一株可降解多環芳烴的鹽單胞菌及其應用的製作方法

2023-06-24 11:14:21 3

專利名稱：一株可降解多環芳烴的鹽單胞菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株可降解多環芳烴的鹽單胞菌及其應用。
背景技術：
多環芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是指兩個或兩個以上苯環以鏈狀、角狀或串狀排列組成的化合物，主要來自於木材、化石燃料、煤焦油產品或食物 等有機質的不完全燃燒，多環芳烴在環境中分布廣泛，在大氣、水體、土壤、沉積物和食品中 都有檢出。多環芳烴大多數為有毒物質，許多有三致效應，即致癌、致畸變和致突變，迄今 為止已發現的多環芳烴類致癌物及其衍生物已經超過400種，不乏苯並(a)芘這樣的強致 癌物質。多環芳烴具有的半揮發性、親脂性、高生物蓄積性和難降解等特性，使其能夠在環 境中長時間存在、長距離遷移並富集於生物體，給人類健康和生態系統安全造成長期而嚴 重的危害。因此，1998年，美國、加拿大和歐洲共32個國家訂立的《關於長距離越境空氣 汙染物公約》中將多環芳烴明確定為必須控制的持久性有機汙染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)。環境中的多環芳烴除少部分可以發生光化學分解外，大部分主要依賴生物降解途 徑慢慢消失，因此微生物降解是控制多環芳烴汙染較為經濟有效的方法。然而，多環芳烴汙 染常常伴隨著鹽濃度較高的環境，例如多環芳烴隨著石油的突發事故、落地油及含油汙水 排放等對沿海溼地中的鹽鹼灘環境造成嚴重汙染，含油和含鹽量都比較高(鹽度> 3.5% w/v)的油田採出水排放會使接納環境中的鹽度和多環芳烴含量同時升高，釀成汙染。普通 降解菌雖然能有效降解多環芳烴卻難以在較高的鹽濃度下生長，而嗜鹽降解菌的研發能夠 解決這一矛盾，因此對控制多環芳烴汙染有重要意義。中度嗜鹽菌是指能夠在鹽濃度為3% 15%的條件下有最佳生長能力的極端微 生物類群。中度嗜鹽菌分布極其廣泛，在鹽湖、海洋等鹽水環境，鹽鹼地、鹽池等鹽土環境 和鹽漬發酵食品等人工環境中都能夠被發現。中度嗜鹽菌易於在高鹽環境中生長繁殖，因 而能夠最大程度減少發酵過程中其它菌類的汙染；同時營養要求比較簡單，可以利用多種 有機物作為碳源和氮源；它們獨特的生理生化特性使其具有較高的應用價值。中度嗜鹽菌 在高鹽濃度下能夠降解苯甲醛、苯酚等有毒有害的難降解物質，所以利用中度嗜鹽菌在生 理生化上的獨特優勢來處理環境汙染日益受到關注。Maltseva等人分離的1-18菌株具有 高活性的兒茶酚過氧化酶、粘康酸環異構酶和二烯內脂水解酶活性，在含有5. 85% NaCl, pH8. 4 9. 4的條件下可降解苯甲酸、3-氯苯甲酸和4-氯苯甲酸。海桿菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)在高達20 %的鹽濃度下仍能降解烴類。鹽單胞菌(Halomonas halodurans)可裂解苯甲酸脂和芳烴類的芳香環。有些鹽單胞菌(Halomonas)的菌株可以 降解酚類物質，也有些鹽單胞菌科(Halomonadaceae)的菌株能夠利用氯代芳烴化合物作 為碳源和能源。已有研究採用含中度嗜鹽菌的生物膜反應器處理鹽度達15%的汙水，苯酚 的降解率達到99%。然而，目前關於可降解多環芳烴的中度啫鹽菌的報導還很少，已發現的 多環芳烴降解菌中，缺少像中度嗜鹽菌這樣能在高鹽度和較寬的鹽度範圍發揮降解作用的菌種，也很少有能夠降解多種多環芳烴類物質的嗜鹽菌。

發明內容
本發明的目的是提供一株可降解多環芳烴的鹽單胞菌。 本發明所提供的鹽單胞菌是從山東省東營市仙河鎮勝利油田的土壤中篩選得到 的。根據其形態特徵、培養特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等證實屬於鹽單 胞菌屬(Halomonas)，將其命名為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A_l。仙河鹽單胞 菌(Halomonas xianhensis) A-I已於2009年3月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究 所)，保藏登記號為CGMCC Na 2941。仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1CGMCC Ns 2941為革蘭氏陰性菌，細胞 呈杆狀、無鞭毛，沒有運動性，大小為(1. 15 1. 40) μ mX (0. 50 0. 63) μ m。該菌株的菌
