一種固定化細胞及其應用的製作方法
2023-06-24 08:30:41 3
一種固定化細胞及其應用的製作方法
【專利摘要】一種固定化細胞及其應用，該固定化細胞採用以下方法製成，包括以下步驟：(1)碳纖維預處理；(2)製備細胞種子菌；(3)固定化細胞：可採用以下三種方法之一進行，(a)預處理的短切碳纖維成球之後，與細胞接觸，製成成球碳纖維載體固定化細胞；(b)菌種先生長繁殖到12～24h後，再與成球碳纖維載體接觸，製成成球碳纖維載體固定化細胞；(c)預處理過的短切碳纖維成球與細胞生長繁殖同步進行，製成成球碳纖維載體固定化細胞。本發明之固定化細胞是成球顆粒，具有總表面積大、機械強度高、發酵穩定性好以及便於操作等優點，適宜連續化使用，更適合於進行多酶體系連續反應，尤其可高效多批次發酵生產木糖醇，在生物發酵工業中具有廣泛的發展前途，成球碳纖維載體在細胞的固定化領域中也具有很大的應用範圍。
【專利說明】—種固定化細胞及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種固定化細胞及其應用。
【背景技術】
[0002]固定化細胞是在固定化酶的基礎上發展起來的新技術，即利用化學或物理手段將游離細胞定位於限定的空間區域並使其保持活性和可以反覆使用的一種基礎技術。固定化細胞保持了細胞的生命活動能力，它不但比游離細胞的發酵更具有優越性，而且比固定化酶有更多的優點，比如:它免除了破碎細胞來提取胞內酶的手續，降低製備成本；細胞生長停滯時間短，細胞多，反應快，抗汙染能力強，可以連續發酵，反覆使用，應用成本低；酶在細胞內的環境中穩定性較高，完整細胞固定化後，酶活力的損失較少等。
[0003]目前，在細胞固定化方法中，應用最廣的是包埋法，包埋法的載體主要是有機高聚物。在包埋技術發展的初期，以使用聚丙烯醯胺等合成高聚物為主，如今已逐漸轉向使用毒性小，不會損害細胞的海藻酸鹽、卡拉膠及瓊脂等天然聚合物。但是天然聚合物抗微生物分解性能較差，機械強度較低。吸附法也是常用的細胞固定化方法之一，吸附法具有兩大優點，即簡單及合乎細胞的生理條件。當載體與細胞懸浮液混合後，細胞便吸附在載體的表面。因為載體是惰性的，且沒有化學試劑參與過程，所以被固定的細胞系處在與懸浮細胞相同的生理條件下，這樣就不會影響細胞的生長，也不會影響細胞的特性和活力。吸附法固定化細胞的性能關鍵因素取決於選取的固定化載體材料和固定化所採用的方法。其中，固定化載體材料作為固定化細胞的一部分，載體材料的結構和性能對固定化細胞的各種性能都有著巨大直接的影響。細胞固定化對載體材料的要求很高，目前，細胞使用的固定化載體材料的主要有:有機高分子載體、無機載體、複合載體三種。有機高分子載體具有很強的靈活性，可根據不同類型的細胞來設計與之相匹配的載體材料，並且也具有較大的強度、對微生物的腐蝕有較強的抵抗力，但傳質性能較差，這對細胞固定時對細胞活性的影響較大。無機載體具有一些有機材料不具備的優點，例如，穩定性好、機械強度高、對微生物無毒性、不易被微生物所分解、耐酸鹼、成本低、壽命長等；但固定化效率一般來說比較低。複合載體具有從反應體系中易分離和回收、操作簡便、成本較低的優點；但技術發展得還不成熟。當前，細胞固定化所需載體成本高，並且載體也不能在固定化過程中重複使用，顆粒狀的固定化方法製作也困難，從而導致固定化細胞技術工業推廣困難。因此，設計、開發和製備性能優異可控的載體材料已成為固定化細胞研究的熱點之一。
[0004]碳纖維是一種含碳量在95%以上的高強度、高模量纖維的新型纖維材料，具有生物相容性好、化學性能穩定，高比表面積、耐高溫等優良性能，這些特點決定碳纖維以及活性炭纖維具備成為良好的細胞固定化載體的特性。目前，碳纖維類材料作為固定化載體的優越性已逐漸被越來越多的研究人員所重視。但是碳纖維材料作為細胞固定化載體的研究和應用僅限於考量固定化效果方面的研究。碳纖維作為固定化載體的材料特性與細胞的固定化機制及相互作用關係幾乎沒有報導，尤其是載體的成球製備方法和固定化細胞更是研究的甚少。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是，提供一種固定化細胞及其應用，該固定化細胞具有總表面積大、機械強度高、反覆利用次數多以及便於操作的優點，可應用於多批次發酵生產木糖醇。
