一種定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法
2023-05-26 07:27:21 2
專利名稱：一種定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法
技術領域：
本發明屬於生物催化技術領域，具體涉及利用調控技術分別定向催化合成尿苷磷醯 化合物的方法。
背景技術：
尿苷酸(UMP)作為尿嘧啶的衍生物，是一重要的生化試劑，同時也是用量很大的 醫藥中間體、嬰兒食品添加劑和詞料添加劑，也是諸如尿苷三磷酸(UTP)、尿二磷葡 萄糖(UDPG)、胞苷三磷酸(CTP)、胞二磷膽鹼(CDPC)等尿苷和胞苷磷醯化合物的 合成前體，大量的藥理學和臨床學研究表明該類化合物在心腦血管、肝炎、糖尿病、抗 病毒(SARS)及神經退化(帕金森症、阿滋海默症)等疑難疾病的治療和輔助治療等 方面有著良好的臨床效果，同時是合成寡糖以及其他生理活性物質的基礎原料。
尿苷三磷酸(UTP)是三分子的磷酸結合在尿苷核糖5'-OH基上的核苷酸，分布廣 泛，是RNA合成的直接前體。與糖類代謝也有密切關係，由UTP與1-磷酸葡糖經酶催 化可以生成UDP-葡萄糖與焦磷酸。UTP可以防治肺炎，治療竇炎、纖毛運動障礙、中 耳炎及支氣管炎等疾病。另外，和腺苷三磷酸(ATP)—樣，還可以作為細胞外信息分子(第 一信使)激活細胞表面的P2受體，並通過細胞內第二信使系統調節多種生理反應，尤 其是對心血管系統的生理及病理生理活動具有重要意義。
尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是體內最重要的糖基供體，可以促進肝臟解毒作用， 治療中毒性及傳染性肝炎，具有重要的藥物開發價值。UDPG第一次是以輔酶形式於 1950年，由Leloir和他的同事在研究半乳糖向葡萄糖轉化過程中發現的。UDPG不但 可作為葡萄糖基供體，參與生物體內多種寡糖及多糖的合成，如海藻糖、蔗糖、澱粉、 維生素的生物合成，而且還是合成其它核苷二磷酸單糖，如尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二 磷酸葡萄糖酸、尿苷二磷酸木糖等的前體。
尿苷磷醯化合物即是對上述UMP、 UTP、 UDPG的總稱。
UMP的生產有化學法合成、酶解法合成、發酵法合成和生物催化法合成。生物催化 法合成核苷酸，就是利用微生物作為酶源，催化核苷酸的前體物質轉化為核苷酸。日本 協和發酵公司通過對菌種進行改良，利用尿苷酸前體物質乳清酸轉化UMP,目前UMP 的累積量高達28g/L (Fujio T, Maruyama A.. Biosci Biotech Biochem, 1997, 61(6): 956-959) 國內只有上海師範大學和山東大學有該類化合物合成的報導，上海師範大學(錢秀萍， 中國醫藥工業雜誌，2006,37(12))採用了鏈黴素抗性、卡那黴素抗性和產物結構類似物抗性等作為篩選手段，對產氨短桿菌進行離子束和紫外誘變，選育出一株UMP生成能 力較強的菌株，UMP的轉化能力達到了2g/L，但與國際先進水平相差甚遠。山東大學 (ApplMicrobiol Biotechnol2007， 76 (2) 321-328)通過對產氨短桿菌轉化條件的優 化使得UMP累積濃度達到了 10g/L。
UTP目前主要利用微生物生物催化合成。Takeda I等(Takeda I.， Watarabe S. Stabilizing Nucleotides Derivatives. Japan. 7,237,036， Sep 18.1972.)用酵母生物催化UMP 合成UTP。 UDPG的合成目前主要是化學法合成和酶法合成。
在酵母細胞中，尿苷可以在尿苷激酶的催化下合成UMP;乳清酸可以和磷酸核糖焦 磷酸(PRPP)在乳清酸磷酸核糖轉移酶的作用下生成乳清苷酸(OMP)，然後OMP經乳 清苷酸脫羧酶的催化生成UMP。然後UMP和ATP通過尿苷酸激酶轉移一個磷酸基，轉 化為UDP和ADP; UDP則通過核苷二磷酸激酶，消耗ATP，繼續磷酸化為UTP。 UTP與 l-磷酸葡糖經酶催化可以生成UDPG與焦磷酸。所以說酵母細胞中有分別催化尿苷和乳 清酸合成UMP、 UTP和UDPG的完整酶系。但是目前國內還沒有生物催化尿苷或乳清酸 合成UTP和UDPG的相關報導，也未見利用同一反應體系通過微調反應條件定向催化合 成上述三種尿苷磷醯化合物的報導。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種微生物細胞定向催化合成上述三種尿苷磷醯 化合物的方法。
