納米顆粒、製備方法以及其在藥物引導的癌症治療和食物相關化合物的領域中作為用於...的製作方法

2023-05-26 03:12:01

納米顆粒、製備方法以及其在藥物引導的癌症治療和食物相關化合物的領域中作為用於 ...的製作方法
【專利摘要】本發明涉及包括甾醇以及由石鹼木衍生得來的選自於皂樹酸和皂樹皂苷的組分的納米顆粒，該納米顆粒不包括磷脂。本發明還涉及包括所述納米顆粒的組合物，以及其用作佐藥的應用，尤其是在疫苗中、作為兩親分子或疏水分子的載體以及作為用於癌症的治療的藥劑的應用。此外，本發明還涉及一種用於生產不含磷脂的納米顆粒的方法、一種用於癌症的治療的方法和一種用於評估癌症治療方法的適用性的方法。
【專利說明】納米顆粒、製備方法以及其在藥物引導的癌症治療和食物相關化合物的領域中作為用於疏水分子和兩親分子的載體的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及包括甾醇和由選自於皂樹酸和皂樹皂苷的石鹼木(Quillajasaponaria Molina)衍生來的組分的納米顆粒,其中，納米顆粒不包括磷脂作為必要組分。本發明還涉及包括納米顆粒的組合物，以及其作為佐藥的應用，尤其是在疫苗中，以及在尤其是癌症的治療以及食物相關的化合物的醫學領域作為兩親分子或疏水分子的載體作為癌症的治療劑的應用。進一步地，本發明涉及一種生產不含磷脂的納米顆粒的方法，一種用於癌症的治療的方法和一種用於評估癌症治療方法的可行性和製備在水中可溶以促進其被身體吸收的食物相關的化合物的方法。
【背景技術】
[0002]免疫刺激複合物(Immune Stimulating Complex, ISC0M)是由源自於石鹼木樹的皂苷組成的40nm顆粒，所述皂苷與膽固醇緊密結合以形成直徑為6nm的六角環。第三組分為脂質，例如磷脂醯膽鹼，其與環粘連以形成40nm的球狀體。該顆粒和結合入顆粒的特定疫苗抗原一起使用，或者作為不含有抗原的佐藥顆粒來使用，所述佐藥顆粒與在另一個顆粒中的疫苗抗原共同施用。所述ISCOM顆粒可通過L5vgren&Morein、EP0436620以及W02004/004762中描述的方法來生產。
[0003]ISCOM和ISCOM Matrix (免疫刺激複合物基質)的一個問題是它們的生產工藝複雜。這還引發了將其作為載體/運送系統(例如將分子/化合物結合以成為運送物或者實現對於藥物效果和疫苗效果的優良的效果)或者作為靶向裝置來使用的問題。
[0004]疫苗主要基於能促進免疫反應的整個微生物或者亞基，包括抗體和對表面結構的T細胞反應兩者。或者，免疫 抗原為亞基，即最常用的為表面蛋白質，但也可為在細胞載體中表達的內部蛋白/細胞內蛋白或者甚至非結構蛋白。表面蛋白和碳水化合物抗原常常以其激發抗體反應的能力來評價，不排除它們還可以誘導包括T細胞反應在內的細胞調節反應，然而，大部分並不是細胞毒性的T細胞反應。使用內部蛋白和非結構蛋白作為疫苗抗原來引發T細胞反應，包括細胞毒性的T細胞，因為抗體並不與感染劑的內部蛋白相互作用，並且因此可以不在感染的時間點來調節免疫保護。相反，包括T輔助細胞和細胞毒性T細胞的細胞調節免疫可以殺死感染的細胞，也就是在感染的時間點之後。ISCOM工藝的製劑和產品被用於增強易接近的抗原的免疫原性，所述易接近的抗原即表面抗原和通過藥劑的幹擾(內部抗原)顯露的抗原，通過它可以製備抗它的疫苗，Cf Morein等人20073年和W02011/005183。任何疫苗也可以通過rDNA技術來製備，在許多情況下，還可以如LSvgren &Morein2所述來合成製備。所述ISCOM工藝在許多專利申請中描述，包括美國專利US2006/0121065.EP1539231AUW02004/004762 和 W02005/002620。
[0005]一般而言，佐藥被用於增強包括在疫苗製劑中的抗原的免疫反應的程度和質量。然而，有許多感染原，其關於保護性疫苗的未滿足的需求很大，(新)免疫保護通過下列途徑被逃避:
[0006]?逃避變異株(人類流感病毒、雞的冠狀病毒(傳染性支氣管炎病毒，infectiousbronchitis virus, IBR)、C型肝炎病毒(hepatitis Cvirus, HCV))
[0007].不顯露抗原決定簇
[0008].難以接近的-隱藏的(金黃色葡萄球菌[SA]、馬鏈球菌)
[0009].在微生物中通過其他抗原決定簇的免疫優勢，例如人體中的流感病毒、貂中導致阿留申病(alution disease)的細小病毒、人體中的C型肝炎病毒(HCV)。
[0010].惡化疾病的誘導免疫反應(細小病毒[阿留申病]貂)
[0011].打算用於具有許多至幾乎無數個變異體的病原體的種類的疫苗，所述變異體使其困難/過於昂貴，或者使其生產足夠覆蓋的疫苗(例如在人體中HIV和C型肝炎)更加經濟。已知存在許多疫苗，其需要來自相同數目的變異體株幾種甚至多達23種的疫苗組分，所述變異體例如為具有多種莢膜抗原的碳水化合物變異體(聯合疫苗，例如流感嗜血桿菌、Meningococus miningitides、月市炎鏈球菌、酉良月農鏈球菌、pneumococcus pneumonie,還有金黃色葡萄球菌)。
[0012].在多種革蘭氏陽性球菌、例如葡萄球菌在動物中盛行的其他未滿足的需求，尤其是一種需求要求在反芻動物中抗乳腺炎的保護性疫苗，其由在馬中(Str.Equi, Str.Zooepidermicus)、在牛中(Str.agalacti, Str.dysgalacti 和 Str.Uberis)的抗鏈球菌金黃色葡萄球菌來引起。
[0013].抗原痕跡(FLU)或者載體誘導的表位抑制(carrier induced epitopesuppression, CIES)抗原。
[0014].快速複製因子，例如人類免疫缺陷病毒(HIV)會通過新的即將來臨的變異體(包括由疫苗誘導的變異體)來惡化逃避宿主的免疫保護機制。
[0015].許多情況下缺乏佐藥的DNA和RNA疫苗。
[0016]因此，存在通過避免逃避突變的負面影響或者補償由經突變逃避而損失的免疫，或者增強對由感染期間的突變導致的即將到來的變異體的免疫保護來提高疫苗滿足即將到來的情況(例如導致流行病、甚至大流行病)的能力或者改善保持疫苗保護價值的可能性這一未滿足的需求。因此原因，新型顆粒狀疫苗佐藥也可靈活地需要針對特定病原體的保護所需的免疫學檔案的免疫反應來調整方向。
[0017]用多種方式治療癌症，包括手術、放射以及藥物，即細胞抑制劑。通過細胞抑制劑的醫療通常導致嚴重的副作用，例如放射療法常常導致嚴重的副作用。因此，存在具有能被患者良好地忍受的醫療的未被滿足的需求。國際專利公布W02008/063129以及Hu等人1描述了包括膽固醇、磷脂醯膽鹼和皂樹皂苷部分ASAP (醯基皂苷，與QS21或QHC相對應)或DSAP (去醯基皂苷，與QS7或QHA相對應)的納米顆粒。名為KGI和BBE的這些顆粒被描述為以比它們殺死相似來源的正常細胞的濃度低30至40倍的濃度來殺死癌`細胞，如在專利申請 PCT/SE2007/050878 和 W02008/063129 和 Hu 等人 1 在發明 「Killcan, New Use」 中所描述的。這些顆粒具有與對於ISCOM和ISCOM Matrix所描述的生產複雜性的相似的生產複雜性。
[0018]許多潛在藥物不能被研發，因為其不能實現在水中的溶解性，包括其在疫苗/佐藥和包括抗癌藥物在內的藥物輸送領域的應用。如果這些潛在的藥物能從架子上取下來並使它們可溶於水，其中一些就可以豐富醫藥市場。

【發明內容】

[0019]發明人發現了一種對於用作抗癌藥物、藥物的載體/運送顆粒以及用作佐藥的新型的納米顆粒的需求，所述佐藥可以彌補市售佐藥-疫苗製劑的不足。
[0020]關於ISCOM的一個問題是配製基於皂樹組分、膽固醇和第三組分(例如磷脂醯膽鹼)的清潔劑增溶的顆粒的複雜工藝，例如使用超濾、切向流、透析或離心技術。所用這些技術都如LSvgrcn Morein2所述，導致材料在生產過程中的損失。
[0021]另外，ISCOM工藝不能容易地適合於其他疏水或兩親性分子的整合，因為迄今研發出的方法使得這些化合物在水中具有很強的自動形成穩定的複合物(自組裝)的趨勢，例如如通過疏水相互作用不整合入ISCOM製劑中的膠束。
[0022]本發明涉及不含磷脂的納米顆粒，其包括留醇和至少一種皂苷。
[0023]與本發明相反，用於包括佐藥製劑以增強疫苗的效力的藥物以及疫苗製劑和用於治療癌症的製劑中的製備和應用的包括脂質的顆粒包括像磷脂這樣的脂類，例如磷脂醯絲氨酸、磷脂醯膽鹼、十八烷基胺等，所述包括脂質的顆粒例如脂質體、ISCOM、ISCOM MATRIX、posintros以及多種脂質體。
[0024]根據本發明的納米顆粒還可用作一個或多個化合物的傳輸系統，例如包括用於癌症的治療的藥物和營養相關的化合物，其中額外的物質提供額外的功能和補充方式的作用。
[0025]根據本發明的納米顆粒的優點使它們能成為現有技術製劑的替代物，包括作為佐藥的更廣的應用以覆蓋病原體的新的突變體，例如如上所述的即將到來的流行病。
[0026]因為揮發技術，本發明提供了實際上沒有損失的簡單的生產工藝。這並不排除使用所述技術來生產ISCOM或ISCOM Matrix (見上文)。
[0027]本發明的方面描述在獨立權利要求中。優選的實施方式在從屬權利要求中闡明。【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1A.電鏡(EM)顯示了包括摩爾比為1:1:0.5的膽固醇、QHC和雙萜類的納米顆粒。根據本發明的顆粒的平均直徑為約17-20nm。它與如圖1B所示的約為40nm的ISCOM顆粒顯著不同。根據本發明的不含雙萜類的顆粒具有相同的形態。
[0029]圖1B.電鏡顯示了包括摩爾比為1:1:0.5的膽固醇、QHC和磷脂醯膽鹼的類ISCOM顆粒。如所述地使用與實施例1所述相類似的技術來製備本顆粒，相應的實施例1中的設計C直徑約為40nm，即使用。形態和大小與根據如圖1A所示的本發明的納米顆粒的形態和大小顯著不同。
[0030]圖2.在U937細胞上測試的，都包含QHC的G3和KGI納米顆粒之間的癌細胞殺死能力的比較。對於模式腫瘤細胞，G3和KGI實際上有相同的抗癌細胞殺死作用(P=0.8422)。
[0031]圖3.G3和KGI誘導U937腫瘤細胞來產生IL_8的比較，其顯示了兩種顆粒都具有相似的誘導腫瘤細胞來產生指示腫瘤細胞分化的細胞因子的能力(P>0.05)。
[0032]圖4A.與BBE·或KGI相比，甜葉菊(Stevia)是IL-12B、IL-6和IL-1 α的最強的誘導劑。[0033]圖4B.當結合入G3時，DT上調正常人類DC的細胞因子IL-12基因表達。
[0034]圖5.G3顆粒以與KGI顆粒類似的強度來影響U937細胞的細胞內TK產生(從左到右，在每個製劑-濃度組合中的長條表示24、48、72、96和120小時的時間點)。
[0035]圖6.在HL-60AML細胞上讀取的G3、結合了 DT的G3 (G3-DT)和非顆粒狀的QHC的滴定曲線。所述G3和G3-DT製劑比游離的、非顆粒狀的QHC更有效地殺死AML細胞。
[0036]圖7.G3和阿糖孢苷對HL-60AML細胞的單獨的和聯合的效果。G3顯著增強了阿糖孢苷
[0037]圖8.G3增強了道諾黴素對HL-60AML癌細胞的殺死能力。