[0006]本發明解決其技術問題採用的技術方案是:
[0007]本發明之一種固定化細胞，可採用以下方法製成，包括以下步驟:
(1)碳纖維預處理:將碳纖維切成長度為0.3cm?0.8cm短切碳纖維放入有機溶劑中浸泡3?5h，過濾或離心回收上清液，用相當於3?5倍碳纖維體積的水對短切碳纖維進行清洗，然後將清洗後的短切碳纖維浸泡於體積大於3倍碳纖維體積的沸水浴中處理3?5h後，用水清洗，烘乾，取出備用；
(2)製備細胞種子菌:在無菌條件下，將細胞接種到斜面培養基上，在溫度為28?32°C的條件下培養20?30h，形成種子菌；
(3)固定化細胞:可採用以下三種方法之一進行，(a)先將步驟(I)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入無菌種子培養液中，放置於搖床中，控制搖床轉速為120rpm?220rpm,搖動0.5?4h,可控成球，即得成球碳纖維載體；然後將步驟(2)中製備的細胞種子菌以2%?8%接種到上述含成球碳纖維載體的無菌種子培養液中，放置於搖床中，在28?32°C,控制搖床轉速為120rpm?220rpm,搖動4?24h,即得成球碳纖維載體固定化細胞；或
(b)先將步驟(2)中製備的細胞種子菌以2%?8%接種無菌種子培養液中，放置於搖床中，在28?32°C控制搖床轉速為120rpm?220rpm，搖動12?24h，即得擴大培養的細胞種子菌；然後將步驟(I)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入上述含擴大培養的細胞種子菌的種子培養液中，然後放置於搖床中，控制搖床轉速為120rpm?220rpm,搖動0.5?4h，可控固定化，即得成球碳纖維載體固定化細胞；或
(c)先將步驟(I)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入無菌種子培養液中，然後迅速以2%?8%接種量接種步驟(2)製備的細胞種子菌中，放置於搖床中，控制搖床轉速為120rpm?220rpm,搖動12?24h,可控固定化，即得成球碳纖維載體固定化細胞。
[0008]對於採用以上三種固定化方法之一得到固定化細胞均是是通過對預處理過的短切碳纖維投入時間的改變來引起對細胞固定化時間的改變可控制得。方案(a)是預處理過的短切碳纖維成球之後，與細胞接觸的為已成球的固定化載體，對細胞固定化效果的影響；方案(b)則是生長繁殖之後的菌種，在與成球的固定化載體接觸之後，對細胞固定化效果的影響；方案(C)則是利用預處理過的短切碳纖維成球與細胞生長繁殖同步進行，對細胞固定化效果的影響。三種方案是為了更顯著的表現出成球碳纖維固定化載體的在細胞固定化效果上的優勢。
[0009]進一步，所述製備方法的步驟(I)中，將碳纖維切成長度為0.4?0.6cm短切碳纖維放入丙酮中浸泡4h，過濾或離心回收上清液，用相當於5倍碳纖維體積的蒸餾水對短切碳纖維進行清洗，然後將清洗後的短切碳纖維浸泡於體積6倍碳纖維體積的沸水浴中處理4h後，用蒸餾水清洗，烘乾，取出備用。
[0010]進一步，所述製備方法的步驟(I)中，所述短切碳纖維選自2k碳纖維、3k碳纖維、6k碳纖維、24k碳纖維、補強布中的任一種。
[0011]進一步，所述短切碳纖維選自6k碳纖維。
[0012]進一步，所述製備方法的步驟(3)中，將備用的短切碳纖維，以等量方式每隔
0.5?5分鐘投入一次，共投放3?5次。
[0013]進一步，所述製備方法的步驟(3)中，所述短切碳纖維投入量為2.5?15g/L ;在250mL搖瓶中，所述含無菌種子培養液的量相當於10-50倍碳纖維體積。