為了解決上述技術問題，本發明的思路是
以尿苷或乳清酸為底物，微生物細胞酶係為酶源，在一定反應體系下合成尿苷磷醯 化合物。 一般情況下，經過一段時間的反應，體系中可能會同時存在UMP、 UTP和UDPG 三種反應產物，但可以通過調控手段使反應向某一產物方向主導，從而獲得濃度相對較 高的某一產物，以降低分離負荷、減少成本。這便是本發明的關鍵所在。通過長期實驗， 我們發現上述的調控手段主要包括階段性調整反應溫度和溶氧量。
本發明的關鍵在於
1. 本發明採用了全細胞催化技術，直接利用了細胞的自有酶系催化尿苷或乳清酸合 成三種尿苷磷醯化合物，可以根據需求生產三種物質的任意之一種，反應體系簡 單，無毒，生產成本低廉。
2. 本發明通過階段性控制反應溫度和通氧量作為手段，影響尿苷化合物磷醯化過程 中相關酶的活性。在不同的控制條件下，會使有利於合成一種物質的酶活性得到 加強，同時有利於生成其他物質的酶活性則削弱，這種酶的活性的選擇性決定了
5反應不同的最終產物。控制手段簡單易行，極大方便了工業化中的生產控制。 本發明採用的具體技術方案如下
一種定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，以尿苷或乳清酸和磷酸根離子為底物， 以葡萄糖作為核糖基團供體和能量供體，利用有透性的微生物細胞為酶源，通過階段性 改變反應溫度和溶氧量為手段，促使反應體系定向生物催化合成尿苷磷醯化合物。
其中，所述的尿苷磷醯化合物為尿苷酸(UMP)、尿苷三磷酸(UTP)或尿苷二磷 酸葡萄糖(UDPG)，其結構式如下
酵 ,G TP
其中，尿苷，即UR，結構式如下
o
尿苷
其中，乳清酸，即OA，結構式如下:
o
CH
C、
N H
、COOH
乳清酸
若以尿苷為底物，在pH5 10的水溶液中(優選pH6 8)進行如下三種反應之-可定向合成尿苷磷醯化合物-
II
R= -0—o GLC—
OH
0 II
o—P—o-
0H
OH
0 0 0
IIII II HO—P——0一P-0一P—O
I I I
OH OH OH
0=c
/
\
H
\
/
■c(a) 在25 35。C下，溶氧量60~120% (優選70~100%)，反應至8~10小時，主要 產物為UMP;
(b) 在25 35。C下，溶氧量60~120% (優選70~100%)，反應至8~10小時；再調 整溫度至35 45'C，調整溶氧量為15~50% (優選20~30%)，反應至4~6小時，主要產 物為UTP;
(c) 在25 35。C下，溶氧量60~120% (優選70~100%)，反應至8~10小時；再調 整溫度至35 45'C，調整溶氧量為15~50% (優選20~30%)，反應至4~6小時；再調整 溫度至20 30。C，調整溶氧量為0~30% (優選5~20%)，反應至4~8小時，主要產物為 UDPG。
若以乳清酸為底物，在pH5 10(優選pH6 8)的水溶液中進行如下三種反應之一， 可定向合成尿苷磷醯化合物
(a) 在25 35。C下，溶氧量60~120% (優選70~100%)，反應至16 20小時，主要 產物為UMP;
(b) 在25 35。C下，溶氧量60~120% (優選70~100%)，反應至16~20小時；再調 整溫度至35 45'C,調整溶氧量為15~50% (優選20~30%)，反應至8 10小時，主要產 物為UTP;
(c) 在25 35。C下，溶氧量60~120% (優選70~100%)，反應至16-20小時；再調 整溫度至35 45'C，調整溶氧量為15~50% (優選20~30%)，反應至8 10小時；再調整 溫度至20 3(TC，調整溶氧量為0~30% (優選5~20%)，反應至6~8小時，主要產物為 UDPG.。
上述反應中，底物尿苷或乳清酸的加入量為5 200mM，優選50 100mM;磷酸鹽 的加入量為0.1 2M，優選0.2 0.8M;葡萄糖的加入量為0.1 1M，優選0.5-1M;微 生物細胞的加入量為按溼菌體100 800g/L。
所述的反應體系還加入氨離子、鎂離子和鉀離子中的任意一種或幾種的組合物； Mg^可選自硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等無機鹽，其起始反應濃度為1 200mM，優選5 50mM; K+起始反應濃度為1 200mM，優選10 40mM; NH4+起始反應濃度為l 200mM，優選2 40mM。
