間(通常＞1hr)。然後可篩選蛋白質配體複合體的結晶化條件。或者，可通過將晶體放入不含有配體的穩定化溶液中，對含有一個配體的蛋白質晶體進行反向浸滲(back-soak)，以去除配體。所得晶體然後可轉移至含有不同配體的第二溶液中。因此本發明提供用於確定結合於solAC的配體的結構的方法，所述方法包括將solAC蛋白與配體混合；使solAC蛋白-配體複合體結晶化；和採用表1、表2、表3、表4或表5的數據或其選定的坐標確定複合體的結構，所述數據任選地有變化，但均方根差小於1.5_。可用化合物的混合物浸滲晶體或與晶體共結晶，其中這些化合物中僅有一種或者一些預期可結合於solAC。所述化合物的混合物可包括已知結合於solAC的配體。與複合體的結構一樣，然後確定複合的化合物的性質。所述方法還可包括進一步的步驟(a)獲得或合成所述候選配體；(b)形成solAC與所述候選配體的複合體；和(c)通過X線結晶學或NMR譜來分析所述複合體，以確定所述候選配體與solAC相互作用的能力。對此類結構的分析可採用(i)來自所述複合體的X線結晶學衍射數據，和(ii)solAC的三維結構或至少其選定的坐標，以產生複合體的差異傅立葉分析電子密度圖，三維結構通過表1、表2、表3、表4或表5的原子坐標數據或其選定的坐標而定義。差異傅立葉分析電子密度圖隨後可用於分析。因此，此類複合體可結晶化並採用X線衍射方法進行分析，例如根據Greeretal.(J.ofMedicinalChemistry，Vol.37，(1994)，1035-1054)的方法，而差異傅立葉分析電子密度圖可基於浸滲的或共結晶的solAC的X線衍射模式以及已解析的非複合的solAC的結構而計算。然後可對這些圖進行分析，例如用於確定特定配體是否以及在何處結合於solAC和/或改變solAC的構象。電子密度圖可通過程序進行計算，例如來自CCP4計算軟體包(CollaborativeComputationalProject4.TheCCP4SuiteProgramsforProteinCrystallography，ActaCrystallographica，D50，(1994)，760-763.)的那些程序。對於顯示圖以及建模而言，可使用例如「O」(Jonesetal.ActaCrystallographica，A47，(1991)，110-119)的程序。此外，根據本發明，solAC突變體可與已知的solAC配體或新的配體共結晶化於共複合體中。然後可通過分子置換解析一系列此類複合體的晶體結構，並與表1、表2、表3、表4或表5的solAC結構或其選定的坐標相比較。由此可以鑑定所述酶的不同結合位點內的用於修飾的潛在位點。這一信息為確定solAC和配體之間最高效的結合相互作用，例如，增強的疏水性相互作用，提供了一種額外的工具。可採用熟知的X線衍射技術來研究上述所有的複合體，並對照1.5至3.5_解析度的X線數據使其更加精確，達到R值為大約0.30，或者可採用較少使用的計算機軟體，例如CNX(Brungeretal.CurrentOpinioninStructuralBiology，Vol.8，Issue5，October1998，606-611，且可購自Accelrys，SanDiego，CA)，andasdescribedbyBlundelletal，(1976)andMethodsinEnzymology，vol.114&115，H.W.Wyckoffetal.eds.AcademicPress(1985)。這一信息因此可用於優化已知類型的solAC配體，且更重要的是，用於設計併合成新類型的solAC配體，特別是抑制劑或活化劑，以及用於設計具有改善的solAC相互作用的藥物。(ii)矽片上分析和設計儘管本發明有助於確定包含solAC催化結構域和與所述solAC催化結構域相互作用的配體的真實晶體結構，但目前的計算技術提供了一種強有力的替代方法來滿足產生此類晶體和分析衍射數據的需求。因此，本發明的一個特別優選的方面涉及基於計算機(「矽片上(insilico)」)的方法，其目的在於分析和開發與本發明的solAC結構相互作用的配體。確定solAC催化結構域的三維結構提供了關於solAC的結合位點的重要信息，當與相似的酶進行比較時尤為如此。隨後，例如通過為結合位點鑑定可能的結合配體的計算技術、通過實現藥物設計的連接片段方法(linked-fragmentapproaches)、以及通過採用X線晶體學分析實現所結合的配體的鑑定和定位，這種信息可用於solAC配體的合理性設計和改進。下文對這些技術進行更加詳細的討論。因此，作為確定solAC三維結構的結果，也可使用更純粹的合理性藥物設計計算技術來設計那些對其與solAC的相互作用有了更多了解的結構。關於這些技術的綜述請參見例如Waltersetal(DrugDiscoveryToday，Vol.3，No.4，(1998)，160-178；Abagyan，R.Totrov，M.Curr.Opin.Chem.Biol.2001，5，375-382)。例如，可運用自動化配體-受體對接程序(見例如Jonesetal.inCurrentOpinioninBiotechnology，Vol.6，(1995)，652-656andHalperin，I.Ma，B.Wolfson，H.Nussinov，R.Proteins2002，47，409-443)，其需要靶受體的原子坐標的精確信息。在此所述的在矽片上利用solAC結構的本發明的各個方面可同等適用於表1、表2、表3、表4或表5的solAC結構或其選定的坐標以及通過本發明的其他方面獲得的靶腺苷酸環化酶蛋白模型。因此，通過上述方法確定了solAC的構象之後，該構象即可用於在此所述的基於計算機的合理性藥物設計方法中。此外，得到solAC的結構將允許產生用於虛擬文庫篩選或配體設計的具有高度預測性的藥效團模型。因此，本發明提供用於分析配體與solAC結構的相互作用的方法，其包括提供表1、表2、表3、表4或表5的solAC結構或其選定的坐標，所述solAC結構任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；提供待與所述solAC結構或其選定的坐標相適配的配體；和使所述配體與所述solAC結構相適配。本發明的這一方法廣泛適用於對已知的solAC配體進行分析、開發或發現solAC配體、修飾solAC的配體，例如提高或改進它們的一或多個特性，等等。實施本發明的方法時，可根據本領域已知的標準技術在計算機模型中再現表1、表2、表3、表4或表5的solAC結構或其選定的坐標。本領域人員熟習在這些方法中提供蛋白質三維圖象的方法。合適的模型包括(a)線框模型(wire-framemodel)；(b)網狀模型(chicken-wiremodel)；(c)球棍模型；(d)空間填充模型；(e)棍狀模型(stick-model)；(f)帶狀模型；(g)活動輪廓模型(snakemodel)；(h)箭頭圓柱模型(arrowandcylindermodel)；(i)電子密度圖；或(j)分子表面模型。選定的坐標可來自表6至11中任一(例如表6、7或11)所列出的一些或全部胺基酸的一或多個側鏈或主鏈原子，其中這些坐標的優選的數目和組合在本文其他部分描述。在另一個方面，本發明的方法可利用solAC配體結合區域的感興趣的原子的坐標，這些原子鄰近推定的配體結構，例如位於催化區域的10-25_範圍內，或位於結合的配體的5-10_範圍內，以便構建所述結構結合於其中的袋的模型。這些坐標可用於定義一個空間，隨後如上所述在矽片上對其進行分析。實踐中，希望構建的模型有足夠數目的由表1、表2、表3、表4或表5的坐標或其選定的坐標所定義的solAC的原子，所述原子代表結合袋，例如表6至11中任一(例如表6、7或11)所鑑定的殘基的原子。各表的優選的選定的坐標或來自兩個或多個表的坐標的組合在本文其他部分描述。結合袋以及solAC與配體相互作用的其他特徵在所附實施例中描述。儘管solAC結合的每一種不同配體可與該蛋白質的結合袋的不同部分相互作用，但solAC的結構允許鑑定多個特定位點，它們可能參與solAC與候選藥物之間相互作用的多個方面。表6至11，例如表6、7、或11，給出了所述殘基。因此，在本發明的這一方面，選定的坐標可包括這些殘基的一些或全部殘基的坐標。各表的優選的選定的坐標或來自兩個或多個表的坐標的組合在本文其他部分描述。為了提供待與本發明的solAC結構相適配的配體的三維結構，可使用用於此目的的商品化軟體來構建三維的配體結構，或者如果已經有了其晶體結構，可使用所述結構的坐標來提供用來與本發明的solAC結構進行適配的配體的圖象。可合成新設計的配體結構，可確定或預測它們與solAC的相互作用，這些新設計的結構如何被所述solAC結構結合。可重複這一方法以便進一步改變其與solAC的相互作用。「適配(fitting)」指的是以自動或者半自動的方式確定候選分子的一或多個原子與本發明的solAC結構的至少一個原子之間的相互作用，並計算此類相互作用的溫度程度。相互作用包括吸引和排斥、由電荷、空間、親脂性等因素引起的，等等。可提供計算來構建此類電荷和空間相互作用的模型。