[0014]進一步,步驟(3)中,所述細胞種子菌的接種量為5%。
[0015]本發明之一種固定化細胞在多批次發酵生產木糖醇中的應用。
[0016]進一步，其特徵在於，在第一批發酵結束時保留所有成球碳纖維球團及20%?30%的發酵液，同時加入新配製的補液進行第二批的發酵，同樣在第二批發酵結束時再次保留所有成球碳纖維球團及20%?30%的發酵液，加入新配製的補液進行第三批的發酵，以此類推進行十批發酵。
[0017]本發明提出的碳纖維自成球方案，其成球狀態受到一些參數的改變而發生變化:
(1)成球大小的改變
碳纖維自成球的大小主要與碳纖維的加入方法有關。若一次性將2.0?20g/L的碳纖維投入到液體中，然後放入120rpm?220rpm的搖床內搖動0.5?4h後,可能會形成的大小不均一的球團；反之，若將碳纖維分成若干等分，每隔2分鐘投入至液體中，在同等條件下將會形成圖1所示大小均一的小球團。
碳纖維的長短和投入量對碳纖維成球的大小也有一定影響，碳纖維長度和投入量的參數分別在0.4?0.7cm和10?15g/L的條件下,形成大小均一的較小球團。而碳纖維長度大於0.7cm或投入量超過15g/L時,會形成較大型的球團。
(2)成球圓扁的改變
碳纖維成球的形態有的較為飽滿圓滑，而有的則扁平一些。影響成球圓扁形態的主要因素是容器內液體的加入量。若加液量多於5倍碳纖維體積，則生成較扁的碳纖維球團，球團高徑比H/D = 0.6/1?1/0.6 ;而加液量少於3倍碳纖維體積，所生成的碳纖維球團高徑比為H/D = 1/0.4?0.4/1 ;若加液量剛剛能將球覆蓋，碳纖維成球形態較圓滑，球團高徑比為H/D = 1/0.8?0.8/1。另一個影響碳纖維成球圓扁程度的相關因素為液體環境的粘度，在無菌水、含水培養液、含水含菌種培養液中，三者粘度依次增高，在粘度較高的含水含菌種培養液環境下，成球較扁一些，在粘度較低的無菌水中則較為飽滿，但差別不顯著。
(3)成球數量的改變
碳纖維的成球數量與其投入量有關，在投入量為2.0?15g/L的範圍內，成球的數量隨著投入量的增加而增加。此外，碳纖維長度也會對成球數量造成影響，在投入量相同的條件下，選擇長度較短的碳纖維所生成的球團數量較多。
(4)成球均一性的改變
碳纖維成球的均一'丨生對固定化效果有一定影響，成球均一'I"生的改變主要與加入方法、加入的液體量有關，液體的加入量應剛好能覆蓋成球碳纖維，且投入碳纖維時分開等量投入，成球的圓扁控制在高徑比為H/D = 1/0.8?0.8/1左右，使得小球能達到最佳圓滑飽滿程度，並在水中分布均勻。
(5)碳纖維種類所引起的成球差異通過投入不同種類的碳纖維，包括2k碳纖維、3k碳纖維、6k碳纖維、24k碳纖維、補強布等，發現不同種類的碳纖維在可控成球方面具有不同的形態特徵。在所選碳纖維種類中，纖維束較少的碳纖維所成球更加圓滑，但數量較少；而纖維束較多的碳纖維數量較多，但也有可能會形成較大的球團。
[0018]本發明利用碳纖維可控成球這一技術，主要通過物理吸附法使細胞吸附在碳纖維表面固定，形成固定化細胞。其中，碳纖維材料，無論是活性炭纖維還是改性後的碳纖維，其在固定化應用中所使用的固定方法多通過自身物理吸附性對細胞進行固定。其優勢在於，可通過改變條件，控制碳纖維在液體環境下的成球效果；利用成球的碳纖維載體，對細胞進行固定化。
[0019]本發明之固定化載體碳纖維具有可控成球的現象，機理在於碳纖維受到範德華力、靜電排斥力和空間斥力和疏水力的作用達到平衡、相互制約，並且形成聚結態。同時又受到搖床所給的撞擊力、向心力和水的壓力作用而形成球狀。碳纖維載體的成球大小、圓扁、數量等受到碳纖維自身和外部環境的影響。