所述的微生物細胞為能夠利用尿苷或乳清酸合成尿苷酸並繼續磷醯化的微生物，包 括氣桿菌屬、埃希氏菌屬、賽氏桿菌屬、微球菌屬的細菌；酵母屬、假絲酵母屬、畢赤 酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香 酵母屬的酵母。所述的微生物細胞優選具有較強ATP再生活性的菌株，包括產氨短桿菌、 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和白球擬酵母。其中，所述的有透性的微生物細胞是將微生物細胞採用如下方法進行菌體破壁處理 而得，從而改變細胞膜的通透性具體包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法，超聲波 處理法、風乾法、冷凍乾燥法或溶菌法。優選表面活性劑法或有機溶劑法；所述的表面 活性劑為非離子型表面活性劑(如聚環氧乙垸胺、曲拉通X—100)、陽離子型表面活性 劑(如十六烷基三甲胺*溴化物)或陰離子表面活性劑(月桂醯'肌氨酸鹽)，使用濃度為 0.1 50g/L，優選l 20g/L的濃度使用，即表面活性劑法處理微生物細胞時，將表面活 性劑直接加入反應液，對於總體積為1L的反應液，加入0.1 50g，優選加入l 20g;所 述的有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用濃度為0.1 50mL/L， 優選l 20mL/L的濃度使用，即有機溶劑法處理微生物細胞時，將有機溶劑直接加入反 應液，對於總體積為1L的反應液，加入0.1 50mL，優選加入l 20mL。其它處理細胞 透性的方法，如凍融法、超聲波處理法、風乾法等，採用先將菌株細胞處理後，再將處 理好的菌株加入反應液的方式。
其中，上述生產菌株的利用形式是生產菌株細胞的乾燥物、經過發酵培養分離離心 得到的細胞、細胞的凍乾物、市售酵母粉、風乾菌株或廢酵母泥。
其中，磷酸離子可舉出正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氫鉀，磷酸二 氫鈉，磷酸氫二鈉等無機磷酸鹽。
其中，溶氧量通過調節攪拌速率、通氣量等方法調節，根據溶氧測量儀的檢測數據 進行調節。以飽和空氣溶氧量為100%。
本發明的有益效果為
本發明者研究了以尿苷或乳清酸和磷酸根離子為底物，以葡萄糖作為核糖基團供體 和能量供體，利用有透性的微生物細胞為酶源，通過階段性調整反應溫度和溶氧量為手 段定向地生物催化合成特定的三種尿苷磷醯化合物。可以根據需求生產三種物質的任意 之一種，反應體系簡單，無毒，生產成本低廉。且控制手段簡單易行，極大方便了工業 化中的生產控制。
通過階段性調節反應條件可以定向生產UMP， UTP和UDPG， UR做底物時三種產 物的得率分別可達到77%、 67%、 61%; OA做底物時三種產物的得率分別可達到70。/。， 61%和53%。
具體實施例方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會 限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例h利用尿苷定向生產UMP。
在容量15L的反應槽中調製由尿苷600rnMo1、葡萄糖5Mo1、硫酸鎂50mMol、產氨 短桿菌2400克，氯化銨20mMo1，氯化鉀300mMol，磷酸二氫鈉2.0Mol，甲苯50毫升 和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為7.0，溶氧控制在70%，溫度為30'C，反 應8小時後結束反應，用高氯酸沉澱，用HPLC對產物進行定量分析，轉化液中主要產 物為UMP ,其含量為457mMol (208g)，得率為76.1%,此時UTP含量為68.3mMol G3.1g)， UDPG含量為24.6mMol (15g)。
實施例2:利用尿苷定向生產UTP。
在容量15L的反應槽中調製由尿苷600mMol、葡萄糖5Mol、硫酸鎂50mMol、產氨 短桿菌2400克，氯化銨20mMo1，氯化鉀300mMol，磷酸二氫鈉2.0Mol，甲苯50毫升 和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為7.0,溶氧控制在70%，溫度為30'C，反 應8小時後，溶氧調整為25%，溫度調整為37'C，繼續反應6小時，結束反應，用高 氯酸沉澱，用HPLC對產物進行定量分析，轉化液中主要產物為UTP ，其含量為 398mMo1 (193g)，得率為66.3%，此時UMP含量為57.3mMo1 (18.6g)， UDPG含量為 80.2mMol (48.9g)。
實施例3:利用尿苷定向生產UDPG。