此類計算的實例可通過力場，例如Amber(Cornelletal.ASecondGeneration力場fortheSimulationofProteins，NucleicAcids，andOrganicMolecules，JournaloftheAmericanChemicalSociety，(1995)，117(19)，5179-97)，其能夠將部分電荷分配給蛋白質和配體上的原子，並使用Coulomb電勢評價蛋白質和配體原子之間的靜電相互作用能。Amber力場還可分配範德瓦耳斯能以評價兩個原子之間的吸引性和排斥性空間相互作用。可採用多種方式構建親脂性相互作用模型。例如，ChemScore功能(EldridgeMD；MurrayCW；AutonTR；PaoliniGV；MeeRPEmpiricalscoringfunctionsI.Thedevelopmentofafastempiricalscoringfunctiontoestimatethebindingaffinityofligandsinreceptorcomplexes，Journalofcomputer-aidedmoleculardesign(1997Sep)，11(5)，425-45)將蛋白質和配體原子分為疏水性或極性，兩個疏水性原子之間的相互作用具有有利的能量期。評價疏水性對配體結合的作用的其他方法是本領域人員已知的。評價相互作用的其他方法是分子設計領域的人員已知的。在此將進一步描述基於計算機的適配方法。更具體地，可通過使用計算機建模來檢測配體與本發明的solAC結構的相互作用，使用的對接軟體例如為GOLD(Jonesetal.J.Mol.Biol.245，43-53(1995)，Jonesetal.J.Mol.Biol.267，727-748(1997))，GRAMM(Vakser，I.A.Proteins，Suppl.1226-230(1997))，DOCK(Kuntzetal，(1982)J.Mol.Biol.161，269-288；Makinoetal，(1997)J.Comput.Chem.18，1812-1825)，AUTODOCK(Goodselletal，(1990)Proteins，8，195-202，Morrisetal，(1998)J.Comput.Chem.19，1639-l662.)，FlexX，(Rareyetal，(1996)J.Mol.Biol.261，470-489)或ICM(Abagyanetal，(1994)J.Comput.Chem.15，488-506)。這一過程可包括用計算機將配體與solAC進行適配，以證實怎樣的配體形狀和化學結構將結合於solAC。還可對solAC的活性位點結構進行計算機輔助的人工檢測。可使用的軟體例如為GRID(Goodford，(1985)J.Med.Chem.28，849-857)，該程序確定具有不同官能團的分子與酶表面之間的可能的相互作用位點，該程序也可用於分析活性位點以預測，例如，可能改變配體代謝率的修飾類型。可使用電腦程式來估計兩個結合配偶體(即solAC結構和配體)的吸引、排斥、和空間位阻。如果表徵了一個以上的solAC活性位點袋，並設計或選定了多個相應的較小的配體，則可通過將相應的小配體連接成更大的配體而形成配體，而其仍然保持各個配體在其活性位點的相應的位置和方向。可作為真實的分子或通過計算機建模而形成所述更大的配體。然後可獲得關於配體與solAC結合的更詳細的結構信息，且基於這些信息可對配體的結構或功能性進行調整，例如改變其與solAC的相互作用。必要時，上述步驟可以重複並再重複。在另一方面，本發明提供用於鑑定調變solAC活性的配體的方法，包括以下步驟(a)使用表1、表2、表3、表4或表5的三維原子坐標數據或其選定的坐標，所述三維原子坐標數據任選地有變化，但均方根差不超過1.5_，以表徵至少一種solAC結合位點且優選地多個solAC結合位點；(b)提供候選配體的結構；(c)將候選配體與所述一或多個結合位點進行適配；和(d)選擇與所述一或多個位點適配的候選配體。在一個實施方式中，篩選或探查多個候選配體與結合位點的相互作用。在一個實例中，步驟(b)包括提供候選配體的結構，然後將其中的每一個在步驟(c)中適配，以便在資料庫中(如CambridgeStructuralDatabase)以計算方式篩選與結合位點相互作用的化合物，即可通過以計算方式篩選資料庫中與結合位點相互作用的配體而選擇候選配體(見Martin，J.Med.Chem.vol35，2145-2154(1992))。在另一個實例中，產生了配體的3-D描述符，該描述符包括例如來自結構以及結合腔的化學特性的幾何學和功能約束。該描述符隨後可用於探查化合物資料庫，鑑定的配體是與該描述符的特徵相匹配的化合物。實質上，該描述符是一類虛擬藥效團。如上所述，可與本發明的solAC結構適配的配體包括正在開發作為潛在藥用物質的化合物。可適配這些物質以確定solAC的作用如何修飾該物質並提供用於候選配體建模的基礎，所述候選配體例如與ATP競爭結合於solAC。獲得並表徵本發明的配體化合物之後，本發明還提供調變solAC活性的方法，該方法包括(a)在如下條件下提供solAC，所述條件為在無配體的情況下，所述solAC能夠結合於ATP；(b)提供配體化合物；和(c)確定在存在所述化合物的情況下，solAC結合ATP的能力(例如通過競爭)被改變的程度。(iii)分析和修飾配體如果已知配體調變或疑似調變solAC的作用，則可對配體的結構進行建模以更好地確定與配體相互作用的solAC的殘基。本發明還提供預測可作用為solAC配體的其他配體的方法，該方法包括將所述配體與solAC催化結構域的三維結構或其選定的坐標相適配，所述三維結構由表1、表2、表3、表4或表5的坐標或其選定的坐標定義，所述坐標任選地有變化，但均方根差小於1.5_；確定或預測所述配體結合於所述催化結構域的情況；和修飾配體結構以便增強或降低其與催化結構域的相互作用。典型地，修飾配體的目的是產生相對於初始配體更加有效的配體，或是產生具有更好藥用可接受性的配體。本領域人員能夠理解，對結構的修飾將通常在矽片上發生，以允許對所修飾的結構與solAC相互作用的情況進行預測。Greeretal.(Greeretal.(1994)，J.ofMedicinalChemistry，37，1035-1054)公開了一種配體設計的重複方法，其基於計算機建模的重複序列、蛋白質-配體複合體形成以及X線晶體學或NMR譜分析。由此Greeretal從頭設計出了胸核苷酸合酶抑制劑，solAC配體也可以這種方式設計或修飾。更具體而言，在已解析的solAC結構上使用例如GRID，可設計互補solAC結合位點的功能性的solAC配體。或者，可修飾solAC配體以便其更好地或差一些地互補solAC結合位點的功能性。然後可以合成配體，與solAC形成複合體，然後提供X線結晶學分析複合體以鑑定所結合的配體的真實位置。必要時根據X線分析結果可隨後調整配體的結構和/或官能團，然後重複合成和分析序列直至獲得優化的配體。相關的基於結構的藥物設計方法也可參見Bohaceketal.(1996)MedicinalResearchReviews，16，3-50。採用基於結構的藥物設計來設計具有替代性solAC特性的配體也可考慮對第二種靶蛋白具有高親和力的需求。Gschwendetal.(Gschwendetal.(1999)，.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，9，307-312)和Bayleyetal.(Bayleyetal.(1997)ProteinsStructure，FunctionandGenetics，29，29-67)描述了採用基於結構的藥物設計方法來降低與一種蛋白質的親和力而保持與靶蛋白的親和力。所述修飾對於本領域人員是常規的，並包括例如，取代或去除含有與本發明的solAC結構的胺基酸側鏈基團相互作用的基團的殘基。例如，置換可包括添加或去除基團以降低或提高測試化合物中基團的電荷，置換基團以增加或減小測試化合物中基團的大小，以帶相反電荷的基團置換帶電荷基團，或以親水基團置換疏水基團或者反之亦然。可以理解這些僅僅是這一類型取代的實例，新藥化合物研發中的醫藥化學家會對此加以考慮，根據初始化合物的特性和活性，也可進行其他修飾。如果通過將初始配體適配於本發明的solAC結構並由此預測修飾的配體已經開發出一種有潛力的修飾配體，則本發明還包括合成所述修飾的配體以及在體內或體外生物學系統中對其進行測試的步驟，以便確定其活性和/或作為solAC配體的有效性。本發明的上述方法可重複，因為修飾的配體本身可作為進一步配體設計的基礎。上述方法還可用於修飾在solAC結合袋中與第二配體相互作用的配體。(iv)分析結合袋區域內的配體在一個實施方式中，本發明提供用於修飾配體結構的方法，所述方法包括將所述配體與solAC催化結構域三維結構或其選定的坐標進行適配，所述三維結構由表1、表2、表3、表4或表5的坐標或其選定的坐標定義，所述坐標任選地有變化，但均方根差小於1.5_；和修飾配體結構以便增強或降低其與催化結構域的相互作用，其中所述適配是針對配體結合區域，其被定義為包括表6至11中任一(例如表6、7、或11)給出的胺基酸殘基的至少一個坐標。各表的優選的選定的坐標或來自兩個或多個表的坐標的組合在本申請其他部分描述。典型地，修飾配體的目的是改善其抑制的有效性或藥用可接受性。