落呈圓形、光滑、隆起、黃色、有光澤、邊緣整齊特徵。仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-ICGMCC Na 2941 為好氧細菌，可生長 pH 範圍為5. 5 9. 0，最適生長pH值為7. 2 ；可生長溫度範圍為10 42°C，最適生長溫度為 300C ；該菌株屬於嗜鹽微生物，能在0. 05 27. 5%的鹽度範圍內進行生長繁殖，最適宜生 長的鹽度範圍為4 10%。仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941無法利用蔗糖、麥芽糖、 α -乳糖和D-木糖產酸，可利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-半乳糖和 D-葡萄糖產酸；該菌株不能水解明膠和吐溫80 ；該菌株的氧化酶、過氧化氫酶、脲酶為陽 性，DNA酶為陰性；該菌能使硝酸鹽還原，但不具有亞硝酸鹽還原能力；該菌能利用D-阿拉 伯糖、D-纖維二糖、乳糖、酪氨酸、L-天冬醯胺作為唯一碳源和能源。仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Ns 2941對抗生素中的磺胺甲惡 唑、氯林黴素和萬古黴素敏感，而對頭孢曲松、頭孢噻肟鈉、頭孢噻酚鈉、環丙沙星、慶大黴 素、鏈黴素、氨苄青黴素、克拉黴素、紅黴素、盤尼西林和四環素具有抗性。仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Ns 2941細胞中的脂肪酸主要包 括十六碳飽和脂肪酸(27. 1% )、十六碳《7c單不飽和脂肪酸(24. 0% )、十八碳《7c單不 飽和脂肪酸(21. 27% )、ω 8c-環式十九碳飽和脂肪酸(8. 0% )和3_羥基十二碳飽和脂肪 酸，並含有少量的十二碳飽和脂肪酸(3.84% )和十碳飽和脂肪酸(2.79% )；主要呼吸醌 為泛醌Q9。仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis)A-1CGMCC Ns 2941 的 G+C 摩爾百分含 量為67. ；該菌株16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為EF421176，與鹽單胞菌屬 的模式菌株期望鹽單胞菌DSM 9502T (Halomonas desiderata DSM 9502τ)、壁生鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789T)、潘泰萊裡亞鹽單胞菌 DSM 9661T (Halomonas pantelleriensis DSM 9661τ)和坎帕尼亞鹽單胞菌 DSM15293T (Halomonas campaniensis DSM 15293τ)的16S rRNA基因序列同源性分別為96. 0%、95. 6%、95. 5%和95. 3%，與鹽單 胞菌屬其它菌株的16S rRNA基因序列相似性低於95%。仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis)A-ICGMCC Na 2941 與壁生鹽單 胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789τ)和潘泰萊裡亞鹽單胞菌 DSM9661T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661T)的 DNA 雜交同源性都很低，分別為18%和 18% ；同時，該菌株的生理生化特性、細胞壁脂肪酸組成也與上述模式菌株有明顯差異，說 明仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Ns 2941是鹽單胞菌屬的一個新菌種。本發明的另一個目的是提供一種降解多環芳烴的方法。本發明所提供的降解多環芳烴的方法，是用所述仙河鹽單胞菌 (Halomonasxianhensis)A-ICGMCC Na 2941對待測樣品進行處理，使多環芳烴得到降解。上述方法中，所述多環芳烴為菲、蒽或熒蒽。以仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Na 2941為活性成分製備的生 物製劑也屬於本發明的保護範圍。本發明的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Ns 2941是鹽單胞菌 屬的新菌種，分離自石油汙染的高鹽環境，能夠降解菲、蒽或熒蒽等多種多環芳烴，並利用 菲、蒽或熒蒽作為生長的唯一碳源。在鹽度為5%、加有0.5%酵母粉的液體培養基中，10 天內能將100mg/L的菲全部降解，平均降解速率達IOmg/(L · d)；同時該菌株能夠在高鹽度 (27.5%)和較寬的鹽度範圍內(0.05 27. 5%)生長，屬於中度嗜鹽細菌類，對控制鹽環 境中多環芳烴的汙染有獨特的優勢，尤其適合高鹽環境以及鹽濃度變化較大的環境。本發 明的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Na 2941可用於多環芳烴的降解。下面結合說明書附圖和具體實施方式
對本發明作進一步說明，並非對本發明的限 制。


圖1為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941在掃描電子顯微 鏡下的形態照片圖2為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941在透射電子顯微 鏡下的形態照片圖 3 為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941 的 16S rRNA 基 因序列的系統發育分析4為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941對菲的降解曲線 圖
