測定蘆丁與蛋白結合水平的表面等離子體共振分析方法與流程
2023-06-24 03:09:46
本發明涉及分析化學中表面等離子體共振技術的應用方法，具體涉及一種用於測定蘆丁與蛋白質相互作用結合水平的表面等離子體共振分析方法。
背景技術：
表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance,spr)技術是一種在分子間相互作用的分析領域中廣泛使用的方法。其基本原理為利用入射光照射spr傳感晶片，使得入射光產生的倏逝波與傳感晶片表面金屬的表面等離子波發生共振，影響出射光的性質；此後在傳感晶片表面發生相互作用反應，引起共振條件的變化，導致出射光性質發生變化，對其進行監測即可實現對相互作用反應的檢測。在一般的spr分析過程中，相互作用反應的一個參與物往往通過共價鍵、靜電作用、疏水作用等等方式被固定於spr檢測晶片表面，然後將另一個(或幾個)反應的參與物溶解後流動通過該檢測晶片表面。當發生相互作用反應時，反應物的結合或解離將導致檢測晶片的表面性質發生改變，反映為儀器信號的改變。spr技術可以進行快速、靈敏、無標記的分析，經常被用於測定相互作用反應的速率常數、平衡常數等物理化學數據。
蘆丁(rutin)是一種黃酮類化合物，在自然界，特別是植物中廣泛分布，在一些植物的根、莖、葉、果實等器官和組織內都可以被發現。蘆丁的結構式如下：
蘆丁具有明顯的生理活性，是常見的食品和中藥，例如蕎麥、銀杏、槐米、枸杞、芸香、益母草、蘆薈、柴胡、桉葉，以及菸草中的重要活性成分。蘆丁的結構式如圖1所示。蘆丁具有較強的抗氧化活性，在人體中可以維持血管壁的張力、提高其彈性，降低血管壁脆性和滲透性，因而可以改善微血管循環、降低血脂和膽固醇含量，可以在心腦血管疾病的治療中發揮作用。此外，蘆丁還具有一定的抑菌和抗衰老作用，並且可以影響胰島素的分泌並提高胰島素受體親和力，在糖尿病治療領域中也有一定的應用。蘆丁進入人體後，需要通過與多種蛋白質發生相互作用以實現其生理、藥理功能，例如其濃度較高時需要與血液中的人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)發生結合從而隨著血液循環而被輸運到其他器官或組織，然後再解離以發揮生理功能，其功效發揮也和其與生物酶或者特異和非特異受體的結合有關。因此，研究蘆丁與蛋白質相互作用的有關過程，特別是求得其與多種蛋白質發生結合反應的平衡常數，對其藥理、藥代動力學等研究具有重要意義。
作為一種快速、無標記、實時的分析手段，spr法本質上適合於蘆丁-蛋白質相互作用的分析，但在實現過程中卻存在著困難，即蘆丁的溶解性問題。spr是一種質量敏感型的分析方法，其信號強度取決於傳感晶片表面附近(50納米內)被測物質量的大小，因此當被分析物是蘆丁等小分子物質時，它必須在水環境中有足夠大的溶解度，以形成足夠強的信號。特別地，為了模擬生理環境，spr分析過程往往使用含有無機鹽的緩衝溶液來製備樣品溶液，這進一步導致了蘆丁溶解度降低的問題。已有專利方法中並無使用spr法研究蘆丁與蛋白質相互作用的方法。因此，有必要通過分析步驟的改進，改善蘆丁在水溶液中的溶解性，並以此為基礎開發基於spr的蘆丁-蛋白質相互作用結合水平的快速分析測定方法。
技術實現要素：
為了彌補現有方法的不足，特別是蘆丁溶解度問題導致的分析困難，本發明的目的是提供一種基於表面等離子體共振原理的新型相互作用分析方法，實現對蘆丁和蛋白質相互作用結合水平(即結合反應的平衡常數)的測定。
本發明的分析方法包括傳感晶片的清潔、晶片表面的羧基化修飾、蛋白質溶液ph的篩選、晶片表面羧基的活化、蛋白質的共價結合、蘆丁的溶解與稀釋、蛋白質與蘆丁相互作用過程的測定、數據分析等步驟。具體過程如下，各步驟須依次進行。
1、傳感晶片的清潔。