為避免誤解，術語「改善」的定義如前所述，而當這種配體開發出來之後，可如上所述合成並測試。(vi)片段連接和生長提供本發明的晶體結構還可允許基於片段連接或片段生長方法而開發出與solAC催化結構域的結合袋區域相互作用的配體(例如作為配體，特別是solAC的抑制劑或活化劑)。例如，一或多個配體片段的結合可通過X線結晶學在蛋白質結合袋中確定。配體片段典型地是分子量在100和200Da之間的化合物(Carretal，(2002)DrugDiscovToday.May1；7(9)522-7)。這些可作為醫藥化學的起始點，用於採用基於結構的方法優化相互作用。這些片段可在模板上組合或用作使配體「長出」進入蛋白質的袋內的起始點(Blundelletal；NatRevDrugDiscov.(2002)Jan；1(1)45-54)。片段可放置於solAC的結合袋內，然後「長成」充滿可達到的空間，揭示靜電、範德瓦耳斯或氫鍵相互作用參與分子識別。因此，採用重複性基於結構的化學合成法，原本僅微弱結合的片段的效力被迅速提高。在片段生長方法的一或多個階段，可合成配體並在生物學系統內測試其活性。這可用於指導片段的進一步長出。如果鑑定了兩個片段結合區域，可基於連接片段方法試圖直接連接兩個片段，或如上所述生長一個或兩個片段以獲得更長的、連接的結構，其可具有所需的特性。連接片段方法可用於例如設計佔據ATP結合位點和碳酸氫根結合位點的配體。該配體佔據至少兩個位點的部分，與僅佔據ATP結合位點的配體相比，其對solAC可具有更好的選擇性。如果確定了兩個或多個配體的結合位點，可將它們連接以形成潛在的前導化合物，可使用例如Greeretal的重複技術使其進一步精確。虛擬的連接片段方法可參見Verlindeetal.(Verlindeetal.(1992)J.ofComputer-AidedMolecularDesign，6，131-147)，而NMR和X線方法可參見Shukeretal.(Shukeretal.(1996)Science，274，1531-1534)和Stoutetal.(Stoutetal.(1998)Structure，6，839-848)。solAC結構的確定使得採用這些方法來設計solAC配體成為可能。(vii)本發明的化合物如果根就本發明的方法鑑定到了本發明的solAC催化結構域結構的潛在配體，則本發明還包括合成所鑑定的配體並在體內和體外生物學系統中對其進行測試，以確定其活性和/或有效性。本發明在這一方面優選地還包括以下步驟獲得或合成配體；和使候選配體與solAC接觸以確定候選配體與solAC相互作用的能力。例如，在上述的接觸步驟中，使候選配體與solAC在存在底物(通常是ATP)以及典型地緩衝劑的條件下接觸，以確定所述候選配體結合solAC，例如抑制solAC的能力。此類方法之一是基於免疫分析的HTRF，其中solAC產生的cAMP和XL-665-標記的cAMP競爭性結合抗cAMP抗體，其標記了Eu-cryptate(http://www.htrf-assays.com；GabrielD，VernierM，PfeiferMJ，DasenB，TenaillonL，BouhelalR.(2003)Assay&DrugDev.Techno1.2291-303)。因此，例如，可產生solAC的分析混合物，其包括候選配體、底物和緩衝劑。更優選地，在後面的步驟中，將候選配體與solAC在用於確定其功能的條件下接觸。或者，或額外地，所述方法還可包括以下步驟獲得或合成所述配體；形成solAC蛋白或其催化結構域與所述配體的複合體；和提供X線結晶學分析所述複合體以確定所述配體與solAC相互作用的能力或其催化結構域。這些步驟可用於在導致設計進一步的配體的重複方法中鑑定能夠適配於本發明的結構的配體。例如，在上述接觸步驟中，使候選配體與solAC在存在底物以及典型地緩衝劑的條件下接觸，以確定所述候選配體結合solAC，例如抑制solAC的能力。因此，例如，可產生solAC的分析混合物，其包括候選配體、底物和緩衝劑。在另一方面，本發明包括化合物，其是通過在此所述的本發明的方法鑑定的solAC配體。鑑定這種化合物後，可生產和/或將其用於製備，即製造或者配製，組合物，例如藥劑、藥物組合物或藥物。這些可施用於個體。因此，本發明在各方面不僅延伸至本發明的化合物，也延伸至藥物組合物、藥物、藥劑或其他包含該化合物的組合物。所述組合物可用於治療(其可以包括預防性治療)疾病例如癌症、炎症、骨質疏散症、糖尿病、青光眼或不育症。該組合物也可用於避孕方法，例如用於抑制精子運動或受孕過程。術語「治療」在此就治療疾病或病症而言，廣泛涉及處理和治療，無論是人還是動物(例如在獸醫學中)，在其中達到了某種所需的治療效果，例如，抑制病症的進展、且包括進展速度降低、中斷其進展、病症減輕、以及疾病或病症的治癒。本發明還包括作為預防措施的治療(即預防)。術語「治療有效量」在此涉及一種活性化合物或者物質、組合物或包括活性化合物的劑量形式的量，當以合適的治療方案施用時，其能夠有效產生某些所需的治療效果，相稱的合理的獲益/風險比。術語「治療」包括治療的組合，其中兩個或多個處理或治療相組合，例如，貫序地或同時地。本發明的化合物或者根據本發明獲得的化合物包括作為solAC活性的抑制劑的化合物。因此，預期它們可用於提供防止和/或實現精子運動和運動過度(hypermotility)獲能和頂體反應。因此預期所述化合物可被證實可用於治療一些形式的雄性不育或無精和/或防止卵母細胞受孕和懷孕。可治療的癌症的實例包括但不限於癌，例如膀胱、乳腺、結腸(例如結直腸癌如結腸腺癌和結腸腺瘤)、腎臟、表皮(epidermus)、肝臟、肺例如腺癌、小細胞肺癌和非小細胞肺癌、食道、膽囊、卵巢、胰腺例如外分泌胰腺癌、胃、宮頸、甲狀腺、前列腺或者皮膚例如鱗狀細胞癌；淋巴系造血系統腫瘤，例如白血病、急性淋巴細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤或Burkett淋巴瘤；髓系造血系統腫瘤，例如急性和慢性髓性白血病、骨髓異常增生症候群、或前髓性白血病；多發性骨髓瘤；甲狀腺濾泡癌；間充質來源的腫瘤，例如纖維肉瘤或habdomyosarcoma；中樞或外周神經系統腫瘤，例如星形細胞瘤、神經母細胞瘤、膠質瘤或許旺細胞瘤；黑素瘤；精原細胞瘤；畸胎癌；骨肉瘤；xenoderomapigmentoum；角質囊腫(keratoctanthoma)；或Kaposi肉瘤。可通過抑制solAC而減輕的炎性疾病或病症包括但不限於類風溼性關節炎、骨關節炎、類風溼性脊柱炎、痛風性關節炎、創傷性關節炎、風疹性關節炎、牛皮癬關節炎以及其他關節疾病；Alzheimer病；中毒休克症候群、外毒素引起的炎性反應或炎性腸病；結核、動脈硬化肌肉萎縮、Reiter症候群、痛風、急性滑膜炎、敗血症、敗血症休克、內毒素休克、革蘭氏陰性細菌敗血症、成人呼吸窘迫症候群、腦型瘧疾、慢性肺炎症疾病、矽肺、肺結節病、骨重吸收疾病、再灌注損傷、移植物抗宿主病、同種異體移植排斥反應、感染例如流感引起的發熱和肌痛、惡病質、特別是繼發於感染或惡性疾病的惡病質、繼發於獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)的惡病質、AIDS、ARC(AIDS相關複合體)、疤痕形成、疤痕組織形成、Crohn氏病、潰瘍性結腸炎、pyresis、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、哮喘、肺纖維化和細菌性肺炎。特別有價值的是用於治療或預防炎性疾病和病症，類風溼性關節炎和骨關節炎的化合物。因此本發明提供對上述疾病的治療，其中所述治療可包括給患者施用一組合物，所述組合物包含根據本發明獲得的化合物，例如用於治療疾病；提供了所述化合物，例如solAC抑制劑，在製備組合物中的用途，所述組合物用於施用，例如用於治療疾病；和製備藥物組合物的方法，所述方法包括將該化合物與藥用可接受的稀釋劑、運載體或載體、以及任選地其他成分混合。因此，本發明另一方面提供製備藥劑、藥物組合物或藥物的方法，所述方法包括(a)通過在此所述的本發明的其他方面之任一的方法鑑定或修飾化合物；(b)優化所述化合物的結構；和(c)製備含有所述優化的化合物的藥劑、藥物組合物或藥物。本發明的上述方法可以重複，因為修飾的化合物本身可以作為進一步設計化合物的起始點。「優化結構」指的是例如添加分子構架、添加或改變官能團、或連接分子與其他分子(例如採用片段連接方法)，由此使得配體分子的化學結構發生改變但其最初的調變功能性得以保留或增強。此類優化在藥物研發過程中是常規進行的，以便使得前導化合物例如增強效力、提高藥用可接受性、增強化學穩定性等等。修飾對於本領域人員是常規的，並包括例如，取代或去除含有與本發明的solAC結構的胺基酸側鏈基團相互作用的基團的殘基。例如，置換可包括添加或去除基團以降低或提高測試化合物中基團的電荷，置換基團以增加或減小測試化合物中基團的大小，以帶相反電荷的基團置換帶電荷基團，或以親水基團置換疏水基團或者反之亦然。可以理解這些僅僅是這一類型取代的實例，新藥化合物研發中的醫藥化學家會對此加以考慮，根據初始化合物的特性和活性，也可進行其他修飾。組合物可配製為用於任何合適的施用途徑和方式。