[0038]圖9.對於PC-3前列腺癌細胞，G3、結合了 DT的G3 (G3-DT)和QHC的滴定曲線。
[0039]圖10.對於PC-3前列腺癌細胞，G3和多西他賽(docetaxel)的單獨的和聯合的效果。G3顯著增強了多西他賽的癌細胞殺死效果。
[0040]圖11.G3增強了卡巴他賽(cabazitaxel)對PC-3前列腺癌細胞的殺死效果。
[0041]圖12.ACHN腎臟癌細胞的滴定曲線顯示了用QHA配製的G3比用QHA配製的G3在殺死實體癌細胞方面更加有效(P〈0.01)。
[0042]圖13A.免疫程度
[0043]實驗設計(C56B16小鼠，6隻小鼠/組，200 μ I/劑，皮下地(s.c.)施予兩次免疫，相隔四周)
[0044]第一組(Abisco 對照組):流感 I μ g+ISCOM-5 μ g
[0045]第二組(G3-高劑量組):流感I μ g+G3-5 μ g
[0046]第三組(G3-中劑量組):流感I μ g+G3-2.5 μ g
[0047]第四組(G3-低劑量組):流感I μ g+G3-l μ g
[0048]第五組(G3加 DT):流感 I μ g+G3_2.5 μ g
[0049]第六組(非佐藥的，抗原對照組):流感I μ g
[0050]第七組(不免疫組)
[0051]評估
[0052]取血液來檢測抗體反應。解剖取脾臟細胞用於IL-4、IFN-Y的包括細胞免疫的增殖測試。
[0053]圖13B.在第一次免疫三周之後測量的小鼠血清的HI抗體反應。
[0054]圖13C.在第二次免疫四周之後測量的小鼠血清的HI抗體反應。
[0055]圖13D.在第二次免疫四周之後測量的小鼠脾臟細胞的細胞因子反應。
[0056]圖14A.G3/VLX40製劑(右側柱)具有高的癌細胞(U937)殺死效果。相比於單獨的VLX40 (左側柱)具有較低的癌細胞殺死效果，表明了 G3/VLX40製劑具有高的溶解性，而VLX40-DMS0製劑具有低的癌細胞殺死效果。
[0057]圖14B.VLX40DMS0製劑(左側柱)在沉澱物中具有很高的抗癌活性。相反，具有很少沉澱的G3-VLX40 (右側柱)製劑具有低的抗癌細胞活性，表明了抗癌細胞活性本質上定位於水相。
[0058]定義
[0059]本說明書中所用的術語和用詞除非另有說明，否則應解釋為它們在相關領域中通常具有的含義。為了清楚，幾個術語在下面定義。[0060]疫苗製劑是用於針對/對抗一種或多種特定疾病的預防及改善/增強保護性免疫的藥物製劑。當對與疾病相關的組分具有特異性的抗原包括在本發明的製劑中，或者如特別對於癌症治療，抗原存在於癌症/腫瘤中時，根據本發明的治療疫苗可用於治療疾病。疫苗包括在被治療的主體中引發免疫反應的「抗原」，以及任選地加入到疫苗中以改善免疫反應的叫做「佐藥」的物質。
[0061]因此，「抗原」是疫苗中的活性特異性部分，可以是導致疫苗所針對的以提高免疫的疾病的整個微生物，例如病毒或細菌。它還可以是所述微生物亞基的部分，例如蛋白質(亞基)、蛋白質的一部分、從病原微生物提取出的或者通過rDNA技術生成的或合成生成的、然後通常稱作肽的蛋白質。肽比蛋白質具有更少的胺基酸。
[0062]「佐藥」是提高針對預防或治療疫苗的抗原部分的免疫反應的水平和質量的疫苗成分。營養相關化合物是與養分相關的任何化合物，包括維生素、健康活性物質、味道改良化合物。
【具體實施方式】
[0063]本發明涉及納米顆粒，所述納米顆粒包括留醇和源自選自於皂酸和皂樹皂苷的石鹼木的組分，其特徵在於，所述納米顆粒不包括磷脂。
[0064]根據本發明得到的顆粒與ISCOM在大小上不同，其中根據本發明的顆粒小於40nm，約在20nm左右，但ISCOM為約40nm。因此，本發明的納米顆粒可具有在10-40納米之間的直徑，優選在12-35納米之間或在15-25納米之間。所述大小將在一定程度上取決於除了膽固醇和皂樹分子之外的所整合的其他分子的載入。
[0065]甾醇可選自於膽固醇、膽甾烷醇、乙酸甾烷醇(caprostanoI)、植物甾醇、例如豆甾醇、谷留醇、酵母留醇、例如麥角留醇，優選膽固醇和維生素D3或任何暴漏在水中以和在水中可溶的(包括以膠束形式懸浮於水中的懸浮液)反應性基團共價地反應的疏水化合物。
[0066]也可以使用皂樹皂苷或者其任何具有普通三萜系化合物骨架的部分(又稱為皂樹酸(QuiIIaja acid))。到目前為止已被`描述的皂樹酸有四種形式。如Hu等人1所述，皂樹皂苷和許多糖一起形成帶有醯基(即醯基皂苷，ASAP)或者不帶醯基(即去醯基皂苷，DSAP)的鏈。
[0067]所述皂苷可為親水的，並且選自於Quil A的第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15部分，尤其是在EP03632279B2中描述的第7、8、9、10、11、12、13和14部分，以及Quil A或粗製Quil A的A部分。
[0068]所述皂苷可為粗製的或天然的，或者為Quil A的未分離的提取物，其包括皂苷的混合物或者其半純化形式，例如Quillaja Powder Extract (美國Berghausen公司)、Quillaja Ultra Powder QP UF300、Quillaja Ultra Powder QP UF1000或者Vax-Sap(這三個都購自智利Natural Responses公司，或者購自智利聖地牙哥的Prodalysa公司)。純化的皂苷C部分和B部分可單獨地或者聯合在一起使用。B部分和C部分描述於W096/11711中，B3、B4 和 Mb 部分描述於 EP0436620 中。QA1-22 部分描述於 EP03632279B2，Q-VAC (丹麥 Nor-Feed 公司)、Quillaja Saponaria Molina Spikoside (瑞典烏普薩拉市 UppsalaScience Park, 75183 的 Isconova AB 公司)。
[0069]所述皂苷可為疏水性皂苷，並且選自例如在來自於石鹼木的皂苷的三萜糖苷配基的4-位上包括脂肪酸的皂苷，例如Quil A的C部分和B部分或者來自於在A部分和B部分之間的區域的部分以及在EP03632279B2中描述的第15、16、17、18、19、10和21部分(尤其是第17和18部分適合於此處)。可優選地使用皂樹皂苷部分QHA、QHB和/或QHC。
[0070]膽固醇和皂樹皂苷之間的比例可為從1:10至10:1，優選從1:2至2:1。
[0071 ] 根據本發明的納米顆粒可進一步包括至少一種兩親性或疏水分子，其可選自於抗原、佐藥、靶標分子、藥物化合物和食物相關化合物。
[0072]所述抗原可以是如歐洲專利公約(EPC)專利申請0109942中描述的具有兩親基團或疏水基團或者通過rDNA表達而變得具有疏水區域並通過細胞或化學合成來生產的的任何抗原。佐藥可為具有兩親基團或疏水基團的任何佐藥，例如從石鹼木獲取的那些基團。
[0073]一個或多個化合物分子可結合入G3以具有補充的功能，例如在EP9600647-3(PCT/SE97/00289)中描述的在使用用於免疫調節功能的疫苗時作為靶標工具或作為抗原或補充抗原，或者作為包括抗癌或營養效果的藥物。為了結合入G3顆粒，所述分子需要具有疏水域，或者與G3顆粒通過靜電作用連接。如在EP1800564中對一個相似的顆粒所描述的，不具有疏水部分的化合物可以在結合入G3分子之前或結合入G3分子之後連到具有這樣的分子的分子上去。
[0074]例如天然的或合成的包括合成的或半合成的皂樹皂苷或來自於石鹼木的皂苷部分或其衍生物、脂質A或其衍生物或合成種類、細胞壁骨架的任何佐藥可以結合，但不僅限於所提到的佐藥化合物。由智利聖地牙哥Prodalysa的Javier Saints公司提供的雙職類化合物(Diterpenoid, DT)可用作佐藥和營養物(來自於甜葉菊的一種甜味劑)。雙職類化合物(DT)被加入根據本發明的納米顆粒，得到了 17nm的典型的小納米顆粒。
[0075]可使用與細胞結合組·分(cell-binding component)結合的包含脂質的受體,所述受體包括霍亂毒素的受體和海藻糖血型抗原，所述霍亂毒素的受體為神經節苷脂GM1。所述細胞結合組分還可作為粘液靶標分子來起作用。用於所包括的複合物的技術在例如W097/30728中描述，並且可應用於用於抗癌治療和疫苗用途兩者的G3顆粒。石鹼木的任何亞片段可以單獨地或者以多種組合方式來使用。具有疏水尾部/區域的受體是用於將分子捕獲至本發明所發明的顆粒以提供所需的補充特徵，例如不同方式的癌細胞殺死，例如，以癌細胞為目標同時還具有細胞殺死效果的單克隆抗體就是一種載體-傳遞的選擇。
[0076]因此，可結合於所述納米顆粒的其他組分為包括抗癌藥的藥物，所述抗癌藥包括用於抗體或者單克隆抗體(例如Fe受體或者金黃色葡萄球菌的蛋白質A的DD(W02001/005183))的受體。
[0077]通過本發明公開的納米顆粒的製備方法比ISCOM的製備方法更簡單，並且更適合於結合疏水分子和兩親分子。因此，本發明所發明的納米顆粒是適用於疫苗抗原、用於抗癌治療的藥物以及任何種類的藥物的傳遞的納米顆粒。如在此所述地生產的顆粒還可用所加入的兩親分子(脂質，例如十八胺等)補充以用於與其他分子(例如藥物或疫苗抗原)共價地連接或者用於靜電地連接，例如Morein等3以及在W02004/004762中描述的外源凝集素(lectin)連接。
[0078]所述顆粒可進一步包括癌症靶標分子，例如來自於癌細胞的表面抗原、病毒表面抗原和流感抗原。
[0079]來自於微生物膜的表面分子可通過疏水相互作用來結合,如Morein等人3和在EP242380中最開始描述的。例如通過rDNA技術來生產的或者合成生產的其他分子可如W02002/080981和W02004/030696中所述地來結合進去。
[0080]這些靶標分子包括包膜蛋白，所述包膜蛋白來自於病毒，例如流感病毒和呼吸道合胞體病毒(respiratory syncytial virus),其與呼吸道親和,例如與肺癌的祀向形式或者如Lycke等人4所述、是結合入KGI或者BBE製劑的霍亂毒素的A亞基的Al部分的CTAlDD親和。CTAlDD由三種主要組分合理地設計而來，每一種組分都貢獻了補充的效果。CTAl是霍亂毒素的酶活性亞基，其通過與A2亞基和B亞基分開而變成非毒性的。它與來自金黃色葡萄球菌的A蛋白的DD相連而靶向B細胞。更加廣泛地說，如EP0109942B1、EP0242380B1和EP0180564B1所述，單克隆抗體和多克隆抗體可結合入所述顆粒。
[0081]本發明還涉及包括一種或多種納米顆粒的組合物。所述組合物可包括各自結合入不同的納米顆粒的不同的皂樹皂苷部分。
[0082]因此，兩種不同的皂苷部分可為結合在一個G3顆粒中的複合物，並且至少兩種不同的皂苷部分中的另一種(或其他種)為在另一種(或其他種)物理上不同的含脂質的顆粒中結合的複合物。
[0083]不同的皂苷可分別為親水的或疏水皂苷。所述顆粒可至少包括C部分，或者至少包括B部分，或者至少包括Quil A的C部分和B部分之間的任何部分以及Quil A的至少一種其他部分。因此，一個顆粒可僅包括C部分；C部分和Quil A的至少一種其他部分；C部分和Quil A的一種或多種部分；Quil A的C部分和A部分；粗製Quil A。所述顆粒還可僅包括B部分；B部分和Quil A的至少一種其他的部分；B部分和Quil A的一種或多種部分；Quil A的B部分和A部分。部分的上述組合還可在不同的脂質顆粒或相同的脂質顆粒中。