當spr傳感晶片(通常為鍍金玻璃片)為可拆卸式結構時，將傳感晶片整體浸沒於由濃氨水、30％過氧化氫、水按體積比1:1:5混合而成的溶液中，並置於60-95℃環境中至少10分鐘，然後以水清洗，乾燥後使用。當傳感晶片為不可拆卸式結構(即金屬層直接鍍於稜鏡表面)時，在晶片表面檢測窗口位置滴加上述溶液，並置於低於90℃但儘可能高(不損壞稜鏡等結構)的溫度下至少30分鐘，然後以水洗淨表面並乾燥後使用。也可以使用全新傳感晶片。
優選的，每次分析流程均使用全新傳感晶片，為鍍有裸露金膜的玻璃片，一次性使用，分析完成後棄去。
2、晶片表面的羧基化修飾。
將清潔的傳感晶片安裝入spr儀器後，使滿足以下條件的溶液流通經過晶片表面：溶質為一種巰基取代的直鏈羧酸，其中巰基位於碳鏈遠離羧基的另一個末端；碳鏈長度為含有三至二十碳原子，即巰基丙酸、巰基丁酸直至巰基二十烷酸之一；溶質濃度為2mmol/l至50mmol/l；溶劑為水和/或乙醇，視何者能將溶質溶解至所需濃度而定。流通過程中實時監測spr信號，流通時間從進樣後直到spr信號不再變化為止，但至少為1分鐘，溶液流速為0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘，視流通池體積而定。以上步驟完成後以水衝洗整個管路和晶片表面。流通時晶片區域溫度為0℃至60℃。
優選的，使用5mmol/l的3-巰基丙酸水溶液以5微升/分鐘的流速流通30分鐘，晶片區域控溫37℃，完成後以水衝洗管路和晶片表面。
3、蛋白質溶液的ph篩選。
本方法所針對的目標蛋白為水溶性蛋白質，其等電點大於4。實時監測spr信號，使用滿足以下條件的溶液流通經過晶片表面：蛋白質濃度為1納克/毫升至50毫克/毫升中的某一個值；溶劑為乙酸-乙酸鈉緩衝溶液，鈉離子濃度為不超過50mmol/l的一個值；ph為2.5至6.0中的至少3個值，範圍須覆蓋至少2個ph單位，間隔至少為0.2，至多為1個ph單位。即，流通的溶液為幾種固定蛋白種類和濃度、固定緩衝液濃度但ph不同的溶液。每個溶液流通相同的時間，介於5秒和60分鐘之間，流速相同，介於0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間。晶片區域溫度為0℃至60℃間的一個值。比較各個不同ph的蛋白溶液流經羧基修飾的晶片時spr信號的變化。若在所嘗試的幾個ph值中、所使用的流通時間下，各溶液均使spr信號達到穩定，則選擇穩定後信號與基線相差最大的溶液的ph用作後續分析；若在使用的流通時間下各溶液均未使信號達到穩定，則選擇信號變化最快的溶液的ph用作後續分析；若部分達到穩定部分未達穩定，則選擇流通完成時刻信號與基線相差最大的溶液的ph用作後續分析。此步驟完成後用水衝洗整個管路和晶片。
優選的，將蛋白質分別溶解於鈉離子濃度為10mmol/l，ph分別為4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液中，以5微升/分鐘的流速各流通5分鐘，控溫37℃，選擇結束時信號變化最大的溶液的ph。
4、晶片表面羧基的活化。
選擇下述兩種方法之一將晶片表面修飾的巰基羧酸的羧基進行活化。
其一，使滿足以下條件的溶液流通經過晶片表面：溶質為edc，即n-(3-二甲氨基丙基)-n』-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和nhs，即n-羥基丁二醯亞胺，兩者濃度均為0.0001至0.5克/毫升，且edc濃度不低於nhs濃度，流速介於0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，流通時間以spr信號不再變化為準，但至少為1分鐘。晶片區域溫度為0℃至60℃間的一個值。