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例1、仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCCNa 2941的分離及鑑定一、採用醋酸-硝酸混合纖維素膜平板法分離菌株海鹽合成培養基(SSDM)的組成為=NaCl79. 45g/L、MgCl2 · 6H20 6. 9g/L、 MgSO4 ·7Η20 10. 45g/L、CaCl2 · 7Η20 0. 75g/L、KCl 2. lg/L,NaHCO3 0. lg/L,NaBrO. 25g/L、微 量元素溶液lmL/L ；以上各成分的含量對應鹽度為10%的培養基(培養基的鹽度等於培養 基中各無機鹽組分質量之和除以培養基的體積)，其它鹽度的培養基可按此比例進行配製； 另含有(NH4)2SO4 4.0g/L，其餘為水；採用5M KOH濃縮液調節培養基的pH至7. 5。其中，微量元素溶液的組成為=Ca(NO3)2 · 4H20800mg/L、FeSO4. 7H20 400mg/L、CuSO4 · 5H20 80mg/L、 ZnSO4 · 7H20 40mg/L、MnSO4 · 4H20 40mg/L、NaMO4 · 2H20 8mg/L、H3BO3 6mg/L、K2HPO4 500mg/ L，其餘為水。將菲、蒽和熒蒽分別溶解於乙醚中，分別配製成濃度為lmg/mL的菲溶液、蒽溶液 和熒蒽溶液。 在鹽度為5%的上述海鹽合成培養基中加入質量百分含量為1. 5 1. 8%的瓊脂 糖後，0. 06MPa條件下滅菌20min，隨後趁熱將培養基均勻傾倒於玻璃培養皿中，等培養基 凝固後，放置於37°C環境中，使固體培養基表面的水分完全蒸發。隨後在平板培養基的表面 覆上已滅菌的醋酸_硝酸混合纖維素膜(微孔濾膜，孔徑0. 45 μ m、直徑90mm，購自北京經 科宏達生化試劑生物技術公司)，在膜上分別加ImL上述配製的濃度為lmg/mL的菲的乙醚 溶液、蒽的乙醚溶液或熒的乙醚溶液並塗布均勻，待乙醚完全揮發後，蓋好平板待用。同時 將ImL不含菲、蒽或熒蒽的乙醚塗布在上述纖維素膜平板上作為空白對照。將採自山東省東營市仙河鎮勝利油田的土壤樣品加入到鹽度為5%的上述海鹽合 成培養基中，常溫條件下200r/min振蕩30min ；吸取ImL懸浮液於離心管中，5000r/min離 心IOmin ；棄去上清液，再加入相同體積的鹽度為5%的上述海鹽合成培養基進行洗滌。以 上洗滌過程重複3次，再將菌體沉澱進行一系列梯度稀釋後分別塗布在上述含有菲、蒽或 熒蒽的醋酸_硝酸混合纖維素膜平板上，將塗布後的平板置於30°C條件下靜置培養15天。 實驗設三次重複。結果表明，空白對照平板上沒有任何菌落生長，說明沒有外加菲、蒽或熒蒽作為碳 源的平板上，土壤樣本中的微生物無法生長；相應的，在加有菲、蒽或熒蒽的平板上有菌株 能夠生長，說明這些單菌落對應的菌株能夠降解菲、蒽或熒蒽並以菲、蒽或熒蒽為唯一碳源 生長。挑取能夠降解菲的單菌落A-I作進一步研究。二、菌株的形態特徵SSDMY培養基的配製在鹽度為5%的上述步驟一的海鹽合成培養基中加入酵母 粉，使其在培養基中的終濃度為5. 0g/L，0. 06MPa條件下滅菌20min。將上述步驟一分離得到的菌株A-I接種至SSDMY培養基中，當細胞生長至對數生 長後期，菌落大小穩定後，進行單菌落平均狀態的描述。主要包括菌落的大小、顏色、透明 度、溼潤度、菌落表面狀態(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(是否整齊、不規 貝U、放射狀等)。將處於對數生長期的細胞，採用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細胞形 態，結果如圖1和圖2所示；同時進行革蘭氏染色，於40X 100倍的光學顯微鏡下觀察菌體 細胞的形態。結果表明，上述步驟一篩選到的菌株的菌落直徑為2 4mm，呈圓形、光滑、隆起、 黃色、有光澤、邊緣整齊；在電子顯微鏡下觀察，菌體細胞呈杆狀、無鞭毛，沒有運動性，大小 為(1. 15 1. 40) μ mX (0· 50 0. 63) μ m。三、菌株的生長特性上述步驟一篩選到的菌株屬於革蘭氏陰性、好氧細菌。該菌株最適生長PH值是 7. 2，可生長pH範圍是5. 5 9. 0 ；最適生長溫度為30°C，可生長的溫度範圍為10 42°C。 該菌株屬於中度嗜鹽細菌，能在0. 05 27. 5%的鹽度範圍內進行生長繁殖，適宜生長鹽範圍度為4 10%。四、菌株的生化特徵1、碳源利用以SSDM為基本培養基，另包括以Biolog通用的95種碳源的糖、醇、酸作為唯一碳源，檢查菌株細胞的生長。2、糖類產酸糖類產酸培養基的組成為(NH4)2HPO4lg/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、KCl 0. 2g/L、 酵母浸膏0. 2g/L、糖或醇類10g/L，pH7. 2 7. 5 ；上述培養基配好後，加入質量百分含量為 2%的溴百香裡蘭，使其在培養基中的終濃度為lmL/L。在糖類產酸培養基中分別加入D-半乳糖、海藻糖、D-葡萄糖、甘露糖、D-術糖、 D-果糖、麥芽糖和蔗糖，使其在培養基中的終濃度為1%，調節培養基的PH為7.5 ；再在每 升培養基中加入質量百分含量為1. 6%的溴甲酚紫水溶液1 2mL，該指示劑的變色範圍為 pH4.5(黃色) 7.0(紫色)。