[0020]本發明之固定化細胞是成球顆粒，具有總表面積大、抗拉強度高、發酵穩定性好以及便於操作等優點，適宜連續使用，更適合於進行多酶體系連續反應，尤其可高效多批次發酵生產木糖醇，在生物發酵工業中具有廣泛的發展前途，成球碳纖維載體在細胞的固定化領域中也具有很大的應用範圍。本發明在製備固定化細胞時，操作簡單，固定化過程溫和，原料廉價易得，成本低。實驗證明，在連續發酵過程中，成球碳纖維固定化載體的比表面積可達14m2/g,細胞的固定化效率超過33%,成球碳纖維載體的固定化效率大於1.2g/g,細胞固定化載體的抗拉強度在3500兆帕以上，成球碳纖維載體固定化細胞可連續發酵使用10次仍保持良好性能，木糖醇的產率可達70%以上(以初始木糖計)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為可控成球的碳纖維載體固定化細胞。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例，對本發明的具體的實施方式進一步詳細描述。以下實施例是用來進一步說明本發明的內容，而不限制本發明的保護範圍。對於本發明所涉及的相關內容及所做的修改，均屬於本發明保護範圍。
[0023]實施例1:成球碳纖維固定化假絲酵母細胞發酵木糖醇
[0024]將6k碳纖維短切成0.5cm的長度，然後進行預處理:在丙酮中浸泡4h後，過濾回收清液，用相當於5倍碳纖維體積的蒸餾水對短切碳纖維進行清洗，然後將清洗後的短切碳纖維浸泡於體積6倍碳纖維體積的沸水浴中處理4h後，取出短切碳纖維，用蒸餾水衝洗乾淨，放入風箱烘乾，取出備用。
[0025]成球碳纖維載體固定化細胞的種子培養液:木糖(20g/l),葡萄糖(20g/l),酵母浸粉(10g/l)，硫酸鎂(0.04g/l)，磷酸氫鉀(0.4g/l)，pH 為 4.0 ?5.5。
[0026]成球碳纖維載體固定化細胞的發酵培養液:木糖(80g/l),葡萄糖(15g/l),酵母浸粉(8g/l)，pH為4.0?5.0，首先將培養液在121 °C的高溫下滅菌20min，得到菌體發酵培養液留作備用；然後按照20%的裝液量分別加入到三組250ml搖瓶中，並對三組搖瓶分別進行如下操作:
(1)在含發酵培養液的搖瓶投入10g/L的備用預處理碳纖維後，放入搖床中搖動4h，使碳纖維形成大小均一、高徑比為1/0.6?0.6/1的球團；之後對含已成球培養液進行接種，接種量為5%,接著放入轉速為180rpm的搖床中，按照每48h為一批進行連續發酵十批。
(2)將一個含發酵培養液的搖瓶按照5%的接種量進行接種，待24h菌種成長後取出，然後按照10g/L的投入量投入備用預處理碳纖維，接著放入轉速為ISOrpm的搖床中，按照每48h為一批進行連續發酵十批。
(3)將一個含發酵培養液的搖瓶按照10g/L的投入量投入備用預處理碳纖維後，迅速按照5 %的接種量進行接種，然後放入轉速為ISOrpm的搖床中，按照每48h為一批進行連續發酵十批。
其中每批次發酵結束時需進行換液:在第一批發酵結束時保留所有成球碳纖維球團及約30%的發酵液，同時加入新配製的補液進行第二批的發酵。同樣在第二批發酵結束時再次保留所有成球碳纖維球團及約30%的發酵液，加入新配製的補液進行第三批的發酵。以此類推進行十批發酵，並對發酵產率和固定化效率進行檢測。
[0027]每次所得產物的固定化效果及木糖醇得率通過以下方法測定:
(1)固定化效率的測量方法採用的是重量法:細胞/酶的固定化效率計算為固定菌重/總菌重或固定酶重/總酶重);而載體固定化效率計算為固定菌重/載體重量(g/g);
(2)木糖醇測定方法採用國標法
(3)成球碳纖維載體的抗拉強度的測定:依據國標6B3354-82，利用電子拉伸機進行測定。
[0028]本實施例中測得連續發酵過程中，成球碳纖維載體的固定化效率1.0?1.2g/g，細胞的固定化效率為33?35%，成球碳纖維載體固定化細胞可連續發酵使用10次，木糖醇的產率可達70?72% (以初始木糖計)；本實施例測得細胞固定化載體的抗拉強度為3500兆帕。
【權利要求】