在容量15L的反應槽中調製由尿苷600mMo1、葡萄糖5Mo1、硫酸鎂50mMo1、產氨 短桿菌2400克，氯化銨20mMo1，氯化鉀300mMo1，磷酸二氫鈉2.0Mol，甲苯50毫升 和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為7.0，溶氧控制在70%，溫度為30'C，反 應8小時後，溶氧調整為25%，溫度調整為37'C，繼續反應6小時後，溶氧調整為5%, 溫度調整為25'C，繼續反應4小時，結束反應，用高氯酸沉澱，用HPLC對產物進行 定量分析，轉化液中主要產物為UDPG，其含量為361mMol (220g)，得率為60.2%, 此時UMP含量為17.9mMo1 (6.16g)， UTP的含量為81.2mMo1 (38.7g)。
實施例4:利用尿苷定向生產UMP。
在容量15L的反應槽中調製由尿苷900rnMo1、葡萄糖8Mo1、氯化鎂125mMo1、畢 赤酵母3200克，氯化銨35mMo1，硝酸鉀400mMo1，磷酸氫二鈉2.5Mol， 二甲苯75毫 升和水組成的反應液IOL，用氫氧化鈉調pH為7.0，溶氧控制在80%，溫度為32'C， 反應9小時後結束反應，用高氯酸沉澱，用HPLC對產物進行定量分析，轉化液中主要 產物為UMP ，其含量為634mMo1 (208g)，得率為70.4%，此時UTP含量為98.3mMo1 (47.2g)， UDPG含量為44.6mMo1 (27.2g)。
9實施例5:利用尿苷定向生產UTP。
在容量15L的反應槽中調製由尿苷900mMo1、葡萄糖8Mo1、氯化鎂85mMo1、畢赤 酵母3200克，氯化銨35mMo1，硝酸鉀400mMo1，磷酸氫二鈉2.5Mol， 二甲苯75毫升 和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為7.0，溶氧控制在80%，溫度為32'C，反 應9小時後，溶氧調整為25%，溫度調整為38'C，繼續反應6小時，結束反應，用高 氯酸沉澱，用HPLC對產物進行定量分析，轉化液中主要產物為UTP ，其含量為 574mMo1 (276g)，得率為63.8%，此時UMP含量為77.3mMo1 (25.1g)， UDPG含量為 104rnMo1 (63.4g)。
實施例6:利用尿苷定向生產UDPG。
在容量15L的反應槽中調製由尿苷900mMo1、葡萄糖8Mo1、氯化鎂85mMo1、畢赤 酵母3200克，氯化銨35mMo1，硝酸鉀400mMo1，磷酸氫二鈉2.5Mol， 二甲苯75毫升 和水組成的反應液10L,用氫氧化鈉調pH為7.0，溶氧控制在80%，溫度為32'C，反 應9小時後，溶氧調整為25%，溫度調整為38°C，繼續反應6小時後，溶氧調整為10%， 溫度調整為27°C，繼續反應5小時，結束反應，用高氯酸沉澱，用HPLC對產物進行 定量分析，轉化液中主要產物為UDPG，其含量為521mMo1 (317g)，得率為57.9%， 此時UMP含量為26.9mMol (8.72g)， UTP的含量為121mMol (58.6g)。
實施例7:利用乳清酸定向生產UMP。
在容量15L的反應槽中調製由乳清酸600mMo1、葡萄糖7.5Mol、硫酸鎂300mMol、 釀酒酵母3000克，氯化銨24mMo1，硫酸鉀210mMol，磷酸二氫鈉4Mo1，曲拉通X— 100 50克和水組成的反應液IOL，用氫氧化鈉調pH為8.0，溶氧控制在80%,溫度為 30°C，反應18小時，反應結束後，用高氯酸沉澱，用HPLC對反應產物進行定量分析， 轉化液中主要產物為UMP，其含量為411rnMo1 (133g)，得率為68.5%，此時UTP的 濃度為58.1mMo1 (28.1g)， UDPG的濃度為32.8mMo1 (20.0g)。
實施例8:利用乳清酸定向生產UTP。
在容量15L的反應槽中調製由乳清酸600mMo1、葡萄糖7.5Mol、硫酸鎂300rnMo1、 釀酒酵母3000克，氯化銨24mMo1，硫酸鉀210mMo1，磷酸二氫鈉4Mo1，曲拉通X— 100 50克和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為8.0，溶氧控制在80%，溫度為 30°C,反應18小時後，溶氧調整為30%，溫度調整為37'C，繼續反應10小時，結束 反應，用高氯酸沉澱，用HPLC對反應產物進行定量分析，轉化液中主要產物為UTP， 其含量為358.2mMo1 (173g)，得率為59.7%，此時UMP的含量為84.2mMol (27.3g)， UDPG的含量為66.5mMol (40.6g)。實施例9:利用乳清酸定向生產UDPG。