將上述步驟一篩選到的菌株接種於上述培養基中後，35°C培 養24h後開始觀察培養基的顏色。以不接種上述步驟一篩選到的菌株的試管為陰性對照。 培養基顏色變黃色者為產酸陽性菌株，陰性反應要連續觀察7 14d。3、澱粉水解肉湯培養基的組成為牛肉膏3g/L、蛋白腖10g/L、NaCl 5g/L。在肉湯培養基中加入可溶性澱粉，使其在培養基中的終濃度為0.2%。將上述步驟 一篩選到的菌株點接於上述培養基平板上(每個平板點接5株)，35°C培養2 5d形成菌 苔後，在平板上滴加Lugal氏碘液(同革蘭氏染色的碘液)，使碘液覆蓋在平板表面。如在 菌苔周圍或菌苔下(將菌苔移去後觀察)的培養基由藍色變為透明，則為澱粉水解陽性菌 株；若菌苔下和菌苔周圍的培養基都為深藍色，說明該菌株為澱粉水解陰性。4、明膠水解明膠水解培養基的組成為蛋白腖5g/L、明膠100 150g/L，pH7. 2 7. 4。將明膠水解培養基調pH為7. 2 7. 4，分裝於試管中，使管中培養基的高度約為 4 5cm。取上述步驟一篩選到的菌株穿刺接種於上述培養基中，20°C培養2d後觀察結果。 為判斷陰性結果，需培養3 4周。若培養基部分或者全部變成可流動的流體，則為明膠水 解陽性菌株；若仍為固態，則說明是明膠水解陰性菌株。5、吐溫80水解在鹽度為5%的SSDMY培養基中加入吐溫80，使其在培養基中的終濃度為1%，將 上述步驟一篩選到的菌株接種於上述培養基中，每個平板點接3 5株，35°C培養2 4d， 菌落周圍有白色暈圈出現為陽性反應。6、氧化酶活性將上述步驟一篩選到的菌株接種在SSDMY固體培養基上，30°C培養24h。在一乾淨 的培養皿內放一張「新華1號」定性濾紙，滴加質量百分含量為的四甲基對苯二胺鹽酸 鹽溶液使濾紙浸溼，用竹籤挑取菌苔，在濾紙上畫線。Irnin之內濾紙變紫色者為陽性反應， 反之為陰性反應。7、過氧化氫酶活性將上述步驟一篩選到的菌株接種於SSDMY固體培養基斜面上，30°C培養24h，在菌苔上加入數十滴體積百分含量為3%的H2O2溶液，立即檢查結果。在5min之內出現氣泡者為陽性反應，但是往往立即出現氣泡，個別菌株也會在Imin之內出現氣泡；無氣泡出現者 為陰性反應。8、DNA 酶活性提取上述步驟一篩選到的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941的DNA，在鹽度為5%的SSDMY培養基中分別加入上述DNA和甲苯胺蘭 (Toluid-blue)，使其在培養基中的終濃度分別為2%。和0. 1%。，將上述步驟一篩選到的菌 株接種於上述培養基中，每個平皿點接3 5株，35°C培養2 4d，如果菌落周圍有粉紅色 暈圈出現則為反應陽性，反之為陰性。9、脲酶活性在鹽度為5%的SSDMY培養基中加入酚紅，調節pH值，使溶液呈橙黃色，0. 06MPa 滅菌20min，待培養基冷卻至40 50°C時加入過濾除菌的尿素溶液，使其在培養基中的終 濃度為2%，製作試管斜面。將上述步驟一篩選到的菌株劃線接種於上述試管斜面上，35°C 培養2 4d後觀察結果，培養基變成粉紅色為陽性，反之為陰性反應。10、硝酸鹽還原反應硝酸鹽還原能力檢測培養基的組成為蛋白腖10g/L、琥珀酸鈉10g/L、NaN03lg/L、 K2HPO4 lg/L, MgSO4 0.5g/L、KCl 0. 2g/L ;ρΗ7· 2。將上述步驟一篩選到的菌株接種於上述培養基中，分別在接種2、5和7d後檢查硝 酸鹽還原情況，以不接種上述步驟一篩選到的菌株的培養基作為空白對照。具體檢查方法如下在白色比色皿中加入1滴含有上述步驟一篩選到的菌株的菌 液，再加入Griess試劑A、B各1滴，如出現粉紅、玫瑰紅、橙色或棕色，則表明硝酸鹽被還原 成亞硝酸；如加入Griess試劑後無顏色變化，可加入二苯胺試劑3 5滴，若出現藍色反 應，說明培養液中的硝酸鹽依然存在，則該菌為硝酸鹽反應陰性；如果加入二苯胺試劑後無 任何顏色出現，說明亞硝酸鹽被進一步分解為其他產物，為硝酸鹽反應陽性。以上實驗結果表明，上述步驟一篩選到的菌株不能利用蔗糖、麥芽糖、α -乳糖和 D-木糖產酸，可利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖產 酸；該菌株不能水解吐溫80、明膠和可溶性澱粉；該菌株有氧化酶、過氧化氫酶、脲酶和硝 酸鹽還原的活性，但是沒有DNA酶、亞硝酸還原的活性；該菌株能利用D-阿拉伯糖、纖維二 糖、乳糖、酪氨酸、L-天冬醯胺作為唯一碳源和能源。五、抗生素抗性上述步驟一篩選到的菌株對抗生素中的磺胺甲惡唑、氯林黴素和萬古黴素敏感； 而對頭孢曲松、頭孢噻肟鈉、頭孢噻酚鈉、環丙沙星、慶大黴素、鏈黴素、氨苄青黴素、克拉黴 素、紅黴素、盤尼西林和四環素具有抗性。六、與鹽單胞菌屬模式菌株生理生化特徵的比較將上述步驟一篩選到的菌株的生理生化特徵與鹽單胞菌屬模式菌 株的生理生化特徵相比較，結果如表1所示。其中，潘泰萊裡亞鹽單胞菌DSM 9661T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661τ)和壁生鹽單胞菌 DSMZ 14789T(Halomonas muralisDSMZ 14789τ)均來自德國微生物和細胞培養物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Culture, DSMZ)。
表1篩選得到的菌株與鹽單胞菌屬模式菌株的生理生化特徵比較 表1中，+表示結果為陽性，-表示結果為陰性，ND表示未檢測，W表示反應較弱。七、菌株的細胞化學成分分析