[0084]因此，可使用包括含有在物理上不同的顆粒中的親水和疏水皂苷的顆粒的脂質的混合物。`
[0085]根據一個實施方式，Quil A的A部分可與至少一種具有免疫調節活性的其他佐藥一起結合入納米顆粒中。
[0086]根據另一個實施方式，至少一種其他佐藥以游離形式或者結合入另一種分開的納米顆粒來呈現，以製備佐藥組合物。
[0087]至少一種其他佐藥可為例如Quil A皂苷的皂苷。
[0088]A部分可促進另一種佐藥的使用，並且可獲得包括免疫反應和免疫調節活性的提高的協同效果，所述佐藥當其單獨使用的時候，在有效的劑量下可能是毒性的。
[0089]根據本發明的組合物可包括來自Quil A的佐藥A部分以及任何重量比例的至少一種其他的佐藥。優選地，基於佐藥的總量計，Quil A的A部分是2-99.9重量％，優選5-90重量％，尤其是50-90重量％。對於例如Al (OH) 3、油類佐藥和嵌段共聚物來說，Quil A的A部分的量可以大大降低。
[0090]基於A部分和非A的Quil A部分的總量計，一個優選的ISCOM組合物包括50-99.9%的Quil A的A部分以及0.1-50%的C部分和/或B部分和/或Quil A的其他部分或衍生物(在上下文中稱為非A的QuilA部分)。尤其是，基於A部分和非A的Quil A部分的總量計，所述組合物包括70-99.9%的Quil A的A部分和0.1-30%的非A的Quil A部分，優選75-99.9%的Quil A的A部分和0.1-25%的非A的Quil A部分，尤其是80-99.9%的Quil A的A部分和0.1-20%的非A的Quil A部分。基於A部分和非A的Quil A部分的總量計，最優選的組合物包括91-99.1%的Quil A的A部分和0.1-9%的非A的Quil A部分，尤其是基於A部分和非A的Quil A部分的總量計，98.0-99.9%的A部分和0.1-2.0%的非A的Quil A部分。
[0091]所述納米顆粒和包括納米顆粒的組合物可用作任選地在進一步包括藥學上可接受的緩衝液、稀釋賦形劑、添加劑、佐藥和/或載體的藥組合物中的藥物。
[0092]合適的藥學上可接受的載體和/或稀釋劑包括任何以及所有的常規的溶劑、分散介質、填料、固態載體、水溶液、塗層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲延緩劑和吸收延緩劑等。這些介質和劑用於藥學活性物質的應用在本領域中是公知的，並且其在第18版美國賓夕法尼亞州 Mack Publishing Company HjlKStJ RemingtonjS Pharmaceutical Sciences 中以實例的方式被描述。除了在任何常規的介質或劑與活性成分不相容的情況，它們在本發明的藥組合物中的應用是可預期的。補充的活性成分也可加入到組合物中。
[0093]本發明還包括進一步包括至少一種藥學活性組合物的藥組合物,例如抗癌藥、鉬配位化合物、紫杉烷化合物、喜樹鹼化合物、抗腫瘤長春花生物鹼、抗腫瘤核苷衍生物、氮芥或者亞硝基脲烷化劑、抗腫瘤蒽環黴素衍生物、赫賽汀(trastzumab)和抗腫瘤足葉草毒素衍生物、石鹼木以及其亞片段；抗體的受體或者單克隆抗體，例如Fe受體或者金黃色葡萄球菌的A蛋白的DD ;癌症治療劑，例如選自於由阿糖孢苷(Cytarabin)、道諾黴素、紫杉醇、多西他賽(Docetaxel)、卡巴他賽(Cabazitaxel)、Toricsel 和他比特定(Trabectidin)組成的組的藥劑，其活性化合物可整合入納米顆粒，或者與組合物混合。
[0094]進一步的抗癌劑優選地選自於即鉬配位化合物、紫杉烷化合物、喜樹鹼化合物、抗腫瘤長春花生物鹼、抗腫瘤核苷衍生物、氮芥或者亞硝基脲烷化劑、抗腫瘤蒽環黴素衍生物、赫賽汀(trastzumab)和抗腫瘤足葉草毒素衍生物。
[0095]術語「鉬配位化合物」在此用來表示任何腫瘤細胞生長抑制的鉬配位化合物，其以離子形式提供鉬。優選的鉬 配位化合物包括順鉬、卡鉬、氯代_( 二乙烯基三胺)_氯化鉬
(II);二氯代(乙烯基二胺)-鉬(II) ;二胺(I, 1-環丁烷二羧酸)-鉬(II)(卡鉬);螺鉬；異丙鉬；二胺(2-乙基丙二酸)_鉬(II) ; (1，2_ 二氨基環己基)丙二酸鉬(II) ;(4_羧基酞)(1，2-二氨基環己基)鉬(II) ; (1,2-二氨基環己基)-(異檸檬酸)鉬(II) ;(1，2_ 二氨基環己烷)_順_(丙酮酸)鉬(II);以及(1，2-二氨基環己基)-草酸-鉬(II);奧馬鉬和四鉬。
[0096]順鉬可從如BristolMyers Squibb公司的Platinol的商品名下以用於與水、無菌鹽水和其他適宜的載劑組合的粉末來從市場上購得。其他的鉬配位化合物及其藥組合物可從市場上購得和/或可通過常規技術手段來製備。
[0097]紫衫燒化合物可為BristolMyers Squibb公司以商品名Taxol來銷售的紫衫燒化合物，多西他賽可從Rhone-Poulenc Rorer公司以商品名Taxotere購得。這兩種化合物和其他紫杉烷化合物可以常規方式來製備，例如以在EP253738、EP253739和W092/09589中描述的方式或者其類似的方法來製備。卡巴他賽從Sanofi Pasteur公司購得。喜樹鹼化合物包括伊立替康(Irinotecan)與拓撲替康(topotecan)。伊立替康可從例如Rhone-PoulencRorer公司以商品名Campto來購得,並且可例如如歐洲專利說明書137145中所述的方法或者通過其類似的方法來製備。拓撲替康可從例如SmithKline Beecham以商品名Hycamtin來購得，並且可通過例如如歐洲專利說明書321122中所述的方法或者通過其類似的方法來製備。其他喜樹鹼化合物可以通過常規方式製備，例如通過與上述對於伊立替康和拓撲替康所描述的類似的方法來製備。
[0098]抗腫瘤長春花生物鹼包括上面涉及的長春花鹼、長春新鹼和長春瑞濱。長春花鹼可例如作為用於注射的硫酸鹽從EliLilly and Co公司以商品名Velban購得，並且可以通過例如如德國專利說明書2124023中所述的方法或者其類似的方法來製備。長春新鹼可例如作為用於注射的硫酸鹽從Eli Lilly and Co公司以商品名Oncovin購得,並且可以通過例如如上述德國專利說明書2124023中所述的方法或者其類似的方法來製備。長春瑞濱可例如作為用於注射的酒石酸鹽從Glaxo Wellcome公司以商品名Navelbine購得,並且可以通過例如如美國專利說明書4307100中所述的方法或者其類似的方法來製備。其他抗腫瘤長春花生物鹼可通過常規方式製備，例如通過與上述對於長春花鹼、長春新鹼和長春瑞濱所描述的方式類似的方法來製備。
[0099]抗腫瘤核苷衍生物包括上面涉及的5-氟尿嘧唳、吉西他濱(gemcitabine)和卡培他濱(capecitabine)。5_氟尿嘧唳可廣泛地從市場上購得,並且可以通過例如如美國專利2802005中所述的方法來製備。吉西他濱可通過從例如Eli Lilly公司以商品名Gemzar購得，並且可以通過例如如歐洲專利說明書122707中所述的方法或者通過其類似的方法來製備。
[0100]卡培他濱可從例如Hoffman-La Roche公司以商品名Xeloda購得,並且可以通過例如如歐洲專利說明書698611中所述的方法或者其類似的方法來製備。其他抗腫瘤核苷衍生物可通過常規方式製備，例如通過與上述對於卡培他濱和吉西他濱所描述的方式類似的方法來製備。
[0101]氮芥化合物包括環磷醯胺和苯丁酸氮芥(chlorambucil)。環磷醯胺可從例如Bristol-Myers Squibb公司以商品名Cytoxan購得,並且可以通過例如如英國專利說明書1235022中所述的方法或者其類似的方法來製備。苯丁酸氮芥可從例如Glaxo Welcome公司以商品名Leukeran購得，並且可以通過例如如美國專利說明書3046301中所述的方法或者其類似的方法來製備。與本發明相一致地使用的優選的亞硝基脲化合物包括上述涉及的卡莫司汀(carmustine)和洛莫司汀(lomustine)。卡莫司汀可從例如Bristol-MyersSquibb公司以商品名BiCNU購得，並且可以通過例如如歐洲專利說明書902015中所述的方法或者其類似的方法來製備。洛莫司汀可從例如Bristol-Myers Squibb公司以商品名CeeNU購得，並且可以通過例如如美國專利說明書4377687中所述的方法或者其類似的方法來製備。
[0102]抗腫瘤蒽環黴素衍生物包括上面涉及的道諾黴素、阿黴素(doxorubicin)和伊達比星(idarubicin)。道諾黴素可例如作為鹽酸鹽從Bedford Laboratories以商品名Cerubidine購得，並且可以通過例如如美國專利說明書4020270中所述的方法或者其類似的方法來製備。
[0103]阿黴素可例如作為鹽酸鹽從Astra公司購得，並且可以通過例如如美國專利說明書3803124中所述的方法或者其類似的方法來製備。伊達比星可例如作為鹽酸鹽從Pharmacia&Upjohn公司以商品名Idamycin購得，並且可以通過例如如美國專利說明書4046878中所述的方法或者其類似的方法來製備。其他的抗腫瘤蒽環黴素衍生物可通過常規方式製備，例如通過與上述對於道諾黴素、阿黴素和伊達比星所描述的方式類似的方法來製備。
[0104]赫賽汀可從Genentech公司以商品名Herceptin購得，並且可以通過如美國專利說明書5821337或PCT專利說明書W094/04679和W092/22653所述來獲得。
[0105]抗腫瘤的抗腫瘤足葉草毒素衍生物包括依託泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)。依託泊苷可從例如Bristol-Myers Squibb公司以商品名VePesid購得，並且可以通過例如如歐洲專利說明書111058中所述的方法或者其類似的方法來製備。替尼泊苷可從例如Bristol-Myers Squibb公司以商品名Vumon購得，並且可以通過例如如PCT專利說明書W093/02094中所述的方法或者其類似的方法來製備。其他抗腫瘤足葉草毒素衍生物可通過常規方式製備，例如通過與上述對於依託泊苷和替尼泊苷所描述的方式類似的方法來製備。
[0106]諸如如上所述的粗製形式或其部分的皂苷還可以游離形式使用，即不合併入含脂質顆粒中，例如抗癌劑。這些抗癌劑化合物可與含脂質顆粒混合、連上含脂質顆粒或合併入含脂質顆粒，所述含脂質顆粒例如為脂質體、ISCOM和/或ISCOM Matrix和posintros。如果當被合併時其為疏水的，則是合適的。否則可將疏水基團連在它們上面，如EP242380所述。
[0107]非疏水化合物，尤其是蛋白質或肽類可通過在其上連加疏水基團來變為疏水的。
[0108]可與所述非疏水化合物連加的疏水基團為直鏈、支鏈、飽和或不飽和的脂肪鏈(優選具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29或30個碳原子)，或者疏水胺基酸或肽或其他疏水結構，例如類固醇。疏水結構的長度與蛋白質的大小和性質相適應。舉例來說，具有10-15個胺基酸的肽(口蹄疫病毒)可合適地在氨基末端或者羧基末端·具有兩個酪氨酸。分子量為70000道爾頓的蛋白質要求約20個疏水胺基酸。憑經驗來進行檢測。因此，使用尤其是具有I至20個胺基酸、優選1、2、