藥用可接受載體或稀釋劑包括那些適合於口服、直腸內、鼻內、局部(包含服和舌下)、陰道內或胃腸外(包括皮下、肌肉、靜脈、皮內、鞘內和硬膜外)施用的製劑中使用的那些。這些製劑可以是劑量單位的形式，並可以通過藥學領域熟知的任何方法製備。對於固體組合物，常規的無毒固相載體包括，例如，可使用藥用級甘露醇、乳糖、纖維素、纖維素衍生物、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等等。液體藥用可施用組合物可，例如，通過將上述活性化合物和任選的藥用佐劑溶解、分散於載體，例如，水、糖鹽水、甘油、乙醇等等，由此形成溶液或懸液。需要的話，待施用的藥物組合物還可含有少量的無毒性輔助物質，例如溼化劑或乳化劑、pH緩衝劑等等，例如，醋酸鈉、月桂山梨坦、三羥乙基胺醋酸鈉、月桂山梨坦、三乙醇胺油酸酯等等。製備此類劑量形式的實際方法是本領域人員已知的，或者是顯而易見的；例如，見RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy」，20thEdition，2000，pub.Lippincott，Williams&Wilkins。通過以下實施例舉例說明本發明實施例為了獲得能夠用於確定solAC三維結構的多肽(或蛋白質)，可通過總基因合成或者克隆而獲得編碼solAC的DNA。然後將該DNA在合適的表達系統中表達以獲得能夠用於確定其三維結構的技術中的多肽。SolAC的克隆、表達和純化概述為了表達純化solAC用於結構研究，製備了大量不同的構建體，用於在大腸桿菌和昆蟲細胞中表達。在下面的具體實施例中描述了優選構建體(即2056)的表達。經過對大量構建體和表達及純化條件的深入研究，獲得了該構建體的表達和回收條件。該構建體包括1和469位殘基之間的solAC蛋白的全部或部分以及N端或C端標籤。C端標籤為TobaccoEtchVirus(TEV)Protease-cleavable-GST或TEV-cleavable-His6標籤。在一些構建體中，His6標籤也用於C端。表14給出了經分析的構建體。表14構建體1-8用於在杆狀病毒表達系統中表達，而9-15用於在大腸桿菌中表達。大腸桿菌構建體誘導後，當溫度維持於30至37℃之間時，所有構建體均表達為包涵體。誘導後將溫度降低直至15℃試圖達到可溶性表達，這產生了一些可溶性表達，但使用抗SAC抗體的western印記分析發現所有構建體均有嚴重的蛋白酶降解。使用Bieger(Bieger，B.andEssen，L-O.(2000)ActaCryst.D56，359-362)的布魯斯錐蟲AC方案作為初始點獲得構建體2033的包涵體製備物。簡言之，懸浮細胞(主要為構建體2033)，超聲裂解並離心澄清。重懸包涵體沉澱並充分洗滌，然後重新溶解於6MGuHCl或8M尿素。所有緩衝液主要為TrisHClpH8.0，Hepes，pH8.0或PBS，pH7.6。用於洗滌的去垢劑為Triton100。使用Ni-NTA和無鎳固定化金屬親和層析(IMAC)樹脂TALONTM(Clontech，MountainView，CA)柱，在變性條件下捕獲感興趣的蛋白質。使變性的穩定化蛋白質相對於10mMNaH2PO4/Na2HPO4pH7.6，0.3MNaCl，0.4M精氨酸，10％甘油透析2小時，使得大部分汙染物留在溶液中，而感興趣的蛋白質自溶液中沉澱出。再溶解的solAC蛋白被用於8×96條件下的再摺疊篩中。確定了一組產生再摺疊的活性蛋白質的條件，例如50mMHEPESpH7.2，0.5M精氨酸，0.3MNaCl，5mMBME和10％甘油。這產生了摺疊的活性蛋白質，然後其被施加於Ni-NTA柱，用於進一步純化。蛋白質的產率很低，因此進一步研究主要集中在昆蟲細胞表達。杆狀病毒構建體由於其在試驗中有活性並且有能力，因此工作主要集中圍繞著文獻中的構建體。然而，也大量關注著發表的低表達產量和缺乏純化先例。在Sf9和HighFiveTM細胞中測試solAC構建體的表達，並顯示在後者中更佳。N端GST標籤solAC構建體(2022)在GST和solAC結構域之間的連接子中包含工程化的TEV切割位點。首先在PBS、10％甘油、2mMBME中懸浮細胞，在冰上超聲裂解，並通過離心進行澄清。通過離心再次澄清上清液，在集中管幾分鐘內它變得半透明或不透明。沉澱物的SDSPAGE和蛋白質印記分析表明完整的和蛋白水解切割的sAC佔據沉澱物的大部分。通過在4℃和室溫(約20℃)兩個溫度時檢測緩衝液的範圍來尋求穩定裂解物的策略。這些緩衝液列在下表15中。表15對於所有的緩衝液，將～2g細胞懸浮於5ml的各緩衝液，並傳過一冷凍解凍循環以將其碎裂。記錄懸浮液「陰沉」或沉澱的傾向。當pH在7.5-8.5、溫度保持在4℃並存在0.3M或0.5MNaCl時，得到最佳結果。觀察到去垢劑具有有害的作用。以PBS進行的單獨的實驗表明這種緩衝液的穩定性問題。發現最佳條件為50mMTrispH7.5(4℃時測得)；0.3MNaCl；10％甘油；和2-5mMBME。構建體2056既有C端六組氨酸標籤，這允許使用Ni-NTA樹脂來捕獲蛋白質。使用TALONTM柱未改進捕獲。雖然選擇緩衝液顯著第幫助穩定裂解物，然而需要慢流速以允許足夠的與樹脂的接觸時間仍然引起困難，導致通過DEAE柱執行預清除步驟。為此，將細胞懸浮於極低鹽緩衝液，裂解，並澄清和施用於DEAE柱。裂解物的傳導率必須保持在很低，因為目標蛋白微弱地結合基體。不能做到這一點會引起不良的捕獲。在第一步，通過兩級梯度、以構建體2022和2056進行洗脫。多數容易沉澱的汙染物不能結合該柱。聚集流分，並在應用於Ni-NTA柱或穀胱甘肽瓊脂糖4b柱前，將NaCl濃度調節至300mM。加入該步驟實現了在後續步驟中的慢流速，這導致酶的較高回收。稍後，我們也能夠在高鹽緩衝液中澄清、裂解細胞後直接地成批結合Ni-NTA快流樹脂。從含流分的solAC-2056除去咪唑是成功回收蛋白質的關鍵部分。一旦建立了Ni-NTA洗脫的重現性，蛋白質池就會緩衝交換成50mMTrispH7.5(4℃)、30mMNaCl、10％甘油和1mMBME以應用於資源Q柱。在低鹽中的蛋白質的滯留期保持在最小，因為在該步驟中經歷最高的蛋白質產量的損失，即高達50％的蛋白質損失。觀察到通過pH資源Q步驟進行良好，並且發現在該步驟中緩衝液的傳導性極其重要。如果這些參數之一改變，那麼蛋白質不能結合，或者凝膠上的純化譜顯示沒有改進。純化的最後步驟起到將蛋白質置於我們發現的最穩定的緩衝液中的作用，所述緩衝液為50mMTrispH7.5(4℃)、330mMNaCl、10％甘油、1mMBME。儘管結晶化設定為10mg/ml，蛋白質可以沒有任何超過40mg/ml的聚集的跡象進行濃縮。令人驚奇的是，儘管2022和2056構建體具有相似性(TEV裂解後2022僅在N末端差幾個胺基酸殘基，並且在C端沒有His6標籤)，2022在5mg/ml或更高的濃度時寡聚，而2056在高達40mg/ml時仍為單體。solAC-2056的克隆、表達和純化編碼全長solAC(核苷酸NM018417SwissProt)的表達載體pCDNA3.1用作PCR擴增的模板。solAC-2056的克隆使用PCR擴增構建體M1-V469。5』引物5』GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGAACACTCCAAAAGAAGAATTCCAGGACTGG3』(SEQIDNO1)攜帶attB1識別序列，序列對應於鹼基1-11。3』引物5』GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACTTTCTCAGTACGGCCC3』(SEQIDNO2)引入對應於鹼基463-469的序列，一個6hisc端標籤、一個終止密碼子和attB2識別位點。PCR反應試劑10μlThermopol緩衝液10X，2μldNTP混合物，1μlDNA模板，1μl5』引物，1μl3』引物，1μlVent。反應加入H2O定為100μl。PCR循環25個循環的94℃30秒、55℃1分鐘、72℃3分鐘，然後在72℃延伸10分鐘。使用Gateway克隆技術的BP反應，將1407-bp片段重組到進入載體pDONR中。將部分產物轉化到DH5α能細胞中。從在卡那黴素選擇平板上培養的細菌中提取質粒。在通過Gateway克隆技術的LR反應將所述克隆轉移到目的載體pDEST8之前，通過DNA測序證實序列。將部分產物轉化到DH5α能細胞中。從在羧苄青黴素選擇平板上培養的細菌中提取質粒。在開始表達蛋白質之前，通過DNA測序證實序列。solAC-2056的蛋白質序列為MNTPKEEFQDWPIVRIAAHLPDLIVYGHFSPERPFMDYFDGVLMFVDISGFTAMTEKFSSAMYMDRGAEQLVEILNYHISAIVEKVLIFGGDILKFAGDALLALWRVERKQLKNIITVVIKCSLEIHGLFETQEWEEGLDIRVKIGLAAGHISMLVFGDETHSHFLVIGQAVDDVRLAQNMAQMNDVILSPNCWQLCDRSMIEIESVPDQRAVKVNFLKPPPNFNFDEFFTKCTTFMHYYPSGEHKNLLRLACTLKPDPELEMSLQKYVMESILKQIDNKQLQGYLSELRPVTIVFVNLMFEDQDKAEEIGPAIQDAYMHITSVLKIFQGQINKVFMFDKGCSFLCVFGFPGEKVPDELTHALECAMDIFDFCSQVHKIQTVSIGVASGIVFCGIVGHTVRHEYTVIGQKVNLAARMMMYYPGIVTCDSVTYNGSNLPAYFFKELPKKVMKGVADSGPLYQYWGRTEKVHHHHHH(SEQIDNO3)6His標籤在該構建體中是不可裂解的。