1、呼吸醌的檢測(1)取質量大於Img的上述步驟一篩選到的菌株，10000r/min離心lOmin，用30mL 質量百分含量為的NaCl溶液洗滌菌體，離心。(2)將上述步驟(1)得到的菌體沉澱轉入50mL離心管中，加入質量百分含量為 的NaCl溶液IOmL和由氯仿-甲醇組成的混合液(氯仿和甲醇的體積比為2 l)20mL,
振蕩均勻直至菌體分散，4°C 10000r/min離心lOmin。(3)離心後樣品分三層，上層是水，中層是殘渣物，下層是氯仿(脂溶性成分)，用 滴管小心去除上層水層，將下層氯仿層轉移至IOOmL茄形瓶中。(4)再次用20mL由氯仿-甲醇組成的混合液(氯仿和甲醇的體積比為2 1)對 中間混層進行萃取，振蕩30min以上，4°C 10000r/min離心lOmin，小心將氯仿層轉移合併 至上述步驟(3)的IOOmL茄形瓶中，重複萃取殘渣過程1次，合併萃取液。(5)將萃取液合併在IOOmL茄形瓶中，40°C水浴，用旋轉蒸發儀濃縮蒸乾後，在茄 形瓶中加入20mL正己烷，搖床振蕩30min，用滴管轉移至50mL離心管中。(6)加入IOmL純水於離心管中，劇烈振蕩清洗兩次，小心移出上層溶液至IOOmL茄 形瓶中，用旋轉蒸發儀濃縮蒸乾後，加入20mL正己烷溶解(此步注意不要引入水)。(7)將兩個S印-Park Plus Silica連接，用5mL正己烷衝洗小柱子，將上述步驟 (6)製備的樣品上柱，使流速控制在10-20滴/min以內，再用20mL的正己烷以同樣流速洗 柱子。(8)採用含2%體積百分含量乙醚的正己烷洗脫液20mL進行洗脫，甲基萘醌類 (menaquinone)洗出液接入到50mL茄形瓶中；再用含10%體積百分含量乙醚的正己烷洗脫 液20mL進行洗脫，泛醌(ubiquinone)洗出液接入到另一 50mL茄形瓶中。(9)將上述步驟(8)中的兩個樣品分別用旋轉蒸發儀蒸發掉溶劑，加入2_3mL丙 酮，小型搖床上搖動數分鐘，最後分別轉移至保存管中(溶液顏色與樣品有關)。(10)將保存管抽至真空，加入200uL丙酮，隨後採用高效液相色譜分析，採用C18反 相色譜柱，流動相為甲醇和異丙醚的混合液(體積比9 2)。結果表明，上述步驟一篩選到的菌株主要以輔酶Q9(泛醌9)作為主要呼吸醌。2、脂肪酸檢測(1)溶液的配製溶液I 將45g氫氧化鈉溶於300mL甲醇的水溶液中(甲醇和水的體積比為 1:1);溶液II 將190mL比重為1. 19g/mL的濃鹽酸和275mL甲醇溶於135mL蒸餾水中；溶液III 將200mL正己烷與200mL乙醚混合均勻；溶液IV 將10. 8g氫氧化鈉溶於900mL蒸餾水中；溶液V 飽和的氯化鈉溶液(質量百分含量為26. 5% )。(2)提取方法和步驟取適量上述步驟一篩選到的菌株的培養物置於SmL螺口玻璃管中，加入ImL溶液 I，擰緊螺蓋，沸水浴5min，取出振蕩5-lOs，再度擰緊螺蓋，繼續沸水浴25min ；待樣品冷卻後，加入2mL溶液II，擰緊螺蓋振蕩，隨後精確控制溫度為80士 1 °C，水 浴lOmin，冰浴冷卻；此步驟需嚴格控制溫度和時間，以免羥基酸和環式脂肪酸受到破壞；
在冷卻的樣品管中加入1. 25mL溶液III，快速振蕩IOmin左右，棄去下層水相；在剩餘的有機相中加入3mL溶液IV及幾滴溶液V，快速振蕩5min左右，取三分之 二的上層有機相置於氣相色譜樣品瓶中備用。(3)分析方法採用氣相色譜儀(HP 6890)，配備分流/不分流進樣口，氫火焰離子化檢測器(FID)及氣相色譜化學工作站(HP Chemstation ver A 5. 01)；色譜柱為Ultra-2柱(長 25m,內徑0. 2mm,液膜厚度0. 33 μ m)；爐溫為二階程序升溫起始溫度170°C，每分鐘升溫 5°C至260°C，隨後以40°C /min升溫至310°C，維持1. 5min ；進樣口溫度250°C，載氣為氮氣， 流速為0.5mL/min，分流進樣模式，分流比100 1，進樣量2 μ L ；檢測器溫度為300°C，氫氣 流速30mL/min，空氣流速216mL/min，補充氣(氮氣)流速30mL/min。結果表明，上述步驟一篩選到的菌株細胞壁脂肪酸中主要包括十六碳飽和脂 肪酸(27. 1%)、十六碳《7c單不飽和脂肪酸(24.0%)、十八碳《7c單不飽和脂肪酸 (21.27% ω 8c-環式十九碳飽和脂肪酸(8.0%)和3_羥基十二碳飽和脂肪酸，還含有 少量的十二碳飽和脂肪酸(3. 84% )和十碳飽和脂肪酸(2. 79% )。將該菌細胞壁中脂肪酸組成與潘泰萊裡亞鹽單胞菌DSM 9661T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661τ)和壁生鹽單胞菌 DSMZ 14789T(Halomonas muralisDSMZ 14789τ)進行比較，結果如表2所示。表2篩選得到的菌株與鹽單胞菌屬模式菌株的脂肪酸組成比較 八、菌株的16S rRNA基因序列測定和系統發育分析提取上述步驟一篩選到的菌株的總DNA，採用細菌16S rDNA通用引物，正向引物 為 5 『 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 『，反向引物為 5 『 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 『進行 PCR 擴增。PCR反應條件為先94°C 6min;然後94°C 45s，54°C 45s, 72°C 90s，共30個循環； 最後72°C延伸lOmin。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收後連接到T-Easy載體上，送英俊生物有限公 司進行測序；採用Clustal X程序(1. 64b)，系統發育分析通過MEGA (2. 1)軟體採用近鄰結 合法和最大簡約法分析。