3、4、5個胺基酸的肽,所述胺基酸尤其選自於Trp、lie、Phe> Pro、Tyr> Leu、Val之中，尤其是Tyr ;膽固醇衍生物,例如膽鹼酸、熊去氧膽鹼酸(ursodesoxycholine acid)。
[0109]這些疏水基團必須與可連上疏水蛋白質或疏水化合物的基團連接，所述可連上疏水蛋白質或疏水化合物的基團例如為竣基、氣基、二硫基、羥基、疏基和擬基，例如醒基。
[0110]可以連結的疏水基團優選地選自於羧基、醛基、氨基、羥基和甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、己烷、庚烷、辛烷的二硫化物衍生物，以及包括Cys、Asp、Glu、Lys的肽，優選辛醛和Tyr.Tyr.Tyr-Cys,-Asp或-Glu。具有能連結的基團的疏水基團必須根據將溶解的物質，在例如上述提到的增溶劑和清潔劑或者鹽酸、醋酸(67%體積的醋酸)、鹼液、氨的幫助下溶解於水。然後在不導致物質沉澱的情況下，將PH調節到中性範圍；此處應保證得到的pH值不會使疏水基團將連結的蛋白質變性。脂質可增強溶解性。
[0111]疏水分子可以10:1至0.1: 1、優選1:1的比例添加到非疏水化合物上。
[0112]帶有作為連結分子(coupling molecule)的羧基的疏水基團可通過水溶性碳二醯亞胺或者複合酐連結到蛋白質上。在第一種情況下，羧基通過碳二醯亞胺在PH5下被激活，並與溶解於PH8、具有高的磷酸鹽含量的緩衝液中的蛋白質混合。在後一種情況下，羧基化合物與氯代甲酸異丁酯在二氧己環或乙腈中的三乙胺的存在下反應，將得到的酸酐在PH8至PH9的情況下加到蛋白質上。也可能用肼將羧基轉化成醯肼，其與蛋白質中的高碘酸鹽氧化的糖單元中的醛和酮一起提供腙鍵。
[0113]通過亞硝酸，氨基可在低溫下轉化為重氮鹽，其與Tyr、His和Lys提供偶氮鍵。通過琥珀酸酐，羥基可轉化成可以羧基連結的半琥珠酸酯衍生物。醛基可與蛋白質中的氨基反應成希夫鹼。已描述了幾種連結基團和方法6，7，8。
[0114]然後將這樣產生的具有接收到的疏水基團的蛋白質、肽或化合物與糖苷複合成鍵，如在a)中所述，但是此處用於去除細胞碎片的純化步驟可以省略。
[0115]將疏水基團包進去了的親水蛋白質可通過經過溫和地將蛋白質變性(B卩，通過約為2.5的低pH、3M尿素或者在70攝氏度以上的高溫下變性)而使疏水基團露出來而變成疏水的。該蛋白質可為免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。所述免疫球蛋白可用作抗獨特型抗體(antidiotypic antibody)。所述蛋白質作為如(b)中所述的蛋白質來純化得到，然後如(a)中所述複合連結到糖苷上，用於去除細胞碎片的純化步驟可以省略。
[0116]疏水或兩親分子還可選自磷脂，例如磷酸甘油的衍生物，例如磷脂酸的衍生物，SP卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂、具有14、15、16、17、18、19和20個碳原子的鞘氨醇衍生物、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯膽鹼。
[0117]可選自抗原、佐藥、靶標分子、藥化合物和營養物的上述所有兩親分子和疏水分子可合併入納米顆粒，或者在組合物中與之混合。
[0118]所述藥組合物可用作佐藥，例如，用於與開發中的疫苗一起使用、用於與季節性流感病毒疫苗一起使用、用於與大流行性流感疫苗一起使用或用於與緊急疫苗、例如對抗生物武器的疫苗一起使用。因此，本發明還涉及包括如上所述的G3顆粒的藥學疫苗配方。
[0119]本發明還涉及一種用於治療或預防由生物體導致或者加重的疾病的方法，其包括給需要其的主體施用根據本發明的藥學疫苗配方。
[0120]進一步地，本發明涉及一種用於癌症`的治療的方法，其包括給需要其的病人施用藥學有效劑量的根據本發明的納米顆粒或者組合物。根據一個實施方式，所述癌症是白血病。
[0121]藥學組合物可為可無菌注射的水懸浮液或者油懸浮液的形式。該懸浮液可根據現有技術使用上面提到的合適的分散劑或者溼潤劑以及懸浮劑來配製。無菌可注射的製劑還可為非毒性的腸道外可接受的稀釋液或溶劑中的無菌可注射的溶液或懸浮液，例如作為1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的載體和溶劑有水、林格氏溶液(Ringer』 ssolution)和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的固定油通常被用作溶劑或懸浮介質。為了此目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸，例如油酸，可用於血管注射劑的製備。
[0122]所述溶液或懸浮液還可包括至少一種下列佐藥:無菌稀釋液，例如用於注射的水、鹽水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，例如苄醇或苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或者亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩衝液，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於滲透壓調節的試劑，例如氯化鈉或者右旋糖。所述腸道外製劑可裝入安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料製成的多劑量容器中。
[0123]所述通式化合物可腸道外施用。在此所用的術語腸道外包括輸液技術的皮下注射、靜脈注射、肌內注射、皮內注射、電穿孔(electroporation, EP);無針注射-噴流注射、基因槍、bil jector,以及口服、噴霧施用。對於口服使用，例如如Eliasson等人9所述來使用蛋白A衍生的化合物CTA1DD，其具有靶向對於用於黏膜免疫(尤其在腸道中，但也可潛在地對於癌症尤其是B細胞淋巴瘤)的誘導的細胞處理十分有用的B細胞的性質。
[0124]一般來說，將本發明的包含脂質的顆粒以藥學有效量施用。實際施用的顆粒的量將典型地由醫師考慮相關環境因素來決定，所述相關環境因素包括要治療的病情、所選的施用方式、實際施用的化合物、年齡、體重、個體病人的反應、病人症狀的嚴重程度等。
[0125]根據本發明的納米顆粒可在抗任何微生物的任何疫苗中用作佐藥。可將其用於任何動物，例如鳥類、哺乳動物(例如人)、家畜(例如貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛和馬)。根據一個實施方式，本發明在抗動物中的鏈球菌和馬中的流感的疫苗中用作佐藥。
[0126]人使用的劑量可根據所包括的其他化合物而變化。考慮到治療的持續時間，所述劑量的範圍可為每天〈50 μ g至Img或更多。
[0127]本發明還涉及用於評估根據本發明的方法用於對個體病人的癌症的治療的適用性的方法，其包括
[0128].將來自所述病人的癌細胞與根據權利要求1至7中任意一項所述的納米顆粒或者根據權利要求8或9所述的藥組合物體外接觸；
[0129].測量所述納米顆粒或藥組合物對所述癌細胞的治療效果的至少一種效果指標；
[0130]其中，如果納米顆粒或者藥組合物對所述癌細胞顯示治療效果的顯著的效果指標，則將根據權利要求10或11所述的方法評估為可適用於所述個體病人。
[0131]治療效果的指標可通過在細胞周期調節中十分重要的基因的下調(隨著周期素依賴性蛋白激酶(cycline dependent kinase,Q)K)、細胞周期蛋白(cyclin)或者其他分子促進在細胞周期和複製中通過檢查點(check point)(⑶K2、⑶K6和細胞周期蛋白Dl))或者胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的下調和促進細胞分化的`分子的上調(隨著IL-8、FOXCl和HDAC5也表示離開細胞周期)來讀取。所述調節因子為例子，存在更多調節因子，即所述例子為非限制性的。
[0132]本發明還涉及一種用來生產不含磷脂的納米顆粒的方法，其包括以下步驟:
[0133]a)提供疏水表面或脂質體的懸浮物；
[0134]b)將疏水表面或脂質體的懸浮物與留醇溶液接觸，優選為作為單體溶解於有機溶劑或者清潔劑中的膽固醇；
[0135]c)去除溶劑或清潔劑，在表面形成留醇膜；
[0136]d)提供皂樹皂苷膠束的水溶液；
[0137]e)將包括皂苷膠束的水溶液加入到留醇膜，通過它們在皂苷和留醇之間形成複合物，並懸浮於水溶液中。
[0138]疏水表面可為在罐、盆、幾層表面、珠子(例如乳膠珠)、網或三維網或多孔材料中的表面。還可為具有整合入脂膜中的組分的脂質體。
[0139]如所述(例如在Review Liposomes Preparation Methods Mohammad RiazFaculty of Pharmacy,University of the Punjab, Lahore,Pakistan Pakistan Journalof Pharmaceutical Sciences Vol.19 (I), Januaryl996, pp.65-77 中)，脂質體可根據多種技術和用不同組分來構建。脂質體還可作為病毒顆粒來構建，所述病毒顆粒包括整合在脂質體膜中的病毒蛋白。所述脂質體還可在水溶液中。設備可例如組裝在柱子中。
[0140]皂苷和甾醇可為上面對於納米顆粒提到的皂苷和甾醇。[0141 ] 溶劑可為可在下面網站找到的任何溶劑http://en.wikipedia.0rg/wiki/OrRanic solvents或清潔劑，優選為氯仿、乙醇或乙腈。所述溶劑的性質在http://en.wikipedia.0rg/wiki/Organic solvents中描述。溶齊Li的選擇取決於將要溶角軍的分子的性質。不同種類的溶劑主要根據極性和非極性來分類。非極性溶劑例如己烷、氯仿和二乙基醚。提到的這些十分有用，因為它們的沸點在35和65之間而可以揮發，有利於通過揮發來分離。極性非質子溶劑常用於藥物分子的溶解，例如二甲亞碸、乙腈。關注後者因為其沸點低。極性質子溶劑也有用，尤其在與其他溶劑聯合時。乙醇、甲醇的沸點低，乙酸的沸點高。低沸點對於揮發技術尤為重要。可用兩種或多種溶劑實現溶劑。提到的溶劑是例子，而存在更多具有也許對於用在本發明中以形成G3製劑更想要的性質的溶劑。