solAC-2056的蛋白質製備以下列方式製備solAC-2056的重組病毒。簡言之，將編碼相關基因的pDEST8載體轉化到含杆狀病毒基因組(BacmidDNA)的大腸桿菌DH10BAC細胞中。通過細胞中的轉座事件，將包含所述基因和包含杆狀病毒多角體啟動子的慶大黴素抗性基因的pDEST8載體直接轉座到BacmidDNA中。通過在慶大黴素、卡那黴素、四環素和Bluo-gal上進行篩選，所得的白色集落應含有編碼相關基因的重組bacmidDNA。從白色DH10BAC細胞培養物提取BacmidDNA，並按照製造商的說明書轉染到培養於SF900II無血清培養基中的草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9細胞中。感染後72小時收集病毒粒子。將1ml部分收集的病毒粒子用於感染含1×106細胞/ml的100mlsf9細胞。在感染後72小時收集細胞培養物培養基。在EX-Cell405(JRH)無血清培養基中將Hi5昆蟲細胞培養至密度為1×106細胞/ml。將5ml部分病毒原液加入各升Hi5細胞。將培養物在27℃溫育48-72小時。通過在4000rpm離心8分鐘收集細胞。在-80℃冷凍沉澱物。solAC-2056的蛋白質純化除非另有說明，在4℃進行所有步驟。細胞沉澱物在冰上解凍，並重懸浮於裂解緩衝液(50mMTrispH7.5，300mMNaCl，10％甘油，2mMBME，蛋白酶抑制劑cocktail(Calbiochem)。超聲裂解細胞，並在4℃用Dnase溫育裂解物1小時。以14,000或25,000rpm離心1小時澄清裂解物。按照前述步驟通過離心進一步澄清已澄清的裂解物，然後在應用於以批量結合模式以Ni2+預荷電的金屬螯合基體(GEHealthcare)之前，通過0.45μm過濾器。將所述樹脂或基體傾注到柱中，並通過加入含250mM咪唑的裂解緩衝液洗脫solAC蛋白。通過SDSPAGE分析流分，富集含solAC蛋白的流分。通過應用於在50mMTrispH7.5，30mMNaCl，10％甘油，5mMBME中平衡的G25-脫鹽柱，將富集的蛋白質緩衝交換至低鹽中。然後將緩衝交換的solAC蛋白施加到6mlResourceQ陽離子交換(GEHealthcare)柱，並使用0-30％1MNaCl的梯度在20個柱提及上進行洗脫。通過SDSPAGE分析流分，富集含solAC蛋白的流分，並施加到在50mMTris、pH7.5、330mMNaCl、10％甘油、5mMBME中預平衡的26/60superdex-75凝膠過濾柱。通過SDSPAGE分析流分。富集SolAC流分，並使用vivaspin2離心濃縮器(HY)將其濃縮至終濃度為～10mg/ml。solAC-2056的替代性純化除非另有說明，所有步驟均在4℃進行。在冰上解凍細胞沉澱物，並重懸浮於裂解緩衝液(50mMTrispH7.5，10％甘油，2mMBME，蛋白酶抑制劑cocktail(Calbiochem)。超聲裂解細胞，並在4℃用Dnase溫育裂解物1小時。以14,000或25,000rpm離心1小時澄清裂解物。按照前述步驟通過離心進一步澄清已澄清的裂解物，然後在施加到DEAE陽離子交換樹脂之前，通過0.45μm過濾器。通過15和30％級梯度的NaCl洗脫所述蛋白質。富集15％峰，將富集的蛋白質的NaCl濃度提高到300mM，然後應用於以Ni2+預荷電，並在50mMTispH7.5、300mMNaCl、10％甘油、2mMBME中平衡的金屬螯合的、通常5mlHi-trap柱(GEHealthcare)。通過加入含250mM咪唑的平衡緩衝液洗脫solAC蛋白。通過SDSPAGE分析流分，並富集含solAC蛋白的流分。通過應用於在50mMTrispH7.5、30mMNaCl、10％甘油、5mMBME中平衡的G25-脫鹽柱，將富集的蛋白質緩衝交換到低鹽中。然後將緩衝交換的solAC蛋白應用於6mlResourceQ陽離子交換(GEHealthcare)柱，並使用0-30％1MNaCl的梯度在20個柱體積上進行洗脫。通過SDSPAGE分析流分，富集含solAC蛋白的流分，並施加到在50mMTris、pH7.5、330mMNaCl、10％甘油、5mMBME中預平衡的26/60superdex-75凝膠過濾柱。通過SDSPAGE分析流分。富集SolAC流分，並使用vivaspin2離心濃縮器(HY)將其濃縮至終濃度為～10mg/ml。可溶性腺苷酸環化酶的蛋白質結晶化使用市售微批量(microbatch)結晶化篩通過坐式生長或懸滴蒸汽擴散法生長人類solAC的警惕。對於一定範圍的條件，發現晶體從200mM檸檬酸鹽(例如，鈉、鉀、銨)和20％PEG3350生長。這些晶體形狀矮胖，但很小。從這些晶體的衍射不良，並達到最大解析度為6.0埃。因此，有必要發現不同的條件來得到可以尺寸和解析度可接受的晶體。在初篩中獲得的晶體從沒有緩衝的溶液生長。在進一步各輪篩選中，使用懸滴蒸汽擴散法，發現使用pH4.6-5.2的緩衝液改進了晶體生長。對於晶體平衡的溶液的最終的pH在pH6.0-6.4變化。在另一輪篩選中，檸檬酸鹽的濃度保持恆定於0.2M檸檬酸三鈉，同事改變PEG的濃度和分子量。發現使用濃度在10-20％之間的PEG4000改進了結晶化。最佳晶體出現在16％PEG4K，然而，其質量不一致，並且其尺寸在最長尺度上在0.05mM至0.2mM之間變化。這些晶體中最佳者衍射至解析度為2.3埃。因此需要進一步憂患。在50mMTris/HCl、pH7.5、330mMNaCl、2mMβ巰基乙醇和10％甘油將蛋白質濃縮至～10mg/ml。以1∶1體積混合物，將蛋白質溶液與0.1M醋酸鈉、pH4.8、0.2M檸檬酸三鈉、16-18％PEG4K和10％甘油的儲備液混合。通過懸滴蒸汽擴散在4℃生長晶體。3-6天後晶體以液滴出現，並在14天後達到最大尺寸0.5×0.1×0.1mm。使用微引晶方法進一步改進晶度和質量的抑制性。通過在0.1M醋酸鈉、pH4.8，0.2M檸檬酸三鈉、14％PEG4K、2mMβ巰基乙醇和10％甘油的溶液中粉碎solAC晶體製備種子儲備。通過試行結晶化運轉(trialcrystallizationrun)，達到種子儲備的最佳稀釋，其中使用1/100、1/10000、1/100,000和1/1000,000稀釋的種子儲備設立盤。通過在滑蓋上混合等體積(通常1μl+1μl)的蛋白質溶液和種子儲備設立結晶化的盤。將其置於含0.1M醋酸鈉、pH4.8、0.2M檸檬酸三鈉、14％PEG4K和10％甘油的孔上。所需的稀釋依蛋白質批次變化。晶體在空間群P63內生長，晶胞大小為a＝b＝99.15_，c＝97.51_。為了在低溫時收集數據期間保存晶體，簡單地將solAC的晶體轉移到含0.1M醋酸鈉、pH4.8、0.2M檸檬酸三鈉、30％PEG4K和10％甘油的低溫緩衝液。將晶體由該溶液投入液氮中，並儲存，用於後續的數據收集。數據收集和處理使用JupiterCCD探測器或RAXISHTC圖象平板探測器收集用於解析solAC結構的衍射數據。兩者均放置於Rigaku旋轉陽極發生器上。在EuropeanSynchrotronRadiationfacility的BeamlineID29-1上收集用於將solAC結構精確至1.7_的高解析度數據，使用的是ADSCQuantum4CCD探測器，波長為0.934_，並以MOSFLM(Leslie，A.G.W.(1992).InJointCCP4andEESF-EACMBNewsletteronProteinCrystallography，vol.26，Warrington，DaresburyLaboratory)處理數據。使用SCALA(CCP4-CollaborativeComputationalProject4.(1994)TheCCP4SuiteProgramsforProteinCrystallography.ActaCrystallographicaD50，760-763)對數據進行評級，使用TRUNCATE(Evans，P.R.(1997).ScalingofMADdata.InRecentAdvancesinPhasing(ed.K.S.Wilson，G.Davies，A.W.AshtonandS.Bailey)，pp.97-102.CouncilfortheCentralLaboratoryoftheResearchCouncilsDaresburyLaboratory，Daresbury，UK)從CCP4程序組(CCP4-CollaborativeComputationalProject4.(1994)TheCCP4SuiteProgramsforProteinCrystallography.ActaCrystallographicaD50，760-763)將強度轉化為結構因子幅度。