結果表明，上述步驟一篩選到的菌株的16S rRNA基因序列如GenBankAccession No. EF421176所示，其16S rRNA基因序列的系統發育分析圖如圖3所示。根據其16S rRNA基因序列比對和系統發育分析結果判定，上述步驟一篩選到 的菌株屬於鹽單胞菌屬(Halomonas)，並且與鹽單胞菌屬的模式菌株期望鹽單胞菌DSM 9502T (Halomonas desiderata DSM 9502τ)、壁生鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789T)、潘泰萊裡亞鹽單胞菌DSM 14789T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661τ)和 坎帕尼亞鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonascampaniensis DSM 15293τ)的 16S rRNA 基因序 列的同源性分別為96.0%,95. 6%,95. 5%和95. 3%，與鹽單胞菌屬其它菌株的16S rRNA 基因序列的相似性低於95%。九、與鹽單胞菌屬模式菌株的DNA-DNA雜交分析1、菌體細胞基因組DNA純度的測定提取上述步驟一篩選到的菌株的總DNA，取10 μ L DNA樣品於1. 5mL離心管中，力口 入190 μ L 0. 1 X SSC溶液進行溶解，使總體積為200 μ L，即將DNA樣品稀釋20倍，用槍吸打 數次，將DNA樣品混勻、打碎。用紫外分光光度計分別測量260nm、280nm、230nm和270nm時 的紫外吸收值，適合做DNA/DNA雜交實驗的DNA樣品必須符合以下條件0D(260nm)/0D(280nm) > 1. 8，說明蛋白質含量符合要求；OD (260nm) /OD (230nm) > 2. 0，說明糖含量符合要求；OD (260nm) > OD (270nm)，說明酚含量符合要求。2、G+C摩爾百分含量的測定採用熱變性溫度法測定DNA樣品的G+C摩爾百分含量，儀器包括紫外分光光度計 (Lambda Bio 20型)、溫度控制儀(PTP-I)、循環水浴。整個測定過程由UV Winlab軟體控 制。具體測定過程如下(I)Tm值的測定將上述DNA樣品用0. IX SSC溶液進行適當稀釋，使其吸光度為0. 2 0. 5 ；依次 打開UV Winlab軟體中的DNADEF. MTD窗口和PE Applications軟體中的Templab窗口設 定合適的參數，然後開始測定。在兩個比色杯中各加入ImL 0. 1 X SSC溶液，將比色杯放入比色架內，根據計算機 的提示進行儀器的調零；然後將比色杯取出，加入200 μ L上述稀釋好的DNA樣品溶液，插入 溫度傳感器探頭，將比色杯放回可加熱的比色架內，通過計算機控制溫控儀升溫，在30min 內使樣品溫度由70°C均勻的上升到90°C，其間記錄DNA樣品在260nm處的吸光值，得到DNA 樣品的變性曲線。測定結束後，利用計算機相關軟體計算出變性曲線的一階導數曲線，記錄 一階導數曲線峰值所對應的溫度，即為DNA樣品的解鏈溫度，即Tm值。(2) DNA的G+C摩爾百分含量的計算如果DNA的G+C摩爾百分含量值在25 % 75 %的範圍內，其Tm值與DNA的G+C 摩爾百分含量之間呈線形關係。為消除溫度誤差及其他實驗誤差，需用大腸桿菌K12菌株 (購自北京經科宏達生化試劑生物技術公司)的DNA作為參照。在0.1 XSSC溶液中，G+C 摩爾百分含量的計算公式為DNA 的 G+C 摩爾百分含量=51. 2+2. 08 X [Tm(X)-Tm(R)]。其中，Tm⑴為上述步驟一篩 選到的菌株的Tm值；Tm(R)為大腸桿菌K12菌株的Tm值。3、DNA-DNA 雜交試驗(I)DNA樣品的剪切用於DNA-DNA雜交的樣品濃度要求A26tl (260nm吸光度)大於 2. 0 (約100 μ g/mL)。先將上述步驟一篩選到的菌株的DNA用0. 1 X SSC調到A26tl = 2. 0左 右，為使樣品的濃度一致，要求各樣品的A26tl值的差異小於0. 1。取3mL上述步驟一篩選到的 菌株的DNA置於5mL離心管中，加入0. 72mL 10 X SSC溶液，使緩衝液的終濃度為2 X SSC。用 超聲波剪切DNA樣品，其輸出功率為6W，剪切的時間為4min，間隔時間為2s，重複3次。因超 聲波剪切時會產生相當的熱量，可能導致剪切的DNA樣品發生降解，因此在剪切過程中DNA 樣品應置於冰上。剪切完畢後迅速將樣品按0. 6mL分裝在1.5mL離心管中，置於-20°C保存。 通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測樣品的剪切質量。一般要求DNA片段的大小集中在2X IO5 5 X IO5Da (400 800bp)。(2) DNA變性將上述剪切過的DNA用0. IX SSC溶液精確配製成OD26tl為1. 