[0142]可用溶劑的例子有非離子、離子(即陽離子或陰離子或兩性離子)清潔劑，例如基於五倍子酸的兩性洗滌劑或清潔劑，其過量使用。合適的非離子清潔劑的典型例子有N-醯基-N-烷基-葡糖胺、聚乙二醇酯和含有脂肪族或芳香脂肪族酸和醇的聚乙二醇醚。其例子為具有通式CnH2n+1 (OCH2CH2)xOH,簡寫為CnEx的烷基聚氧乙烯醚；在烷基和聚氧乙烯鏈之間包括苯環的烷基苯基聚氧乙烯醚，縮寫為Cn ph1.Ex, Triton X-1OO=叔C8E96 (聚氧乙烯的辛基酚酯)，醯基聚氧乙烯酯:醯基聚氧乙烯山梨醇酯，縮寫為Cn山梨醇Ex，例如吐溫20 (Tween-20)、吐溫80 (Tween-80), β-D-烷基糖苷，例如β-D-辛基糖苷。合適的離子型清潔劑的例子有五倍子酸清潔劑，例如鹽酸、脫氧膽酸鹽、膽酸鹽和溴化十六烷基三甲銨(CTAB)0甚至可使用共軛的清潔劑，例如牛脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽和甘氨膽酸鹽。其他可能的增溶劑有溶血卵磷脂和合成的溶血磷脂。甚至可使用上述清潔劑的混合物。當使用透析法時，清潔劑應該在不太長時間裡能夠透析。
[0143]—些表面活性物質大大促進基質(matrix)形成。其包括帶有極性頭基團和非極性脂肪鏈的內在的生物膜脂質(例如磷脂醯膽鹼(帶負電)和磷脂醯乙醇胺(帶正點))。
[0144]根據一個實施方式,清潔劑可為Triton-X-1OOdit^i 20、諾乃清潔劑、NP-40、脫氧膽酸鹽、MEGA-10和辛基糖苷。通過透析可去除MEGA-10和辛基糖苷。對於其他的，可使用如所提的的其他技術，例如離心法和柱色譜法。
[0145]可溶的試劑可使用低沸點的有機溶劑通過揮發來除去，或者通過透析或者通過如EPC專利0109942所述的透析、色譜、過濾或切向流來除去。
[0146]皂苷膠束的水溶液通過加入如從生產者獲得的凍幹或噴霧乾燥的粉末來獲得。所述皂苷或者皂苷部分通常保藏在儲備溶液中，例如10mg/ml水，但不限於此濃度，並加入脂膜周圍的水中到終濃度在CMC濃度以上，即臨界膠束濃度，例如30mg/升，具體的數字取決於皂樹產品。皂苷作為Quillaja Powder Extract獲得，並可作為粗製的皂樹提取物(美國Berghausen公司)、Quillaja Ultra Powder QP UF300、Quillaja Ultra Powder QP UF1000或者Vax-Sap (—種未分離的皂樹皂苷產品)、QHA和QHC部分(所有三種購自智利NaturalResponses公司)或購自智利聖地牙哥的Prodalysa公司。
[0147]本發明使用新的生產方法，其中連接於疏水表面的留醇的人造膜從步驟a_c)製備。皂樹皂苷產品的水溶性膠束和在皂樹膠束和人造膜中的組分之間的化學(共價)連接將人造膜組分提取到可溶於水的複合物中，作為創新的水溶性納米顆粒型複合物，即G3。本複合物通過化學(共價)連接來聚在一起，其使親水部分保持在水相中並連接在一起，並且組分之間的疏水相互作用保留在複合物的中間。所述膜由帶有可溶性試劑的有機溶劑形成，所述可溶性試劑可為清潔劑或有機溶劑。
[0148]將要結合入人造膜中疏水分子和兩性分子用有機溶劑或清潔劑與步驟b)中的甾醇一起溶解，並通過有機溶劑的揮發轉移到水相。根據有機溶劑，如果沸點低於水的沸點則通過揮發來去除，或者通過透析或對ISCOM形成所描述的類似的技術來去除。因此，溶劑的去除不是顆粒的形成的一部分，但是不是顆粒的形成的一部分的人造膜的形成的一部分。在人造膜的形成完成之後，在人造膜周圍存在水。在該水相中，加入懸浮(溶解)於水的皂樹膠束，取出水相中的人造膜，並將皂樹膠束改組到新的G3-製劑中。所述組合物可輕易調節為使人造膜完全溶解成水中的顆粒狀懸浮物。從涉及到共價連接的構建的角度來看，所述組合物與膠束不同，因此，形成了一種創新的顆粒。
[0149]在步驟f )和g)中，皂樹產品的水溶性膠束形式允許相互作用，以得到成為水相的終產物。該步驟的第一相互作用是皂樹膠束和人造膜中的留醇之間的共價連接，第二相互作用是在皂樹三萜系化合物骨架和所述留醇之間的相互作用。在合適的比例下，人造膜中的所有組分被結合到水溶性皂樹膠束中而形成新的納米顆粒，所述新的納米顆粒的尺寸將從17nm直到40nm的範圍內變化。如果脂質(例如磷脂)存在於人造膜中，會得到更大的尺寸。實施例2、4、9、14、15和16顯示了根據本發明，多種親脂分子已被結合，包括DT、白消安、細胞周期依賴性蛋白激酶(⑶K)抑制劑(roscovitine)、vivolux40和維生素D3。
[0150]ISCOM Matrix可用新方法通過向包括步驟b)中的甾醇的懸浮液中加入至少一種磷脂來生產。
[0151]所述磷脂可選自磷酸甘油的衍生物，例如磷脂酸的衍生物，即卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂、帶有14、15、16、17、18、19和20個碳原子的鞘氨醇衍生物、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯膽鹼。
[0152]疏水組分可結合在步驟b)中，即還包括結合在脂質、留醇的人造膜中。
[0153]在步驟b)中，將水溶性形式的皂苷(即膠束形式)加入覆蓋人造膜的水相。
[0154]用所發明的納米顆粒來取代ISCOM Matrix,因為所述納米顆粒生產起來更加簡單、經濟，這是由於根據本發明的納米顆粒基於2種組分，即皂樹皂苷、膽固醇，相比之下，ISCOM顆粒形成包括3種組分，即皂樹皂苷、膽固醇和第三組分一磷脂，例如磷脂醯膽鹼。所述皂樹組分不需要用清潔劑或有機溶劑來溶解。根據本發明的新的生產技術是強有力的，並將克服敏感的平衡。因此，本新型方法比ISCOM Matrix工藝對於整合第四、第五或更多組分(即，其他疏水分子或兩親分子)來說更加適合，因為迄今研發的方法使得這些化合物在水中具有自動形成穩定的複合物(例如膠束)的強的趨勢(自組裝)，因此不整合到ISCOM Matrix製劑中，例如通過疏水相互作用。因此，將ISCOM Matrix工藝研發成一般輸送體系是具有缺陷的，但本發明不具有這類缺陷。
[0155]這裡所提到的所有文獻通過引用全部結合在本文中。現在，本發明將通過下列非限制性實施例來闡述。
[0156]實施例
[0157]材料和方法
[0158]化學品和化合物
[0159]膽固醇(C8667)、卵磷脂(PC，P-5763)和氯仿(288306)都購自Sigma-AldrichSweden AB公司(瑞典斯德哥爾摩)。皂樹皂苷的A部分(QHA)和C部分(QHC)都購自ISCONOVAAB公司(瑞典烏普薩拉)。雙萜類化合物(DT)，即甜葉菊從智利ProdalysaLtda獲得。維生素D3從Miva Nutr1-molecular Research有限公司(中國上海)購得。
[0160]細朐系
[0161]人類巨噬細胞(ΜΦ)細胞系U937 (其常在生物和癌症研究中用作模式細胞系)和人類急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)細胞系HL-60在培養基RPM1-1640中生長。人類前列腺腺癌PC-3在50/50的HAM’sF-12K和RPM1-1640的混合物中培養。所有細胞都由烏普薩拉大學的臨床藥理學系善意地提供。所有培養基都添加10%的熱失活的胎牛血清(fetal calf serum, FCS)、2mM穀氨酸鹽、100 μ g/ml鏈黴素和100IE/ml青黴素(都購自Sigma Aldrich公司(美國密蘇裡州聖路易斯市)。所有細胞系都在37°C下在包括5%C02的加溼氣體下培養。
[0162]人類樹狀細胞(Dendritic cells, DCs)
[0163]不成熟的人類樹狀細胞購自3HBiomediCal公司(瑞典烏普薩拉)。
[0164]體外實駘步驟
[0165]在37 °C下在包括5%C02的加溼氣氛下，將在96孔微滴定板中的、細胞密度為5000-20000細胞/孔的細胞暴露在包括同樣濃度的QHC的連續稀釋的G3、KGI和皂樹皂苷產品中72小時。對於U937細胞，一組細胞直接用於微培養細胞毒螢光分析(fIuorometricmicroculture cytotoxicity assay,FMCA)來測量所述製劑的細胞殺死效果。對於其他組細胞，收集150 μ I/孔的上清液用於細胞因子IL-8測定。
[0166]癌細胞殺死效果的測暈
[0167]FMCA方法基於測量通過具有完整細胞膜的細胞將螢光素雙乙酸鹽(FDA)水解成螢光素所產生的螢光。在上述孵育3天`之後，吸除培養基。用PBS洗滌一次之後，加入溶解於生理緩衝液(10 μ g/ml)的100 μ I/孔的FDA。孵育板45分鐘，在96孔掃描螢光儀中測量從每個板產生的螢光。螢光與孔中完整的細胞的數量成比例。對於成功的分析的質量標準包括在對照孔中的螢光信號超過五次為空白平均值、在對照孔中平均變異係數(co-efficient of variation, CV)為少於 30%。
[0168]對於受G3製劑刺激的U937細胞的細胞因子IL_8測定
[0169]根據生產商指南(人類IL-8ELISA，目錄編號S8000C，研究與開發系統，美國明尼蘇達州Minneapolis,郵編55413)進行對於人類IL-8的檢測的ELISA實驗。簡而言之，將50 μ I重建的標準的人類IL-8和上清液加入到一式三份的孔的每個孔中，並且通過輕拍板幾次來充分混合。然後將板用粘貼板蓋蓋上，並在室溫(RT，20-25°C)下孵育一小時。孵育後，用洗滌緩衝液將板洗滌3次，並且加入50 μ I/孔的生物素化的抗體試劑(抗人類IL-8)。將板用粘貼板蓋重新蓋上，並在室溫下孵育I小時。用洗滌緩衝液洗滌3此之後，使用100 μ I/孔的鏈親和素-HRP溶液。將板用粘貼板蓋重新蓋上，在室溫下孵育30分鐘。棄去板中的內容物，將板用洗滌緩衝液洗滌3次。將100μ I的TMB底物溶液用到每個孔中。在室溫中、在黑暗條件下使酶變色反應進行30分鐘。通過加入100 μ I/孔的終止液來停止反應。在ELISA讀板儀上在450nm和550nm處讀取吸光度。用450nm的值減去550nm的值來校正微板中的光學誤差。然後生成標準曲線，並用來計算未知樣品中的人類IL-8的含量。通過將從在垂直軸(Y軸)上的每個標準濃度得到的平均吸光度對比水平軸(X軸)上的相應的濃度(pg/ml)畫圖來產生標準曲線。[0170]被G3製劑刺激的人類單核細胞的細胞因子IL-12基因表達
[0171]通過基因晶片，將用G3、DT、加上DT的G3處理的樹狀細胞的細胞因子IL-12的基因表達與對照細胞進行比較。簡而言之，將正常人類單核細胞暴露在10 μ g/ml的G3、100 μ g/ml的DT和同樣濃度下同樣顆粒中的兩者的結合之下6小時，然後根據生產商手冊(QIAGENRNEASY小試劑盒)來提取RNA。在「瑞典烏普薩拉的烏普薩拉大學醫院臨床化學和藥理學部門的烏普薩拉晶片平臺」，通過經逆轉錄將RNA樣品轉化成帶標記的cDNA並將來自多種樣品的定量數據與未處理的細胞進行比較(AmbionWT表達試劑盒)來進行RNA表達分析。
[0172]胸苷激酶(Thymidinekinase, TK)活件
[0173]用購自Biovica公司(瑞典烏普薩拉)的試劑盒來測定TK活性。簡而言之，在不同時間點暴露於KGI或G3製劑之後，將濃度為0.1-1 X IO6細胞/ml的100 μ I細胞懸浮液轉移到微量離心管中，在200g離心10分鐘。將細胞團塊重懸於100 μ I的冷PBS中，冰凍/解凍2-3次。以最大速度離心5分鐘，然後收集細胞。根據生產商的說明書來測量細胞間的TK活性。
[0174]維生素D3的測暈