確定結構和精確化採用多種同晶置換來解析可溶性腺苷酸環化酶的結構。通過將含重金屬的化合物溶解於溶液(溶液的組成為0.1M醋酸鈉，pH4.8，0.2M檸檬酸三鈉，16％PEG4K和10％甘油)中製備多種重金屬溶液。然後將solAC晶體置於溶液中，平衡不同長度的時間(2分鐘至5天)。許多這些溶液損害晶體，導致浸滲的晶體完全喪失衍射至與原晶體缺乏同晶型性等效應。在大量浸滲(＞100)中，31個晶體得到了可用數據，其中的5個得到能夠用於分析並解析重原子的位置和佔用的衍生物。採用差異模式方法獲得重原子最初的位置，將其用於以MLPHARE的初步定相(CCP4程序組)，採用差異傅立葉分析圖定位額外的位點。對5個可用衍生物重複這些步驟，然後採用差異傅立葉分析對它們進行交叉驗證，以確保所有重原子溶液均為相同來源。因此，使用5個衍生物獲得了相(見表16)，然後採用溶劑平化(Solomon)和ARP/WARP循環對它們進行改進。然後將可溶性腺苷酸環化酶的序列構建為所得到的電子密度圖。經過多輪重建和精確化(採用QUANTA，REFMAC和CNX)，最初在2.3_，使用的是內部數據，最後在1.7_，使用的是同步加速器數據，最終的可溶性腺苷酸環化酶模型由1-468位殘基組成，具有2個缺口(殘基135-140和350-356)。所得結構見表1。表16用於解析solAC結構的重原子衍生物描述apo可溶性腺苷酸環化酶的結構可溶性腺苷酸環化酶的催化結構域的結構如表1的坐標所示。殘基Met1是在電子密度中能夠觀察到的第一個殘基，而Lys468是最後一個。靠近Met1的主鏈氮原子的電子密度峰可能是乙醯化引起的，沒有被建模。不具有可判斷的主鏈密度的殘基是Trp135，Glu136，Glu137，Gly138，Leu139，Asp140，Phe350，Pro351，Gly352，Glu353，Lys354，Val355和Pro356。殘基Val469和C端His6-標籤在電子密度中是不可見的。靠近134位的首個斷點的主鏈定義不清楚，而殘基132-134具有不均勻的主鏈電子密度。殘基304-306和451-455的電子密度的定義不清楚。此外，模型周邊的一些殘基的側鏈被主觀放置，因為它們沒有可判斷的密度。solAC的活性位點solAC與來自鈍頂螺旋藻的酶相比強烈提示solAC僅具有一個活性位點，其相應於由來自鈍頂螺旋藻B單體的A-鏈殘基1140、含環的B-鏈殘基1061和形成螺旋α1的殘基形成的位點。可能相應於鈍頂螺旋藻的A單體的第二個位點不存在螺旋α1。相應於A單體的2和3的β-鏈在solAC中更長，且部分遮掩腺苷結合位點，其開口顯著小於對稱相關的相應位點。表6給出了活性位點區域的殘基，它們被認為與底物相互作用。製備與配體相複合的solAC晶體在浸滲溶液中製備200mMα-β-亞甲基腺苷5』-三磷酸酯，40mMCaCl2和40mMMnCl2溶液。浸滲溶液的組成為0.1M醋酸鈉，pH4.8，0.2M檸檬酸三鈉，16％PEG4K和10％甘油。將先前生長的solAC催化結構域晶體置於20μL的配體浸滲溶液中並平衡3天。然後將晶體移至防凍液中並在液氮中冷凍，準備用於收集數據。配體複合體的數據收集、結構解析和精確化採用設置於自製X線源上的RAXISHTC收集solAC催化結構域/配體複合體的衍射數據。將先前解析的solAC催化結構域結構作為用於精確化的初始模型。進行剛體和受約束的精確化並計算差異圖譜。將配體分子，即α-β-亞甲基腺苷5』-三磷酸酯，構建到差異密度中，隨後進行數輪精確化。solAC配體複合體的描述與solAC相複合的α，β-亞甲基ATP的結構顯示出一種相互作用的模式，這與在鈍頂螺旋藻中所見的極為相似。大部分相互作用出現在磷酸根基團、金屬離子和所述蛋白質之間。腺嘌呤基團在Val406的N6氨基和主鏈羰基之間形成氫鍵，在Asn412的N7和OD1形成水介導的相互作用。核糖基團不與蛋白質形成氫鍵。大部分相互作用出現於磷酸根基團、推定的金屬結合位點和蛋白質之間。殘基Asp99、Asp47的側鏈、Ile48的羰基、β和γ磷酸根的氧原子和水分子與金屬離子相互作用。Arg416與來自α磷酸根的氧相互作用。來自γ磷酸根的氧原子與Thr52的OG和Thr52及Phe51的主鏈氮原子相互作用。結合配體後，發現殘基48-58的區域出現某種重排，該區域相應於螺旋α1以及連接β1和α1的環。含有殘基96至101的該環發生了一種協調運動，使得殘基99的Cα移動了3.5_。其他solAC-配體複合體solAC的HCO3-結合位點SolAC是唯一已知的其活性被HCO3-直接調節的蛋白質。以碳酸氫鈉浸滲solAC晶體發現了HCO3-結合位點的位置。HCO3-離子的結合由氫鍵和靜電相互作用的網絡介導，如圖2所示1)Lys95的NZ與HCO3-的O1形成鹽橋，2)Val167的主鏈NH與HCO3-的O1形成帶電氫鍵，3)Val167的主鏈羰基與HCO3-的OH形成氫鍵，4)Arg176的側鏈NH2與HCO3-的O3形成鹽橋，而5)Arg176的側鏈NH2與HCO3-的OH形成帶電氫鍵。Lys95參與與的HCO3-配位與已發表的碳酸氫根反應性腺苷酸環化酶的研究(Cann，M.J.eta1.(2003)JournalofBiologicalChemistry278，35033-35038)所得結論相一致。5-苯基-2H-[1，2，4]-三唑-3-硫醇與的solAC碳酸氫根位點結合結合於solAC的5-苯基-2H-[1，2，4]-三唑-3-硫醇(化合物1，購自LancasterSynthesis，UK)的結構顯示，其他小分子配體可到達HCO3-結合位點。化合物1的帶負電的硫原子與HCO3-離子位於幾乎相同的位置，而連接苯基的化合物1的三唑基團打開HCO3-結合位點成為一個與ATP結合位點鄰近的大袋。這一擴充的HCO3-結合位點揭示了一個solAC結構的區域，其可用於設計solAC抑制劑或活化劑。Arg176自HCO3-袋中運動出來以及包括Ala97、Gly98、Asp99和Ala100的環的運動使得化合物1介導的HCO3-結合位點的擴充成為可能。化合物1結合還誘導Val335-Cys343序列的協調運動。solAC的這一區域構成沿碳酸氫根結合位點底部走行的β鏈和環結構的一部分。該序列中的Phe336、Met337和Phe338構成化合物1結合位點的一部分。化合物1的擴充的HCO3-結合位點由以下殘基排列而成Phe45、Leu94、Lys95、Ala97、Ala100、Leu102、Phe165、Leu166、Val167、Ile168、Val172、Arg176、Val335、Phe336、Met337和Phe338。化合物1的硫原子位於袋的底部並與Lys95的NZ形成鹽橋以及與Val167的主鏈NH和Phe336的主鏈NH形成帶電氫鍵。三唑的N6也與Met337的主鏈羰基在袋的底部形成氫鍵。此外，三唑的N5與Arg176的NH2形成帶電氫鍵。化合物1的苯基延伸進入由Phe45，Lys95，Ala97，Ala100，Leu102和Phe336的側鏈形成的化合物1袋的顯著親脂性區域。在化合物1的苯基之後，該袋在敞開進入ATP結合位點之前輕度縮小。該擴充的HCO3-結合位點的形狀和在化合物1solAC複合體中所觀察到的相互作用的性質提示該位點適合於多種配體。儘管哺乳動物跨膜腺苷酸環化酶異構體之間存在高度的序列和結構的相似性，但solAC是這類酶中唯一由HCO3-調節的成員。因此，在此所述的solACHCO3-結合位點的結構信息為設計相對於tmAC具有高度選擇性的solAC靶向藥物提供了指導。與藥物設計有關的結合化合物1的結構的另一個關鍵的特徵是化合物1顯示出離開solAC的HCO3-位點並進入ATP結合位點的明顯生長載體機會。在藥物研發中，導向蛋白質的ATP結合位點的化合物有很多先例。在此給出的結構確立了這樣一點，即可以設計出同時佔據solAC的HCO3-和ATP結合位點的化合物。額外的solAC化合物結合位點-N-(3-苯氧基-苯基)-草醯酸結合於solAC的N-(3-苯氧基-苯基)-草醯酸(化合物2)晶體結構發現solAC結構的其他區域可開發用於藥物設計。化合物2的結合位點與就化合物1所描述的擴充的HCO3-袋重疊，由此化合物2的苯氧基佔據了與化合物1的苯基的極為相似的位置。不過，化合物2誘導位於HCO3-結合位點底部的Lys95的大的側鏈運動。該Lys95運動打開了HCO3-結合袋，形成一併入大的充水腔的通道，然後開口於蛋白質表面與ATP結合位點相對的點上。以下殘基排列成這一新發現的通道His164，Phe165，Tyr268，Asn333，Lys334和Val335。化合物2的草醯酸基團最大程度地伸入該通道，與所述蛋白質形成若干相互作用1)化合物2的O3與His164的ND形成帶電氫鍵；2)化合物2的O1與Phe165的主鏈NH形成帶電氫鍵；3)化合物2的O5氫鍵結合於Val335的主鏈NH；和4)化合物2的醯胺N6氫鍵結合於Phe165的主鏈羰基。Lys95、Phe165、Leu166、Val167和Phe336的側鏈形成圍繞化合物2的中心苯胺基芳族環的親脂性環境。儘管化合物2的末端苯氧基結合於為化合物1所描述的相同的親脂性袋內，但由於化合物2引起包含Met337、Phe338、Asp339、Lys340和Gly341的環發生運動，該袋的環境被輕度改變。