5-2. 0， 根據公式T0R(最適復性溫度)=0. 51X (G+C摩爾百分含量)+47°C，計算TOR值，根據TOR 值設定溫度，預熱比色杯。(3)打開分光光度計和電腦，選擇合適的程序，固定波長為260nm，固定溫度為 T0R，用2 X SSC溶液調零，總時間為30min，每隔15s測一次吸光度值。(4)吸取200 μ L上述製備的DNA樣品，分別和200 μ L預備雜交的DNA (即同一屬 的模式菌株期望鹽單胞菌DSM 9502T (Halomonas desiderata DSM 9502τ)、壁生鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789T)、潘泰萊裡亞鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonas pantelleriensis DSM 9661τ)和坎帕尼亞鹽單胞菌 DSM14789T (Halomonas campaniensis DSM 15293τ)的基因組DNA)混合，將上述DNA混合液分別加到1. 5mL離心管中，同時加 400 UL 10X SSC於另一離心管中，將上述離心管全部放入100°C水浴IOmin後，用預熱的槍 頭吸取96 μ L熱的10XSSC溶液加入到裝有上述DNA混合液的熱的離心管中，使其終濃度 為2X SSC,迅速吸取稀釋後的DNA混合溶液200 μ L加入到預熱到TOR溫度值的比色杯中， 測定吸光度，並做出復性曲線。(5)根據下面的公式計算雜交率 式中Va、Vb、Vm分別表示樣品A、B和混合樣品M(A+B)的復性速率。4、DNA-DNA雜交分析結果上述實驗結果表明，上述步驟一篩選到的菌株的DNA與已發表的鹽單胞菌屬的模 式菌株潘泰萊裡亞鹽單胞菌DSM 9661T(Halomonas pantelleriensis DSM 9661τ)和壁生鹽 單胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789τ)的 DNA 同源性都比較低，分別為 11 % 和18%。且該菌株的G+C摩爾百分含量為67. 1%，而潘泰萊裡亞鹽單胞菌DSM 9661τ和壁 生鹽單胞菌DSM 14789τ的G+C摩爾百分含量分別為65. 0%和62. 4%。基於以上測定結果，將上述步驟一篩選到的菌株鑑定為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1，並於2009年3月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為 CGMCC Na 2941。
實施例2、仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1CGMCC Ns 2941 降解菲的性 能將菲溶於二甲基甲醯胺中，過濾除菌；在鹽度為5%的上述實施例1的海鹽合成培 養基中加入酵母粉，使其在培養基中的終濃度為0. 5%，同時在培養基中加入上述過濾除菌 的菲溶液，使菲在培養基中的終濃度為100mg/L。將仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-ICGMCC Ns 2941 按照 5% 的接種量接 入上述培養基中，在30°C、轉速為200r/min的好氧避光條件下培養10d。同時，以不加菲但 是加入二甲基甲醯胺的培養基作為對照，用於檢查仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC No 2941是否能利用二甲基甲醯胺；以不接種細菌的作為空白對照，用於扣除菲 揮發的影響；以接種仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis)A-ICGMCC Na 2941死菌體的作 為死菌對照，用於扣除菌體吸附的影響。培養過程中，定時取樣，利用高效液相色譜法(HPLC)測定菲的降解率； Waters600E液相色譜儀，色譜柱為Supelcosil LC18-DB,流動相(甲醇和水，體積比為 80 20)，流速 lmL/min，檢測波長 254nm。實驗設三次重複。菲的降解曲線如圖4所示，結果表明，仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Na 2941在10天內能將100mg/L的菲全部降解，對菲的平均降解速 率可達 IOmg/ (L · d)。實施例3、仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941 降解蒽的性 能將蒽溶解於乙醚中，配製成為濃度為lmg/mL的溶液。在鹽度為5%的上述海鹽合成培養基中加入質量百分含量為1. 5 1. 8%的瓊脂 糖後，0. 06MPa條件下滅菌20min，隨後趁熱將培養基均勻傾倒於玻璃培養皿中，等培養基 凝固後，放置於37°C環境中，使固體培養基表面的水分完全蒸發。隨後在平板培養基的表面 覆上已滅菌的醋酸_硝酸混合纖維素膜(微孔濾膜，孔徑0. 45 μ m、直徑90mm，購自北京經 科宏達生化試劑生物技術公司)，在膜上加ImL上述配製的濃度為lmg/mL的蒽的乙醚溶液 並塗布均勻，待乙醚完全揮發後，蓋好平板待用。同時將不含蒽的乙醚塗布在上述纖維素膜 平板上作為空白對照。將仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-ICGMCC Ns 2941 接種於 SSDMY 液體 培養基中，常溫條件下140r/min振蕩培養4天；吸取ImL菌懸液於離心管中，5000r/min離 心IOmin ；棄去上清液，將菌體沉澱塗布在上述含有蒽的醋酸-硝酸混合纖維素膜平板上， 將塗布後的平板置於30°C條件下靜置培養15天。結果表明，空白對照平板上沒有任何菌落生長，說明沒有外加蒽作為碳源的平板 上，仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941無法生長；相應的，在加有蒽 的平板上仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941能夠生長，說明仙河鹽 單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941能夠降解蒽並以蒽為唯一碳源生長。實施例4、仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Ns 2941 降解熒蒽的 性能將熒蒽溶解於乙醚中，配製成為濃度為lmg/mL的溶液。
在鹽度為5%的上述海鹽合成培養基中加入質量百分含量為1. 5 1. 8%的瓊脂 糖後，0. 06MPa條件下滅菌20min，隨後趁熱將培養基均勻傾倒於玻璃培養皿中，等培養基 凝固後，放置於37°C環境中，使固體培養基表面的水分完全蒸發。隨後在平板培養基的表面 覆上已滅菌的醋酸_硝酸混合纖維素膜(微孔濾膜，孔徑0. 45 μ m、直徑90mm，購自北京經 科宏達生化試劑生物技術公司)，在膜上加ImL上述配製的濃度為lmg/mL的熒蒽的乙醚溶 液並塗布均勻，待乙醚完全揮發後，蓋好平板待用。同時將不含熒蒽的乙醚塗布在上述纖維 素膜平板上作為空白對照。將仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-1CGMCC Ns 2941 接種於 SSDMY液體培 養基中，常溫條件下140r/min振蕩培養4天；吸取ImL菌懸液於離心管中，5000r/min離心 IOmin ；棄去上清液，將菌體沉澱塗布在上述含有熒蒽的醋酸-硝酸混合纖維素膜平板上， 將塗布後的平板置於30°C條件下靜置培養15天。結果表明，空白對照平板上沒有任何菌落生長，說明沒有外加熒蒽作為碳源的平 板上，仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941無法生長；相應的，在加有 熒蒽的平板上仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Ns 2941能夠生長，說明仙 河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2 941能夠降解熒蒽並以熒蒽為唯一碳 源生長。
權利要求
仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1，其保藏登記號為CGMCC№2941。
2.仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-1CGMCC Ns 2941在降解多環芳烴中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述多環芳烴為菲、蒽或熒蒽。
4.一種降解多環芳烴的方法，是用權利要求1所述仙河鹽單胞菌 (Halomonasxianhensis)A-lCGMCC No 2941對待測樣品進行處理，使多環芳烴得到降解。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述多環芳烴為菲、蒽或熒蒽。
6.一種降解多環芳烴的生物製劑，其活性成分為權利要求1所述仙河鹽單胞菌 (Halomonas xianhensis)A-1CGMCC Ns2941。
7.根據權利要求6所述的生物製劑，其特徵在於所述多環芳烴為菲、蒽或熒蒽。
全文摘要
本發明公開了一株可降解多環芳烴的鹽單胞菌及其應用。本發明的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1CGMCC№2941是鹽單胞菌屬的新菌種，分離自石油汙染的高鹽環境，能夠降解菲、蒽或熒蒽等多種多環芳烴，並利用菲、蒽或熒蒽作為生長的唯一碳源。在鹽度為5％、加有0.5％酵母粉的液體培養基中，10天內能將100mg/L的菲全部降解，平均降解速率達10mg/(L·d)；同時該菌株能夠在高鹽度(27.5％)和較寬的鹽度範圍內(0.05～27.5％)生長，屬於中度嗜鹽細菌類，對控制鹽環境中多環芳烴的汙染有獨特的優勢，尤其適合高鹽環境以及鹽濃度變化較大的環境。本發明的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1CGMCC№2941可用於多環芳烴的降解。
文檔編號C12N1/20GK101838616SQ20091008001
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月17日 優先權日2009年3月17日
發明者寧大亮, 王慧, 趙百鎖 申請人:清華大學