[0175]將維生素D3(維他命D3)結合到G3顆粒上的樣品在大學醫院實驗室中在Liaison自動儀上進行分析。儘管所述試驗(DiaSorin Liaison)被設計用來測量25-H0-D3，它與未羥化的維生素D3還是有約1%的交聯反應性。
[0176]流感病毒株以及疫苗
[0177]人類流感 病毒A/California/07/2009 (H1N1 )、APerth/16/2009 (H3N2)和 B/Brisbane/60/2008 (B)作為非佐藥疫苗在疫苗的製備、血清學測試和淋巴細胞的再刺激中用作抗原。將病毒在VERO細胞中培養，用脫氧膽酸鹽分裂。它是由生產商善意地提供的。收集後，將病毒純化，失活，分裂並以30 μ g蛋白/ml的濃度重懸。如圖1所示，該劑量包括I μ g病毒抗原和多種含量的佐藥。
[0178]接種疫苗
[0179]對斯德哥爾摩卡羅林斯卡學院(Karolinska Institute)的大學醫院(UniversityHospital)的動物房餵養的C56B16小鼠在頸部進行皮下接種疫苗兩次。具體細節請參見實施例12。
[0180]血細胞7疑集(Haemagglutination, HA)測I驗
[0181]將在檸檬酸鹽溶液中收集的雞紅細胞(RBCs)用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)PH7.2洗滌三次，並在包括0.05%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中以0.5%的濃度重懸。在4°C下在U型微板中進行I小時的HA測驗。
[0182]血細胞7疑集^Φ?Ι?Ι(Haemagglutination inhibition, HI)測I驗
[0183]在室溫(RT)下將血清樣品和30%的雞RBC懸浮液一起孵育I小時。吸收後，將混合物以500Xg的轉速離心10分鐘，並收集上清。最終的血清稀釋為1:5。使用V型微板、以16HA-單位/50 μ I來進行HI測驗。血清樣品25 μ I被用等量的PBS-BSA兩倍稀釋。將稀釋過的血清在室溫下與25 μ I的病毒懸浮液一起孵育I小時，然後將混合物在4°C下孵育I小時。認為100%抑制血細胞凝集的最高血清稀釋度是樣品的抗體滴度。
[0184]淋巴細胞的製備[0185]儘可能無菌地得到脾-淋巴細胞(脾細胞)。在再次接種疫苗之後3周時，使接種疫苗的和未接種疫苗的小鼠通過頸部脫白而出血並死亡。取出脾臟，隨後仔細處理,將其通過無菌的不鏽鋼網，並使用移液管來用含有兩性離子緩衝劑的EMEM將其衝洗。用含有兩性離子緩衝劑的EMEM將細胞洗滌2次，以500Xg的轉速離心。然後，將團塊在添加有1%胎牛血清(FCS)、10 μ g/ml慶大黴素、2mM的L-穀氨酸鹽、3.81g輕乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)/L和5X 10_5Μβ -巰基乙醇(培養基)的F-DMEM培養基中重懸。通過臺盼藍染料排斥實驗來分析細胞生存能力。
[0186]酶聯免疫斑點試驗(Enzyme-linked immunespot assay, ELISP0T)
[0187]使用市售針對INF- Y、IL-2或IL-4的ELISP0T試劑盒來進行分泌細胞因子的脾細胞的計數。試劑盒購自瑞典斯德哥爾摩Mabtech公司。根據Mabtech公司推薦的指南來使用ELISP0T板。
[0188]對於每種細胞因子，將濃度為2 X IO5每100 μ I培養基的脾細胞用移液管吸取到8個不同的孔中。四個重複收到包括4.5 μ g流感病毒抗原的血細胞凝集素的50 μ I培養基。測試的四個孔僅僅收到100 μ I培養基。將板在37°C下在加溼過的盒中孵育18小時，隨後去掉細胞並洗滌孔。根據Mabtech公司描述的步驟來發展孔點。簡而言之，將板在室溫下與100 μ I生物素化的單克隆抗體(MoAb)抗IFN-Y、IL-2或IL-4 一起孵育2小時。然後，將板仔細清洗，然後在室溫下與HRPO結合的鏈黴親和素一起孵育I小時。在另一輪洗滌之後，將板與底物一起在室溫下孵育約15分鐘或者直到不同的孔點出現。用自來水洗滌板來停止反應。最後，使板乾燥，隨後用ELISP0T計數器來對孔點的數目進行計數。
[0189]數據分析和統計
[0190]用計算的SI值和軟體程序GraphPadPrism4 (美國加利福尼亞州聖地牙哥的GraphPad Software公司)來分析劑量-反應數據。以平均值土標準誤差來表示數據。通過單因子方差分析(one-way AN0VA)來進行幾組平均值之間的統計學推斷，所述單因子方差分析用組平均值的Tukey多 重比較後測試，並用來在GraphPadPrism中通過Studentt-測試來比較2組平均值。
[0191]第一部分製劑和表徵
[0192]實施例1
[0193]在本實施例中，描述了 G3納米顆粒的製劑。在實驗設計的步驟2A和B中，(見下文)探索了皂樹皂苷的膽固醇比QHC的比例的影響(來自於瑞典Uppsala的ISC0N0VA AB公司，見W02008/063129)。在步驟C中，探索了加入磷脂對於顆粒形成的效果。
[0194]實驗設計
[0195]在步驟I中，形成了人工膽固醇膜，其要求在清潔劑或有機溶劑中有溶解性。在該實驗中，我們使用氯仿(288306,瑞典斯德哥爾摩的Sigma Aldrich Sweden AB公司)作為膽固醇(C8667,瑞典斯德哥爾摩的Sigma Aldrich Sweden AB公司)的溶劑，以產生100mg/ml的儲備溶液。在微量離心管中，加入稀釋於50 μ I氯仿中的來自儲備溶液的2μ I膽固醇，隨後在膽固醇溶液的上部加一層0.5ml的水。通過用帶針頭的吸管來產生的氣流來使氯仿揮發。在管壁上看到一層可見的膽固醇層。
[0196]在步驟2中，
[0197]將0.5ml的水用Iml新鮮水替代，並將10 μ I的QHC儲備溶液(水中100mg/ml)加入水中，隨後在37°C下過夜孵育。所述膜從管壁上消失，看見清楚的水溶液。
[0198].Α.使用如步驟I所述處理的2 μ I的膽固醇儲備溶液和步驟2中的10 μ I的QHC來產生該G3製劑，所述膽固醇儲備溶液和所述QHC的摩爾比為1:1
[0199].Β.使用另一摩爾比，即2摩爾的膽固醇比I摩爾的QHC。實驗的其他部分均與A中相同。
[0200].C.使用I摩爾膽固醇比I摩爾卵磷脂(Ρ-5763購自瑞典斯德哥爾摩的SigmaAldrich Sweden AB公司)的摩爾比來形成步驟I中的膜。在步驟2中，使用2摩爾的QHC。
[0201]結果
[0202]A.揮發後，實現了通過電子顯微鏡(EM)和梯度離心表徵的具有均一尺寸的17nm顆粒，見圖1A。G3懸浮液呈清液狀。
[0203]B.揮發後，用電子顯微鏡觀察到具有稍寬的尺寸範圍的顆粒，直徑中位數為約17nm (未顯示)，即在2mol的膽固醇和Imol的阜樹阜苷的範圍內也產生了 17nm顆粒。
[0204]C.所述產物具有類似於ISCOM顆粒的形態，其直徑約為40nm (圖1B)。因此，同時加入磷脂醯膽鹼的形態與根據G3發明而沒有磷脂醯膽鹼的納米顆粒的形態完全不同。還可以推定，根據本發明的納米顆粒對於包括磷脂醯膽鹼(如LSvgrcn Morein (I)所主張的，其對於ISCOM製劑是必需的)的磷脂的併入來說是極佳的基底。
[0205]結論和討論
[0206]以I膽固醇比I皂樹的摩爾比，形成了小(17nm)納米顆粒。膽固醇的比例越高(即2膽固醇比I皂樹或更 高的摩爾比)，則出現越大的顆粒。應注意，通過在步驟I中其他親脂組分的加入，顆粒的尺寸將有所變化，即顆粒的加載影響尺寸。在此情況下，尺寸的範圍被記錄為在17和40nm之間，但不僅限於此範圍。尤其重要的是，電子顯微鏡下並沒有看到顆粒的聚集，反而顆粒互相之間很好地分散開。
[0207]將親脂物質變得可溶於水的一個重要且新穎的概念是該兩步步驟。有多種形成脂膜(例如沒有固體疏水支持物但在水相中呈游離懸浮態的脂質體)的方式。第二步通過先進入水溶性G3顆粒來將膜萃取到水相中。
[0208]應注意，用來形成根據本發明的納米顆粒的步驟很強大，又比現在使用的方法(如用來製備ISCOM製劑的方法(L0v_grcn &Morein，見上文))簡單得多。最重要的是，隨著所用的揮發，幾乎沒有用於顆粒製備的物料(即皂樹皂苷在所提情況下QHC或膽固醇)的任何損失，並且不需要磷脂，進一步減少了生產成本。有意思的是，根據本發明的納米顆粒可用作形成ISCOM的基底。
[0209]如果將清潔劑用來增溶，則必須除去清潔劑，如LSvgren Morein2所述如通過透析、柱色譜法、超速離心或者切向流來去除清潔劑，使用帶有疏水表面的珠子(如乳膠珠子)可能更加實際。因此，該兩步步驟是製備納米顆粒的創新且有效的方法，所述納米顆粒根據加載內容可在形態上有所變化。
[0210]此外，在第一步製備膜的此方法是將親脂分子加入到第2步中的水溶性G3顆粒上的一種通用方法。
[0211]實施例2
[0212]本實施例顯示了具有兩親性的分子可加入根據如實施例1所述的技術的G3顆粒上。應注意，G3天然就作為膠束可溶於水，在施用後由於在注射位點的稀釋而分解，隨後在從所述位點輸送之後。因此，它具有低的、差的生物利用度(bioavailability)。因此，在G3中穩定的複合物十分重要。
[0213]實驗設計
[0214]實驗設計與實施例1實質上相同，除了疏水分子雙萜類化合物(DT)也與如實施例1所述的膽固醇同時溶解。使用與實施例1 (即I μ I DT (作為儲備溶液的在99%乙醇中的100 μ g/ml)以在實施例1中對步驟I描述的I膽固醇:0.5DT的摩爾比例溶解)相同的兩步步驟來將DT分子與Quil A的C部分(QHC)和膽固醇一起加入到G3顆粒中。在步驟2中，將QHC以與實施例1中的膽固醇為1:1的摩爾比加入。
[0215]結果
[0216]結合了 DT的G3顆粒具有與圖1A所示的不含DT的G3顆粒相同的形態。在步驟I中，能在管壁上看到一層膜，其在步驟2中消失。來自步驟2的水溶液是澄清的至稍稍乳白色的，並且沒有發現沉澱物。
[0217]結論
[0218]在膠束形式中的兩親分子雙萜類化合物(DT)成功地通過所用溶劑所分解，並在步驟2中合併到根據本發明的納米顆粒上，得到典型的17nm的G3納米顆粒。因此，顯示了使用根據本發明的G3納米顆粒作為兩親分子的載體/傳送體系的能力。具有所需的結構的兩親分子形成在施用給個體之後大多不穩定的膠束，其常常導致低的生物利用度。在實施例4中顯示了該G3-DT顆粒具有生物活性。在巴黎公約優先權期間將進行進一步的研究以進一步證明免疫增強能力和根據本發明的納米顆粒作為傳送顆粒，以及對於通過與細胞(例如，在細胞膜中通過受體)的相互作用來增強生物效果的有用性。更多信息請參見Hu等人3的文獻，其通過引用合併到本文中。通過結合具有補充性質的其他分子，包括免疫增強效果和癌細胞殺死效果將潛在地被實質上拓寬。
[0219]實施例3`
[0220]在代表淋巴腫瘤細胞的U937模式細胞系中體外測試G3殺死癌細胞的能力。
[0221]實驗設計
[0222]如在《材料和方法》(Materials and Methods)中所述,G3顆粒使用膽固醇和QHC之間的多種重量或者摩爾比來製備。孵育多種製劑，並且如《材料和方法》中所述，在通過FMCA方法染色和讀取之後測量癌細胞殺死效果。
[0223]結果