該環的運動將Phe338拖離ATP位點，到達化合物2的末端苯氧基的範德瓦耳斯距離範圍內。在apo、AMP-PNP和結合化合物1的solAC的結構中均沒有觀察到Phe338的這種運動。實際上，AMP-PNP複合體的結構顯示，Phe338形成ATP位點的一端，靠近AMP-PNP核糖的羥基。Phe338的重新定位形成了與ATP結合位點鄰近的新的亞袋。該新的亞袋由以下殘基排列而成Phe296，Met418，N298，Ser343，Phe336，Met337，Gly341，Asp339，Met419，Cys342，Ala415，Arg416，Met300和Lys340。引起形成這一ATP亞袋的化合物成為了solAC活性位點內部的額外的藥物設計機會。該ATP亞袋是由結合於擴充的HCO3-位點內部的化合物引起的這一事實，再次強調了這樣一種觀點，即HCO3-位點在開發相對於非碳酸氫根反應性tmAC而言具有高水平選擇性的藥物中具有巨大的潛在用途。重要的是，在此所述的這4個結合位點不是相互無關的，而是形成了連續的solAC結合位點，誘導所述的擴充的ATP和HCO3-袋。整個結合位點代表了開發小分子solAC藥物的誘人靶點。製備N-(3-苯氧基-苯基)-草醯酸在呋喃(3ml)中的3-苯氧基苯胺(276mg，1.4毫摩爾)和三乙胺(0.2ml，1.4毫摩爾)溶液中逐滴加入氯-氧-乙酸乙酯(0.175ml，1.5毫摩爾)。在環境溫度中攪拌所得溶液40分鐘。向反應混合物中加水(1.5ml)和氫氧化鈉(72mg，1.8毫摩爾)。環境溫度下再攪拌反應混合物24小時。反應混合物在二氯甲烷和鹽酸(2N)之間出現分區。以二氯甲烷洗滌水相。將二氯甲烷層混合然後以鹽酸(2N)和水洗滌。將有機相干燥(MgSO4)、過濾，真空去除溶劑，得到N-(3-苯氧基-苯基)-草醯酸白色固體(286mg，74％)。製備與HCO3-複合的solAC晶體在由0.1M醋酸鈉，pH4.8，0.2M檸檬酸三鈉，16％PEG4000和10％甘油組成的浸滲溶液中製備50mM碳酸氫鈉溶液。將先前生長的solAC催化結構域晶體置於20μl的所述碳酸氫根浸滲溶液中，平衡3小時。然後將晶體移至防凍液中並在液氮中冷凍，以備收集數據。製備與化合物複合的solAC晶體製備佔終體積90％的浸滲溶液儲存液，其組成為200mMNaCl，200mM檸檬酸三鈉(pH6.4)，15％w/vPEG4000和15％v/v甘油。剩餘的10％體積1)以水補平，產生收集溶液，或2)以化合物儲存溶液(於DMSO中)補平，成為終浸滲溶液。收集溶液用於在自懸滴中回收solAC晶體之後臨時儲存solAC晶體，並作為浸滲過程中的儲備溶液以免浸滲溶液蒸發。在DMSO中製備0.25M的化合物1和化合物2儲存溶液。化合物1的儲存90％浸滲溶液的pH調至pH7.3以有助於該化合物的結合。通過混合36μl的「90％儲存溶液」和4μl的化合物儲存溶液而製備化合物1和2的終浸滲溶液。這樣得到25mM的化合物終濃度。化合物的浸滲/冷凍過程將晶體自懸滴中收集到10μl新鮮的收集溶液中。儲備池中也添加50-100μl收集溶液。在孔中放入浸滲溶液(6μl)，相應的儲備池中添加50μl收集溶液。將晶體分布到浸滲溶液中(1晶體/化合物)。將孔封閉並進行浸滲，對於化合物1，在20C浸滲6分鐘，對應化合物2，在20C浸滲4.5小時。打開封閉，將晶體置於顯微載片上，置液氮中冷凍。化合物編號在描述solACHCO3-、solAC化合物1和solAC化合物2複合體時，採用的原子的編號表(如所附pdb文件所示s)顯示於圖1。沒有顯示化合物1和化合物2的氫原子。顯示了HCO3-的氫原子，因為該氫原子在定義solACHCO3-的相互作用中特別重要。表1CRYST199.42499.42497.39090.0090.00120.00P63SCALE10.0100580.0058070.0000000.00000SCALE20.0000000.0116140.0000000.00000SCaLE30.0000000.0000000.0102680.00000表2CRYST199.65199.65196.52290.0090.00120.00P63SCALE10.0100350.0057940.0000000.00000SCALE20.0000000.0115870.0000000.00000SCALE30.0000000.0000000.0103600.00000表3CRYST199.67399.67396.82490.0090.00120.00P63SCALE10.0100330.0057920.0000000.00000SCALE20.0000000.0115850.0000000.00000SCALE30.0000000.0000000.0103280.00000表4CRYST199.56999.56998.47090.0090.00120.00P63SCALE10.0100430.0057980.0000000.00000SCALE20.0000000.011597O.0000000.00000SCALE30.0000000.0000000.0101550.00000CONECT751675177529CONECT75177516752175187518CONECT7518751775177519CONECT75197518752075207523CONECT7520751975197521CONECT7521751775207522CONECT75227521CONECT75237519752875287524CONECT75247523752575257530CONECT75257524752475267531CONECT75267525752775277532CONECT75277526752675287533CONECT75287523752375277534CONECT75297516CONECT75307524CONECT75317525CONECT75327526CONECT75337527CONECT75347528END表5CRYST199.29199.29197.75390.0090.00120.00P63SCALE10.0100710.0058150.0000000.00000SCALE20.0000000.0116290.0000000.00000SCALE30.0000000.0000000.0102300.00000CONECT74957496CONECT74967495749774977498CONECT749774967496CONECT74987496749974997500CONECT749974987498CONECT7500749875017514CONECT75017500751375137502CONECT75027501750375037515CONECT75037502750275047516CONECT75047503750575057517CONECT75057504750475067513CONECT750675057507CONECT75077506751275127508CONECT75087507750975097518CONECT75097508750875107519CONECT75107509751175117520CONECT75117510751075127521CONECT75127507750775117522CONECT75137501750175057523CONECT75147500CONECT75157502CONECT75167503CONECT75177504CONECT75187508CONECT75197509CONECT75207510CONECT75217511CONECT75227512CONECT75237513END權利要求1.一種基於計算機的用於分析配體與solAC結構的相互作用的方法，其包括提供表1、表2、表3、表4或表5的solAC結構或其選定的坐標，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；提供待與所述solAC結構或其選定的坐標相適配的配體；和使所述配體與所述solAC結構相適配。2.權利要求1的方法，其中所述選定的坐標包括來自表6、7、8、9、10或11中所示的殘基組的一或多個殘基的原子。3.權利要求1的方法，其中所述選定的坐標包括來自殘基組Met1至Tyr26或Lys219至Gly284的一或多個胺基酸的原子。4.權利要求2或3的方法，其中所述配體與來自所述組的至少2個、優選地至少5個成員的至少一種原子相適配。5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述配體與至少10個原子、優選地至少100個原子相適配。6.前述權利要求中任一項的方法，其中所述選定的坐標是至少500個、優選地至少1000個原子的坐標。7.前述權利要求中任一項的方法，其中使多個分子片段相適配並將所述片段組裝成單個分子以形成配體。8.前述權利要求中任一項的方法，還包括以下步驟獲得或合成所述配體；和使所述配體與solAC蛋白相接觸以確定所述配體與solAC相互作用的能力。9.