在容量15L的反應槽中調製由乳清酸600mMol、葡萄糖7.5Mol、硫酸鎂300mMol、 釀酒酵母3000克，氯化銨24mMo1，硫酸鉀210mMol，磷酸二氫鈉4Mol，曲拉通X— 100 50克和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為8.0，溶氧控制在80%，溫度為 30'C，反應18小時後，溶氧調整為30%，溫度調整為37'C，繼續反應10小時後，溶 氧調整為10%，溫度調整為27°C，反應8小時，結束反應，用高氯酸沉澱，用HPLC 對反應產物進行定量分析，轉化液中主要產物為UDPG，其含量為303mMo1 (185g)， 得率為50.5%,此時UMP的含量為49.0mMoK 15.9g)， UTP的含量為62.3mMol(30.2g)。
實施例10:利用乳清酸定向生產UMP。
在容量15L的反應槽中調製由乳清酸800mMo1、葡萄糖9Mo1、硝酸鎂500mMo1、 枯草芽孢桿菌4000克(經風乾)，碳酸銨30mMo1，氯化鉀300mMo1，磷酸二氫鈉5Mo1 和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為8.0，溶氧控制在90%，溫度為28'C，反 應至20小時，反應結束，用高氯酸沉澱，用HPLC對反應產物進行定量分析，轉化液 中主要產物為UMP，其含量為532mMo1 (172g)，得率為66.5%，此時UTP的濃度為 59.2mMol (28.7g)， UDPG的濃度為34.8mMol (21.2g)。
實施例11:利用乳清酸定向生產UTP。
在容量15L的反應槽中調製由乳清酸800mMo1、葡萄糖9Mo1、硝酸鎂500mMo1、 枯草芽孢桿菌4000克(經風乾)，碳酸銨30mMo1，氯化鉀300mMo1，磷酸二氫鈉5Mo1 和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為8.0,溶氧控制在90%，溫度為28'C，反 應20小時後，溶氧調整為40%，溫度調整為35'C，繼續反應至10小時，結束反應， 用高氯酸沉澱，用HPLC對反應產物進行定量分析，轉化液中主要產物為UTP，其含量 為454mMo1 (220g)，得率為56.7%，此時UMP的含量為87.2mMol (28.3g)， UDPG 的含量為86.5mMol (52.8g)。
實施例12:利用乳清酸定向生產UDPG。
在容量15L的反應槽中調製由乳清酸800mMo1、葡萄糖9Mo1、硝酸鎂500mMo1、 枯草芽孢桿菌4000克(經風千)，碳酸銨30mMo1，氯化鉀300mMo1，磷酸二氫鈉5Mo1 和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為8.0，溶氧控制在90%，溫度為28。C，反 應20小時後，溶氧調整為40%，溫度調整為35'C，繼續反應至10小時，溶氧調整為 10%，溫度調整為25'C，反應至6小時，結束反應，用高氯酸沉澱，用HPLC對反應產 物進行定量分析，轉化液中主要產物為UDPG,其含量為388mMo1 (237g)，得率為 48.5%，此時UMP的含量為59.2mMo1 (19.2g)， UTP的含量為72.3mMo1 (35.1g)。
權利要求
1、一種定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於以尿苷或乳清酸和磷酸根離子為底物，以葡萄糖作為核糖基團供體和能量供體，利用有透性的微生物細胞為酶源，通過階段性改變反應溫度和溶氧量為手段，促使反應體系定向生物催化合成尿苷磷醯化合物。
2、 根據權利要求l所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於所述的 尿苷磷醯化合物為尿苷酸(UMP)、尿苷三磷酸(UTP)或尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)， 其結構式如下formula see original document page 2
3、 根據權利要求2所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於以尿 苷為底物，在pH5 10的水溶液中進行如下三種反應之一，定向合成尿苷磷醯 化合物(a) 在25 35。C下，溶氧量60~120%，反應8 10小時，主要產物為UMP;(b) 在25 35卩下，溶氧量60~120%，反應8 10小時；再調整溫度至35~45°C， 調整溶氧量為15~50%，反應4 6小時，主要產物為UTP;(c) 在25 35。C下，溶氧量60~120%，反應8~10小時；再調整溫度至35~45°C ， 調整溶氧量為15~50%，反應4 6小時；再調整溫度至20 30'C，調整溶氧量為0~30%， 反應4 8小時，主要產物為UDPG.。