[0224]如實施例1所述，以I膽固醇比5QHC (根據重量)，即I膽固醇比IQHC (根據摩爾濃度)形成了 G3顆粒，並由根據EM結果(見實施例1和圖1A)的形態推斷。G3顆粒的U937癌細胞殺死效果與KGI顆粒的強度相同(圖2)，表明當活性組分QHC結合到G3製劑時，活性組分QHC得到保持。之前已知KGI能殺死U937癌細胞(PCT/SE2007/050878)。
[0225]實施例4
[0226]本實施例顯示了根據如實施例1和實施例2所述的技術，兩親分子DT可結合入G3顆粒。
[0227]DT是一種雙職，由甜葉菊(Stevia rebaudiana bertoni) 1CI產生的甜菊苷。我們使用了 DT，因為它具有一些如所公開的11有趣的醫學(包括免疫的)性質。該化合物的一個問題是它的體內生物利用度低，因為我們經歷了需要傳送體系，例如在納米顆粒中。[0228]實現DC誘導癌細胞U937產生IL_8的能力以探索免疫效果，但更重要的是，以用此細胞因子證明DC可能導致癌症分化，其對停止不受控的癌細胞增殖十分重要。此外，檢測了 DT誘導包括IL-12的人類DC細胞因子的能力。進行這些測驗以強調DT對於Quil A具有重要的補充性免疫效果，因此，將它合併到G3顆粒上十分重要。DT由智利聖地牙哥的Prodalysa LTDA公司來供應。這裡我們使用如《材料和方法》中所述來製備的人類樹狀細胞(DC)。
[0229]實驗設計
[0230]所述U937細胞與KGI或者G3製劑一起在37°C下孵育48小時，從100 μ g/ml開始，然後5倍稀釋6次。然後，收集上清液，並用於IL-8的檢測，如《材料和方法》所述。
[0231]為了測量基因表達，人類DC與下列各項一起孵育6小時:BBE、KG1、甜葉菊以及甜葉菊與BBE或KGI —起(圖4A)，以及加上或未加甜葉菊的G3(圖4B)。來自處理過的DC的多種細胞因子基因的表達通過如《材料和方法》所述的mRNA晶片分析來實現。
[0232]結果
[0233]G3顆粒誘導U937癌細胞產生類似水平的IL_8，其是癌細胞的分化標記，通過KGI誘導(圖3)來產生。
[0234]圖4A顯示了 DT誘導高水平的IL-12、ILl β和IL-6，比由ISCOM (如KGI和BBE製劑)誘導的更高。
[0235]合併有DT的G3顆粒誘導高水平的IL-12，但沒有合併DT的G3顆粒並不誘導可檢測水平的IL-12 (圖4Β)。
[0236]討論和結論
[0237]DT具有與G3互補的性質。誘導U937癌細胞來產生IL_8的能力可表明免疫增強。更重要的是，G3可單獨地分化並導致癌細胞停止增殖，就像KGI，正如我們已經表明的(原稿準備加上)。對單獨的G3的補充效果，已顯示了 DT強烈地誘導IL-12，這對於誘導Thl型反應，尤其是對IFN-的產生來說十分重要，所述IFN-的產生對於某些腫瘤具有抗癌效果。以免疫角度來看，如果存在被免疫系統識別的腫瘤抗原，則IL-12對於腫瘤的排斥十分重要。IL-12還對於抗病毒感染的免疫防禦很重要。尤其重要的是記載DT作為運載/運送顆粒來合併入G3，這增加了在施用之後它在顆粒形式下的穩定性，從而增強了 G3的生物利用度。應注意，單獨的DT在水中是膠束形式。施用給個體的身體的膠束形式將解體，因為在施用位點受到稀釋並隨後隨著它從所述位點運走而減少。G3顆粒由其他作用力來聚在一起，並例如在注射之後不解體，這被EM研究所記錄(未發表)。本實施例強調了 G3發明作為兩親分子的載體。
[0238]實施例5
[0239]胸苷激酶(TK)活性被G3顆粒抑制是防止癌細胞的不受控的複製和在後續步驟中引導細胞進行程序化細胞死亡(即細胞凋亡)的重要性質。
[0240]為了探索G3顆粒抑制癌細胞複製的一種機理，通過測量TK對於U937細胞的酶抑制來進行檢測。除了使用TK酶活性的抑制來顯示癌細胞複製的抑制，這種行為模式將被用來檢測用於抗癌治療的G3顆粒或者任何其他皂樹製劑是否在單獨或者與其他抗癌製劑一起來治療腫瘤病人中有用。這種·檢測可在試劑盒中使用，以測量使用作用於定義為個人化醫療的領域中的臨床樣品的TK模式的抑制的抗癌藥的敏感性。[0241]實驗設計
[0242]將U937細胞暴露在同樣濃度的G3或KGI下。如在《材料和方法》中所述，在不同的時間點，收集被處理過的細胞，並且測量細胞間的TK活性。
[0243]結果
[0244]G3顆粒基本上抑制了與被KGI抑制的同樣強度的細胞間的TK活性(圖5)。
[0245]結論
[0246]TK活性的抑制顯示癌細胞停止複製。因此，TK活性在細胞水平的抑制可用於測量來自於病人樣品的癌細胞對於藥品(即G3顆粒)的敏感性，這會對個人化醫療鋪路。據我們所知，TK活性已經被用作從癌症病人檢測血清TK或者從病人檢測其他疾病指標的非特異性檢測:通過在來自病人的癌細胞上直接使用TK活性是我們的創新(具有100%特異性，即僅僅使用了癌細胞)。這和癌細胞殺死性質一起使得G3顆粒通過避免其用於非應答的病人而對於臨床應用來說更為可行。
[0247]第二部分G3作為抗癌藥物
[0248]實施例6
[0249]本實施例顯示了 G3以及含DT的G3 (G3-DT)比G3中作為非顆粒形式的活性組分QHC (QHC)更加有效地殺死非實體瘤人類急性髓細胞性白血病(AML)。
[0250]實驗設計
[0251]將如實 施例1和2所述地製備的納米顆粒G3和G3-DT與活性組分QHC形式在癌細胞殺死效果方面進行比較。將樣品從100 μ g/ml開始，5倍連續稀釋6次，與HL-60AML細胞一起孵育3天。然後，對細胞染色，並通過FMCA法讀取。
[0252]結果
[0253]G3 (IC50=3.144 μ g/ml)和 G3-DT (IC50=3.12 μ g/ml)比 QHC (IC50=8.473 μ g/ml)更有效地抑制了 AML細胞的生長(圖6)。
[0254]結論和討論
[0255]實質上，與非顆粒形式的QHC相比，G3具有更強的癌細胞殺死效果。與沒有DT的QHC或G3相比，將DT合併到G3顆粒上形成G3-DT增強了癌細胞殺死效果。單獨的DT沒有癌細胞殺死效果(未顯示)。所述非顆粒形式的QHC導致了局部反應，所述局部反應通過顆粒形式而被消除了。G3-DT在殺死AML癌細胞方面的添加的效果也涉及有益的劑量減少。
[0256]實施例7
[0257]阿糖孢苷(Cytarabine)是市售的用於治療急性髓細胞性白血病(AML)的細胞生長抑制藥物。設立本實施例來探索G3增強阿糖孢苷的癌細胞殺死效果的能力。
[0258]實驗設計
[0259]如圖7所示，將HL-60AML細胞分別暴露在預先決定的濃度的G3和阿糖胞苷中3天，以及將HL-60AML細胞暴露在G3和阿糖胞苷兩者的組合中3天。然後，對細胞染色，並通過FMCA法對於癌細胞殺死效果進行讀取。
[0260]結果
[0261]孵育3天後，單獨的G3或者阿糖胞苷分別殺死少於5%和少於55%的細胞。當它們結合起來，則殺死率顯著提高(p〈0.01)至約75% (圖7)。
[0262]結論和討論[0263]G3顆粒顯著增強阿糖胞苷對於HL-60AML細胞的殺死效果。用細胞生長抑制藥物阿糖胞苷來治療會導致病人不舒服的副作用。由於G3顆粒實質上是無毒的，G3和阿糖胞苷的聯合治療還有增加效力和通過降低阿糖胞苷的劑量來降低副作用的前景。
[0264]實施例8
[0265]本實施例證明了 G3對於市售的細胞生長抑制癌症藥物道諾黴素在非實體瘤人類急性髓細胞性白血病(AML)細胞方面具有增加的癌細胞殺死效果。
[0266]實驗設計
[0267]將HL-60AML細胞暴露於固定濃度(I μ M)的G3和從1000nM開始的增加濃度的道諾黴素中，並孵育3天。然後將細胞染色，並通過FMCA法讀取。
[0268]結果
[0269]與單獨的道諾黴素相比，G3顯著增強(Ρ〈0.0001) 了道諾黴素的癌細胞殺死效果(圖 8)。
[0270]結論和討論
[0271]G3顆粒協同增強了道諾黴素對於HL-60AML細胞的殺死效果。由於G3顆粒實質上是無毒的，可能細胞生長抑制藥物道諾黴素的劑量在與G3的聯合治療中顯著降低會暗示更好的治療效果，並且由於副作用降低，治療對於對道諾黴素敏感的病人的治療可以持續更長的時間。
[0272]實施例9
[0273]本實施例設計用 來比較G3和加上DT的G3 (G3DT)對於實體瘤的效果，所述實體瘤由人類前列腺癌細胞PC-3舉例說明。
[0274]實驗設計
[0275]將G3和G3DT與非顆粒形式的QHC比較。將樣品從100 μ g/ml的濃度開始進行5倍連續稀釋6次，並與PC-3前列腺癌細胞一起孵育3天。然後，將細胞染色，並通過FMCA法讀取。
[0276]結果
[0277]G3 顆粒(IC5Q=2.75μg/ml)和合併的 G3-DT (IC50=L 662 μ g/ml)比單獨的活性組分QHC (IC50=3.388 μ g/ml)更強烈地抑制了前列腺癌細胞的生長(圖9)。
[0278]結論和討論
[0279]本質上，本實施例的G3與QHC具有相似的對PC-3前列腺癌細胞的殺死效果。通過將DT合併到顆粒上，即G3-DT，G3的癌細胞殺死效果與對AML細胞的癌細胞殺死效果一樣被增強了。已知單獨的DT並沒有癌細胞殺死效果。其在此增加的殺死PC-3癌細胞的效果暗示了 G3效果的增強，還有副作用(如果有)的減少。應注意，非顆粒形式的QHC在體外相對有效，但在體內QHC保留在注射位點，導致低的生物利用度和局部的副作用。
[0280]實施例10
[0281]本實施例證明了 G3和市售藥物多西他賽針對實體瘤的聯合效果，所述實體瘤由PC-3前列腺癌細胞來舉例說明。
[0282]實驗設計
[0283]如圖所示，將PC-3細胞暴露於預定濃度的單獨的G3和多西他賽以及這兩者的結合中3天。然後，將細胞染色，並通過FMCA法讀取。[0284]結果
[0285]單獨的G3或多西他賽的癌細胞殺死效果分別為稍多於35%的細胞和稍多於2%的細胞。當這兩種藥物合起來使用時，殺死率顯著提高(p〈0.01)至約75% (圖10)。
[0286]結論與討論
[0287]G3顆粒顯著增強細胞生長抑制劑多西他賽對於前列腺PC-3癌細胞的癌細胞殺死效果，考慮到G3顆粒實質上是無毒的，這就暗示了增加了效力，並且降低了細胞生長抑制藥的劑量(伴隨著降低的副作用)。
[0288]實施例11
[0289]本實施例設計用來探索G3和一種新近的和被專利覆蓋的細胞生長抑制市售藥物卡巴他賽對於實體瘤人類前列腺癌PC-3細胞的聯合效果。
[0290]實驗設計
[0291]將PC-3前列腺癌細胞暴露於結合有從100 μ M開始的增加濃度的卡巴他賽的固定濃度(I μ Μ)的G3，孵育3天。然後將細胞染色並通過FMCA法讀取。
[0292]結果
[0293]單獨的卡巴他賽殺死PC-3癌細胞，G3以IC5(I=25.54 μ M殺死PC-3癌細胞。合併有G3的卡巴他賽的癌細胞殺死效果(IC50=0.00023 μ Μ)顯著(Ρ〈0001)增強(圖11 )。
[0294]結論和討論
[0295]G3顆粒顯著地且協同地增強卡巴他賽對於PC-3前列腺癌細胞的殺死效果，考慮到G3顆粒實質上是無毒的這一事實，這暗示著效`力更好、副作用減少以及延長的治療的前
旦
-5^ O
[0296]實施例12
[0297]本實施例設計用來探索配以另一種重要的皂樹皂苷部分QHA的G3顆粒的殺死實體瘤的能力，在此所述實體瘤用ACHN腎癌細胞系來舉例說明，因為其在之前已觀察到，配以該部分的Duecom顆粒比配以部分C (QHC)的Duecom顆粒的殺死能力更強。