權利要求1至7中任一項的方法，還包括以下步驟獲得或合成所述配體；形成solAC蛋白和所述配體的複合體；和通過X線結晶學分析所述複合體以確定所述配體與solAC相互作用的能力。10.權利要求1至7中任一項的方法，還包括以下步驟獲得或合成所述配體；和確定或預測所述配體如何與所述solAC結構相互作用；和修飾所述配體以改變其與solAC之間的相互作用。11.前述權利要求中任一項的方法，其中所述solAC結構是自表1、表2、表3、表4或表5的全部或部分坐標或其選定的坐標而構建的模型，所述表1、表2、表3、表4或表5的坐標任選地有變化，但均方根差不超過0.5_。12.權利要求11的方法，其中所述模型是(a)線框模型；(b)網狀模型；(c)球棍模型；(d)空間填充模型；(e)棍狀模型；(f)帶狀模型；(g)活動輪廓模型；(h)箭頭圓柱模型；(i)電子密度圖；(j)分子表面模型。13.前述權利要求中任一項的方法，還包括以下步驟(a)獲得或合成所述配體；和(b)使所述配體與solAC相接觸以確定所述配體與solAC相互作用的能力。14.評估配體與solAC蛋白相互作用的能力的方法，包括獲得或合成所述配體；形成solAC蛋白和所述配體的結晶化複合體，所述複合體使用於確定所述複合體的原子坐標的X線發生衍射，達到優於3.5_的解析度；和採用表1、表2、表3、表4或表5的數據或其選定的坐標通過X線結晶學分析所述複合體以確定所述配體與solAC蛋白相互作用的能力，所述數據任選地有變化，但均方根差不超過1.5_。15.權利要求14的方法，其包括提供solAC蛋白的晶體；用配體浸滲晶體以形成複合體；和採用表1、表2、表3、表4或表5的數據或其選定的坐標確定所述複合體的結構，所述數據任選地有變化，但均方根差不超過1.5_。16.權利要求14的方法，其包括使solAC蛋白與配體混合；使solAC蛋白-配體複合體結晶化；和採用表1、表2、表3、表4或表5的數據或其選定的坐標確定所述複合體的結構，所述數據任選地有變化，但均方根差不超過1.5_。17.權利要求14的方法，還包括確定所述配體的結構。18.權利要求14或17的方法，還包括以下步驟獲得或合成所述配體；和修飾所述配體以改變其與solAC之間的相互作用。19.用於確定蛋白質結構的方法，其包括提供表1、表2、表3、表4或表5的坐標或其選定的坐標，所述表1、表2、表3、表4或表5的坐標任選地有變化，但均方根差不超過1.5_，和(a)使所述坐標在所述蛋白質的晶體晶胞中定位以便提供所述蛋白質的結構，或(b)通過操作所述坐標來分配所述蛋白質的NMR譜峰。20.預測結構未知的solAC蛋白同源物或類似物的三維結構的方法，所述方法包括以下步驟將三維結構未知的靶solAC蛋白的胺基酸序列的圖象與表1、表2、表3、表4或表5或其選定的坐標的solAC的胺基酸序列進行比對，以便所述胺基酸序列的同源性區域相匹配，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；在表1、表2、表3、表4或表5或其選定的坐標所定義的solAC結構的相應區域上構建所述結構未知的靶solAC的相匹配的同源性區域的結構的模型，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；和確定所述結構未知的靶solAC的構象，所述靶solAC基本上保留所述相匹配的同源性區域的結構。21.為產生與solAC、solAC同源物或類似物相互作用的配體、solAC與配體的複合體、或solAC同源物或類似物與配體的複合體的結構和/或對與solAC、solAC同源物或類似物相互作用的配體、solAC與配體的複合體、或solAC同源物或類似物與配體的複合體進行優化而提供數據的方法，所述方法包括(i)與遠程裝置建立通訊，所述裝置含有(a)計算機可讀數據，包括表1、表2、表3、表4或表5的原子坐標數據或其選定的坐標，所述原子坐標數據任選地有變化，但均方根差小於1.5_，所述數據定義solAC催化結構域的三維結構或其選定的坐標；(b)基於(a)的數據通過對所述靶進行同源性建模而產生的靶腺苷酸環化酶同源物或類似物的原子坐標數據；(c)通過參照表1、表2、表3、表4或表5的數據來解釋X線晶體學數據或NMR數據而產生的蛋白質的原子坐標數據；和(d)可自(a)或(c)的原子坐標數據導出的結構因素數據；和(ii)接收來自所述遠程裝置的所述計算機可讀數據。22.權利要求21的方法，其中所述計算機可讀數據是表1、表2、表3、表4或表5的solAC原子坐標數據或其選定的坐標，所述solAC原子坐標數據任選地有變化，但均方根差不超過1.5_，且其中所述方法還包括提供待與表1、表2、表3、表4或表5的solAC原子坐標數據或其選定的坐標相適配的配體，所述solAC原子坐標數據任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；和使所述配體與solAC結構相適配。23.前述權利要求中任一項的方法，其中所述選定的坐標包括至少5％、優選地至少10％的Cα原子。24.權利要求23的方法，其中參照所述Cα原子計算所述均方根差。25.一種計算機系統，用於產生與solAC、solAC同源物或類似物相互作用的配體、solAC與配體的複合體、或solAC同源物或類似物與配體的複合體的結構和/或對與solAC、solAC同源物或類似物相互作用的配體、solAC與配體的複合體、或solAC同源物或類似物與配體的複合體進行優化，所述系統含有計算機可讀數據，所述數據包括以下一或多項(a)表1、表2、表3、表4或表5的solAC坐標數據或其選定的坐標，所述數據定義solAC催化結構域的三維結構；(b)基於表1、表2、表3、表4或表5的坐標數據通過對靶進行同源性建模而產生的靶腺苷酸環化酶蛋白的原子坐標數據；(c)通過參照表1、表2、表3、表4或表5的坐標數據解釋X線晶體學數據或NMR數據而產生的靶腺苷酸環化酶蛋白的原子坐標數據；(d)可自(b)或(c)的原子坐標數據導出的結構因素數據；和(e)表1、表2、表3、表4或表5的原子坐標數據或其選定的坐標，所述原子坐標數據任選地有變化，但均方根差小於1.5_。26.權利要求25的計算機系統，其中所述選定的坐標包括來自表6、7、8、9、10或11中所示的殘基組的一或多個殘基的原子。27.權利要求26的計算機系統，其中所述選定的坐標是來自所述組的至少2個、優選地至少5個成員的至少一種原子的坐標。28.權利要求25至27中任一項的計算機系統，其中所述配體與至少10個原子、優選地至少100個原子相適配。29.權利要求25至28中任一項的計算機系統，包括(i)計算機可讀數據存儲介質，其包括編碼有所述計算機可讀數據的數據存儲材料；(ii)工作內存，用於存儲處理所述計算機可讀數據的指令；和(iii)中央處理器，其偶聯於所述工作內存並偶聯於所述計算機可讀數據存儲介質，用於處理所述計算機可讀數據並由此產生結構和/或進行合理性藥物設計。30.權利要求29的計算機系統，還包括偶聯於所述中央處理器用於顯示所述結構的顯示裝置。31.計算機用於產生solAC結構或solAC-配體複合體的三維圖象的用途，其中所述solAC結構來自表1、表2、表3、表4或表5或其選定的坐標，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_，其中所述計算機包括(i)計算機可讀數據存儲介質，其包括編碼有計算機可讀數據的數據存儲材料，其中所述數據包括表1、表2、表3、表4或表5的結構或其選定的坐標，所述表1、表2、表3、表4或表5任選地有變化，但均方根差不超過1.5_；(ii)將所述計算機可讀數據處理成所述三維圖象的指令。32.權利要求31的用途，其中所述選定的坐標是表6、7、8、9、10或11中所示的一或多個殘基的原子。33.製備組合物的方法，包括根據權利要求1至18中任一項的方法鑑定配體，並將所述分子與載體混合。34.用於製備藥劑、藥物組合物或藥物的方法，所述方法包括(a)根據權利要求1至18中任一項的方法鑑定配體；和(b)製備含有所述配體的藥劑、藥物組合物或藥物。35.權利要求34的方法，其包括(a)根據權利要求1至18中任一項的方法鑑定配體；(b)優化所述配體的結構；和(c)製備含有所述優化的配體的藥劑、藥物組合物或藥物。36.solAC催化結構域的晶體。37.solAC催化結構域和配體的共結晶。38.solAC催化結構域與配體的共結晶，其具有空間群P63。39.權利要求32或33的共結晶，其具有如下晶胞尺度a＝b＝99.5_、c＝97.4_、且α＝β＝90.00、γ＝120.00，所有尺度的晶胞可變性為5％。40.solAC蛋白的晶體，其具有3.5_或更佳的解析度。41.solAC蛋白的晶體，其具有由表1、表2、表3、表4或表5的坐標所定義的結構，所述坐標任選地有變化，但均方根差小於1.5_。全文摘要本發明提供solAC催化結構域的晶體結構。所述結構在表1至5中給出。所述結構可用於建立配體例如藥用化合物與該蛋白質的相互作用的模型，以及用於確定相關的腺苷酸環化酶分子的結構。文檔編號C12N9/88GK101228270SQ200680026621公開日2008年7月23日申請日期2006年7月21日優先權日2005年7月21日發明者S·M·薩勞-貝瑟爾,A·克利斯畢,T·A·薩姆布魯克,J·科伊爾,M·溫科維奇申請人:拜耳先靈醫藥股份有限公司