其二，先後使edc溶液和nhs溶液分別流通經過晶片表面，各自濃度範圍、流速均同上，流通時間均以各自的spr信號不再變化為準，但各自均至少為1分鐘。晶片區域溫度為0℃至60℃間的一個值。
優選的，以edc和nhs的混合溶液流通30分鐘，兩者濃度分別為0.01和0.002克/毫升，流速為5微升/分鐘。控溫為37℃。
5、蛋白質的共價結合。
將目標蛋白質用第3步中確定的緩衝液溶解，蛋白質濃度為1納克/毫升至50毫克/毫升之間，然後使之流通經過晶片表面，晶片區域溫度為0℃至60℃間的一個值。流速介於0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，流通時間以spr信號不再變化為準，但至少為1分鐘。完成後以水衝洗管路和晶片。
優選的，使用0.01克/毫升、ph為5.0的蛋白溶液，以5微升/分鐘流速流通20分鐘，控溫37℃。
6、蘆丁的溶解與稀釋。
選擇磷酸鹽緩衝溶液(pbs)、tris緩衝溶液(三羥甲基氨基甲烷緩衝液，tbs)或者hepes緩衝溶液(n-2-羥乙基哌嗪-n』-2』-乙基磺酸緩衝液，hbs)溶液之一，25℃時ph為6.6至8.5，向其中添加3％至15％吡啶(體積分數)。此後添加適量其他添加劑，例如乙二胺四乙酸鈉(edta)和表面活性劑p20等，總質量分數不超過5％。以此溶劑作為蘆丁的稀釋溶劑。
將蘆丁溶解於純吡啶，濃度為1-50mmol/l中的一個值。以上述稀釋溶劑稀釋此蘆丁的吡啶溶液，至少得到3個不同濃度，且每個濃度間至少相差20％。每次稀釋水含有蘆丁的吡啶時，以相同比例稀釋一個未溶解蘆丁的純吡啶，得到不同濃度的吡啶溶液，其吡啶含量和上述稀釋的含有蘆丁的溶液相同。各溶液中蘆丁濃度分別記為c1、c2、…ci。
優選的，以hbs-ep+緩衝液(含有10mmol/lhepes，0.15mol/l氯化鈉，3mmol/ledta，0.005％體積分數的表面活性劑p20，,25℃時ph為7.4)中添加8％(體積分數)吡啶的溶液為稀釋劑，將蘆丁溶解於純吡啶至10mmol/l，然後以此稀釋劑稀釋至0.06、0.10、0.20、0.25、0.30mmol/l，每次稀釋時均以相同比例稀釋一個不含蘆丁的純吡啶溶液。
7、蛋白質與蘆丁相互作用過程的測定。
將spr儀器管路中的流通溶液替換為第6步中所用的蘆丁稀釋溶劑。將第6步中得到的各個濃度的蘆丁的稀釋後溶液與對應的各不含蘆丁的稀釋的吡啶溶液按照由稀至濃、先吡啶後蘆丁的順序依次送入spr儀器進行分析。樣品流速介於0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，晶片區域控溫0℃至60℃之間。每次進樣後均記錄信號直至不再變化，且至少維持1分鐘。每次進樣直至信號接近穩定後，停止進樣，以質量分數1％至10％之間的十二烷基硫酸鈉(sds)溶液衝洗管路和晶片直至信號接近穩定，此後再將管路中溶液替換為第6步中所用的稀釋溶劑，進行下一次分析。記錄每一個濃度為ci的蘆丁溶液進樣且信號穩定後的信號值，記為ri，每一個與ci同樣稀釋，但是不含蘆丁的溶液進樣且信號穩定後的信號值為ri。
優選的，控溫37℃，每次分析時樣品流速為5微升/分鐘，使用的sds質量分數為5％。
8、數據分析。
按照以下步驟求得所用蛋白質與蘆丁發生結合反應的平衡常數。
a、如步驟7中所述，記錄各ci時的ri和ri；
b、計算各個1/ci和1/(ri-ri)，並以1/(ri-ri)對1/ci作圖，1/ci為橫坐標，1/(ri-ri)為縱坐標。
c、對圖中數據點進行線性擬合，所得方程的截距記為b，斜率記為a，則結合反應的平衡常數為b/a，單位為實驗中所用濃度單位的倒數。