1.一種固定化細胞，其特徵在於，可採用以下方法製成，包括以下步驟: (1)碳纖維預處理:將碳纖維切成長度為0.3cm?0.8cm短切碳纖維放入有機溶劑中浸泡3?5h，過濾或離心回收上清液，用相當於3?5倍碳纖維體積的水對短切碳纖維進行清洗，然後將清洗後的短切碳纖維浸泡於體積大於3倍碳纖維體積的沸水浴中處理3?5h後，用水清洗，烘乾，取出備用； (2)製備細胞種子菌:在無菌條件下，將細胞接種到斜面培養基上，在溫度為28?32°C的條件下培養20?30h，形成種子菌； (3)固定化細胞:可採用以下三種方法之一進行，(a)先將步驟(1)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入無菌種子培養液中，放置於搖床中，控制搖床轉速為120rpm?220rpm,搖動0.5?4h,可控成球，即得成球碳纖維載體；然後將步驟(2)中製備的細胞種子菌以2%?8%接種到上述含成球碳纖維載體的無菌種子培養液中，放置於搖床中，在28?32°C,控制搖床轉速為120rpm?220rpm,搖動4?24h,即得成球碳纖維載體固定化細胞；或 (b)先將步驟(2)中製備的細胞種子菌以2%?8%接種無菌種子培養液中，放置於搖床中，在28?32°C，控制搖床轉速為120rpm?220rpm，搖動12?24h，即得擴大培養的細胞種子菌；然後將步驟(1)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入上述含擴大培養的細胞種子菌的種子培養液中，然後放置於搖床中，控制搖床轉速為120rpm?220rpm,搖動0.5?4h，可控固定化，即得成球碳纖維載體固定化細胞；或 (c)先將步驟(1)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入無菌種子培養液中，然後迅速以2%?8%接種量接種步驟(2)製備的細胞種子菌中，放置於搖床中，控制搖床轉速為120rpm?220rpm,搖動12?24h,可控固定化，即得成球碳纖維載體固定化細胞。
2.根據權利要求1所述的固定化細胞，其特徵在於，所述製備方法的步驟(1)中，將碳纖維切成長度為0.4?0.6cm短切碳纖維放入丙酮中浸泡4h，過濾或離心回收上清液，用相當於5倍碳纖維體積的蒸餾水對短切碳纖維進行清洗，然後將清洗後的短切碳纖維浸泡於體積6倍碳纖維體積的沸水浴中處理4h後，用蒸餾水清洗，烘乾，取出備用。
3.根據權利要求1或2所述的固定化細胞，其特徵在於，所述製備方法的步驟(1)中，所述短切碳纖維選自2k碳纖維、3k碳纖維、6k碳纖維、24k碳纖維、補強布中的任一種。
4.根據權利要求3所述所述的固定化細胞，其特徵在於，所述短切碳纖維選自6k碳纖維。
5.根據權利要求1?3之一所述的固定化細胞，其特徵在於，所述製備方法的步驟(3)中，將備用的短切碳纖維，以等量方式每隔0.5?5分鐘投入一次，共投放3?5次。
6.根據權利要求1?3之一所述的固定化細胞，其特徵在於，所述製備方法的步驟(3)中，所述短切碳纖維投入量為2.5?15g/L ;在250mL搖瓶中，所述含無菌種子培養液的量相當於10?50倍碳纖維體積。
7.根據權利要求1?3之一所述的固定化細胞，其特徵在於，步驟(3)中，所述細胞種子菌的接種量為5%。
8.根據權利要求1?7之一所述的固定化細胞在多批次發酵生產木糖醇中的應用。
9.根據權利要求7所述的固定化細胞在多批次發酵生產木糖醇中的應用，其特徵在於，在第一批發酵結束時保留所有成球碳纖維球團及20%?30%的發酵液，同時加入新配製的補液進行第二批的發酵，同樣在第二批發酵結束時再次保留所有成球碳纖維球團及20%?30%的發酵液，加入新配製的補液進行第三批的發酵，以此類推進行十批發酵。
【文檔編號】C12N11/14GK104404025SQ201410651984
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月14日 優先權日:2014年11月14日
【發明者】王樂, 王金水, 尹豔麗, 胡元森 申請人:河南工業大學