4、 根據權利要求2所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於以乳 清酸為底物，在pH5 10的水溶液中進行如下三種反應之一，定向合成尿苷磷醯化合物:(a) 在25 35。C下，溶氧量60~120%，反應16-20小時，主要產物為UMP;(b) 在25 35'C下，溶氧量60~120%,反應16~20小時；再調整溫度至35~45°C ， 調整溶氧量為15~50%，反應8 10小時，主要產物為UTP;(c) 在25 35。C下，溶氧量60~120%，反應16 20小時；再調整溫度至35~45°C ，調整溶氧量為15~50%，反應8 10小時；再調整溫度至20 30'C，調整溶氧量為0~30%，反應6 8小時，主要產物為UDPG.。
5、 根據權利要求1 4中任意一項所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於底物尿苷或乳清酸的加入量為5 200mM,磷酸鹽的加入量為O. 1 2M，葡萄糖的加入量為0.1 1M，微生物細胞的加入量為按溼菌體100 800g/L。
6、 根據權利要求1~4中任意一項所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於所述的反應體系還加入氨離子、鎂離子和鉀離子中的任意一種或幾種的組合物；Mg^起始反應濃度為1 200mM; K+起始反應濃度為1 200rnM; NH4+起始反應濃度為1 200mM。
7、 根據權利要求1~4中任意一項所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於所述的微生物細胞為能夠利用尿苷或乳清酸合成尿苷酸並繼續磷醯化的微生物，包括氣桿菌屬、埃希氏菌屬、賽氏桿菌屬、微球菌屬的細菌；酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬的酵母。
8、 根據權利要求7所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於所述的微生物細胞為產氨短桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母或白球擬酵母。
9、 根據權利要求1所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於所述的有透性的微生物細胞是將微生物細胞採用如下方法進行處理而得表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法，超聲波處理法、風乾法、冷凍乾燥法或溶菌法。
10、 根據權利要求l所述的定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，其特徵在於所述的有透性的微生物細胞是將微生物細胞採用表面活性劑法或有機溶劑法處理而得；所述的表面活性劑為非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑或陰離子表面活性劑，使用濃度為0.1 50g/L;所述的有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用濃度為0.1 50mL/L。
全文摘要
本發明公開了一種定向催化合成尿苷磷醯化合物的方法，以尿苷或乳清酸和磷酸根離子為底物，以葡萄糖作為核糖基團供體和能量供體，利用有透性的微生物細胞為酶源，通過階段性改變反應溫度和溶氧量為手段，促使反應體系定向生物催化合成尿苷磷醯化合物。本發明可以根據需求生產三種物質的任意之一種，反應體系簡單，無毒，生產成本低廉，控制手段簡單易行，極大方便了工業化中的生產控制。以尿苷做底物時UMP、UTP和UDPG的得率分別可達到77％、67％、61％；以乳清酸做底物時UMP、UTP和UDPG的得率分別可達到70％，61％和53％。
文檔編號C12R1/01GK101555509SQ200910030838
公開日2009年10月14日 申請日期2009年4月17日 優先權日2009年4月17日
發明者應漢傑, 磊 張, 鵬 楊, 柏建新, 健 熊, 勇 陳, 黃小權 申請人:南京工業大學;南京同凱兆業生物技術有限責任公司