本發明的分析方法中，蘆丁用吡啶溶解並以含有吡啶的緩衝溶液稀釋，以解決蘆丁在水溶液中溶解度不足的問題，使之產生足夠強的spr信號。此外，分析過程中在配製稀釋的蘆丁溶液時一一對應地配製了相同組分但不含蘆丁的吡啶的稀釋溶液，用於測定吡啶對spr信號的影響，以準確獲得蘆丁產生的相互作用信號。
附圖說明
圖1：本發明利用表面等離子體共振技術測定蘆丁與蛋白結合水平的分析過程示意圖。
圖2：本發明的實施例中第7步，hsa蛋白質與含有蘆丁的各稀釋後溶液相互作用的spr檢測結果圖，用於求得各ri。
圖3：本發明的實施例中第7步，hsa蛋白質與不含有蘆丁的各吡啶稀釋溶液相互作用的spr檢測結果圖，用於求得各ri。
圖4：本發明的實施例中第8步，所作圖和線性擬合結果。
具體實施方式
以下結合附圖，通過實施例，進一步闡述本發明的技術方案，但是本申請的保護範圍不受這些實施例的具體條件的限制。
實施例：採用本發明中的分析方法測定蘆丁與人血清白蛋白(hsa)相互作用反應的平衡常數。具體步驟如下。
1、使用全新傳感晶片，為鍍有裸露金膜的玻璃片。將其安裝進入spr儀器，啟動儀器，晶片區域控溫維持37℃。
2、使用5mmol/l的3-巰基丙酸水溶液以5微升/分鐘的流速流通30分鐘，晶片區域控溫37℃，完成後以水衝洗管路和晶片表面。
3、將hsa溶解於鈉離子濃度為10mmol/l，ph分別為4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液中，以5微升/分鐘的流速各流通5分鐘。流通結束時信號變化最大的溶液的ph為5.5，故此後蛋白質共價結合時亦使用此ph的緩衝溶液。
4、以edc和nhs的混合溶液流通30分鐘，兩者濃度分別為0.01和0.002克/毫升，流速為5微升/分鐘。
5、使用0.01克/毫升、ph為5.0的hsa溶液，以5微升/分鐘流速流通20分鐘。
6、以hbs-ep+緩衝液(含有10mmol/lhepes，0.15mol/l氯化鈉，3mmol/ledta，0.005％體積分數的表面活性劑p20,25℃時ph為7.4)中添加8％(體積分數)吡啶的溶液為稀釋劑，將蘆丁溶解於純吡啶至10mmol/l，然後以此稀釋劑稀釋至0.06、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/l，每次稀釋時均以相同比例稀釋一個不含蘆丁的純吡啶溶液。
7、蛋白質與蘆丁相互作用過程的測定。
將spr儀器管路中的流通溶液替換為第6步中所用的蘆丁稀釋劑。將第6步中得到的各個濃度的蘆丁的稀釋後溶液與對應的各不含蘆丁的稀釋的吡啶溶液按照由稀至濃、先吡啶後蘆丁的順序依次送入spr儀器進行分析。樣品流速為5微升/分鐘，進樣後維持5分鐘，此後以質量分數5％的sds溶液衝洗管路，再將管路中溶液替換為第6步中所用的稀釋溶劑，進行下一次分析。hsa與含有蘆丁的各個樣品溶液相互作用所得spr信號如圖2所示，hsa與各個不含蘆丁的吡啶稀釋溶液的相互作用所得spr信號如圖3所示。本實施例中，c1＝0.06mmol/l，c2＝0.10mmol/l，c3＝0.20mmol/l，c4＝0.25mmol/l，c5＝0.30mmol/l；r1＝129ru，r2＝178ru，r3＝225ru，r4＝225ru，r5＝224ru；r1＝118ru，r2＝161ru，r3＝199ru，r4＝198ru，r5＝193ru。
8、數據分析。
按照以下步驟求得所用蛋白質與蘆丁發生結合反應的平衡常數。
a、記錄各ci時的ri和ri；已於第7步中敘述；
b、以各個1/(ri-ri)對1/ci作圖，1/ci為橫坐標，1/(ri-ri)為縱坐標，如圖4所示；
c、對圖4中各個數據點進行線性擬合，所得方程為y＝3.84×10-3x+2.02×10-2，線性係數為0.99。以截距除以斜率，得到蘆丁與hsa相互作用的結合常數為5.3mmol-1·l，即5.3×103mol-1·l。