[0298]實驗設計
[0299]將用QHA和QHC製備的G3從100 μ g/ml開始5倍稀釋6次，直到0.032 μ g/ml，並與ACHN腎癌細胞一起在37°C下孵育3天。通過FMCA法測定細胞存活率。
[0300]結果
[0301]用QHA製備的G3比用QHC製備的G3殺死顯著(P〈0.0 I)更多的ACHN腎癌細胞(圖12)。
[0302]結論和討論
[0303]該結果實質上與對QHA和QHC製備的Duecom顆粒的之前的觀察結果相同，即有QHC的製劑選擇性殺死更多非實體瘤細胞，但有QHA的製劑優選比殺死非實體瘤殺死更多實體瘤。G3製劑的該腫瘤類型特異性殺死性質可利用於Duecom顆粒，以避免殺死另一種類的正常細胞。
[0304]第三部分G3作為佐藥
[0305]實施例13
[0306]G3顆粒作為佐藥來抗整個病毒的動物實驗
[0307]G3相比於ISCOM的佐藥效果在C57BL/6小鼠上的動物實驗中檢測。在本實驗中，使用分解且失活的流感病毒作為模式抗原。
[0308]實驗設計
[0309]每組6隻小鼠，隔4周免疫接種2次，在第一次免疫接種3周後以及第二次免疫接種4周後取血樣(見上下頁的【專利附圖】

【附圖說明】)。解剖時(即第二次免疫4周後)，如《材料和方法》中所述地分析脾臟細胞的細胞因子產生。為了便於理解，動物的分組在圖13A中顯示。
[0310]結果
[0311]?在第一次免疫接種之後，G3和ISCOM以依賴劑量的方式，誘導了可檢測水平的HI抗體。在第二次免疫接種之後，對於含G3佐藥的製劑，HI抗體水平也以依賴劑量的方式顯著增多(清楚的增加效應)。ISCOM、G3和帶有DT的G3佐藥的製劑比不含佐藥的市售疫苗顯著地誘導更高水平的HI抗體，即在用G3和ISCOM製劑在兩個時間點(在第一次免疫接種之後(圖13A)和第二次免疫接種之後(圖13B))免疫接種過的動物之間記載了相似或更高水平的HI反應。
[0312].在用G3和ISCOM製劑免疫接種的動物之間用裂解病毒體外重新刺激之後，在解剖時(第二次免疫接種4周之後)在脾臟細胞中檢測到相似或更高水平的IFN- Y和IL-4反應(圖13C)。
[0313]結論
[0314]由G3和ISCOM製劑誘導的抗體介導的免疫和細胞介導的免疫兩者從質量上和質量上是相同的，即G3製劑、G3和G3DT可以取代ISCOM作為佐藥。
[0315]第四部分G3作為藥物傳送系統
[0316]實施例1 4
[0317]認為VLX40是一種有良好的癌症治療前景的藥物。因為VLX40不能製備成適於施用給臨床前試驗的動物而由此不能用於後續病人中的試驗，所以停止了市場研究。這是因為VLX40不能變得可溶於水，而可溶於水對於被身體吸收是必要的。本實驗設計用來探究G3技術是否可以解決這個問題並使得VLX40可溶於水。
[0318]實驗設計
[0319].首先將VLX40溶解於有機溶劑DMSO中，以產生濃度為20mM (5.8664mg/ml，所推薦的最高濃度)的溶液，並命名為儲備溶液。
[0320]?使用濃度為100 μ g/ml的VLX40作為水中VLX40的對照，即作為實質上不溶於水的製劑。
[0321]?將8.5 μ I的VLX40儲備溶液與50 μ I氯仿在包括500 μ I水的微量離心管中混合，以形成人造脂膜(見實施例1)。在第二步中，加入10μ I的Quil A (水中100mg/ml作為儲備溶液)，在37°C下過夜孵育。這是G3-VLX40製劑，本質上以與如實施例1所述相同的方式形成。
[0322]收集VLX40-DMS0對照(2)和G3-VLX40懸浮液/溶液(3)，並在與上述相同的濃度進行連續稀釋之後在U937-GTB細胞上測試，從回歸曲線計算IC50。
[0323]結果
[0324]加入水中的儲備溶液(I)導致可見的沉積物或沉澱物，即如從之前的實驗所預測的。因此，VLX40不溶於來自對照管(2)的水。G3-VLX40顆粒(3)的製劑通過澄清溶液/懸浮液的電子顯微鏡觀測結果得到確認。從包括G3-VLX40製劑的管中不存在沉澱或僅有非常少的沉澱。
[0325]將多種製劑測量功能，即用於U937細胞的癌細胞殺死效果的生物實驗(見《材料和方法》)。VLX40/DMS0 (2)的水相具有低的抗癌效果(以IC50表達)，意味著僅僅很少部分的VLX40/DMS0混合物溶解於水(圖14A)。
[0326]相反，G3VLX-40顆粒製劑(3)的水相具有高的抗癌活性，如圖14A所示。
[0327]也在體外檢測沉澱的不溶解部分的殺死癌細胞效果。用在水不溶性沉澱中的VLX40/DMS0 (2)記載了高的癌細胞殺死效果，G3-VLX40製劑的少量的水不溶性沉澱具有低的癌細胞殺死效果(圖14B)。
[0328]這些實驗重複了 3次。
[0329]結論和討論
[0330]將約50-100微克的VLX40與作為皂樹組分的2mg的G3溶解於Iml體積水。應注意，G3顆粒的濃度可通過G3顆粒的濃度的增加而增加，例如10mg/ml的G3製劑可為澄清溶液。我們還可以改變G3顆粒的組成來促進更大量VLX40的併入。本實施例清楚地證明了G3顆粒滿足了促進用於臨床應用的藥物的製備的未解決的需求，所述用於臨床應用的藥物製劑沒有G3技術就不能抵達病人，因為所述藥物用現有技術無法變得可溶於水。
[0331]實施例15
[0332]本實施例證明了 G3顆粒作為藥物運送體系，可以輕易地結合另外兩種不溶於水的抗癌藥物白消安(busulfan)和roscovitine,使得其變得可溶於水。
[0333]實驗設計
`[0334]使用於實施例1中步驟I所述的方法，將2 μ I白消安(50mg/ml在DMSO中)或者I μ I roscovitine (100mg/ml在氯仿中)與2 μ I膽固醇(100mg/ml在氯仿中)一起用於形成分別帶有白消安或者roscovitine的脂膜。然後，如實施例1中步驟2地加入10 μ IQHC(100mg/ml在水中)，以得到QHC:膽固醇:白消安/roscovitine的摩爾比為1: 1:0.5。
[0335]結果
[0336]對於兩種化合物，即白消安和roscovitine，看到澄清的溶液，即通過將它們加入水溶性G3顆粒來消除了由不溶性藥物導致的水相中的沉澱或者霧狀。
[0337]討論
[0338]與實施例13類似，本實施例再一次顯示了 G3作為一般平臺通過將其加入G3顆粒來使水不溶性親脂藥物/分子變成水溶性的能力。考慮到約40%的抗癌藥物候選者是不溶於水的，因此，不能進一步研發成市售產品，我們的發明能夠極大地改善這種情況。
[0339]實施例16
[0340]在本實施例中，我們探究了親脂維生素(即維生素D3)能否整合入G3納米顆粒中，以使得它變成水溶性的。如實施例1所述，將它溶於氯仿，並加到G3顆粒上，更多細節請參見《材料和方法》。
[0341]實驗設計
[0342]使用50%的膽固醇和50%的維生素D3來形成G3顆粒，以形成所述脂膜。將QuilA加入水相以形成G3顆粒(更多細節請參考實施例1)。將水中100%的膽固醇和100%的維生素D3用作對照。在烏普薩拉大學醫院實驗室在DiaSorin Liaison automatic instrument儀器上分析在G3顆粒中結合有維生素D3的樣品。[0343]結果
[0344]在步驟2回收的水相是澄清的溶液，不能檢測到沉澱。基於未分離的皂樹(950nmol/L)在G3-維生素D3製劑中檢測到比在皂樹QHC部分製劑(即55nmol/L)更多的維生素D3。在稀釋實驗中，維生素D3的濃度在讀取中是線性的，顯示了存在顆粒的均質懸浮液，即沒有與如圖1所示的其他G3顆粒一致的聚集。作為對比，在維生素D3對照中僅檢測到痕量的維生素D3，在膽固醇對照中不存在維生素D3。
[0345]結論和討論
[0346]維生素D3是必需維生素，其以脂質形式通過口服或腸胃外途徑很難被身體吸收。因此，水溶性形式將促進它通過這些方式吸收。我們在本實驗中顯示了維生素結合到含皂樹皂苷的未分離的以及QHC部分的納米顆粒。重要的是，稀釋實驗的線性讀數顯示了顆粒的均質分散，其通過對G3顆粒的一般電子顯微鏡觀察所揭示(見圖1)。未分離的皂樹皂苷在食物中被廣泛接受並使用，例如，在包括啤酒的飲料還有其他形式的食品中。因此，用來輸送該維生素的G3的製劑的更加便宜的替代物是用未分離的皂樹作為G3製劑的基底。在本實驗中，比含QHC皂苷部分的G3顆粒更多的D3被結合到含未分離的皂樹皂苷的G3中去。
[0347]參考文獻
[0348]1Kefei Hu, Saideh Berenjian, Rolf Larsson, Joachim Gullbo, PeterNygren, Tanja Lovgrcn, Bror Morein.Nanoparticulate Quillaja saponin inducesapoptosis in human leukemia cell lines with a high therapeutic index.1nternational Journal of Nanomedicine，January2010Volume2010:5Pages51 - 62
[0349]2 LSvgren &Morein (2000) ISCOM Technology in Methods in MolecularMedicine,Vo142:239—258，Vaccine adjuvants:Preparation Methods and ResearchProtocols, Edited byD.T.0Or Hagen, Humana Press, Inc.，Titawaj N.J.[0350]3Morein B，Hu Kj Lovgren K and D』Ho ndt E.New ISCOMs meet unsettled vaccinedemands in Vaccine Adjuvants and Delivery Systems, Ed.by Singh M.A John Wiley &Sons，Inc.，Publication, Hoboken, New Jersey.2007，pl91-222.[0351]4Lyckej N.From toxin to adjuvant:The rational design of a vaccineadjuvant vector,CTA1-DD/ISC0M.Cell Microbiol2004，6(I)，23-32，and by Mowat etal.(2001)
[0352]5Mowatj A.M.，Donachiej A.M.，Jagewalllj S.，Schonj K.，Lowenadlerj B.，Dalsgaard，K.，et al.CTA1-DD-1mmune stimulating complex:a novel, rationally designedcombined mucosal vaccine adjuvant effective with nanogram doses of antigen.J.1mmunol2001, 167(6)，3398-3405
[0353]6Blair AHj Ghose T1.Linkage of cytotoxic agents to immunoglobulins.J_Immunol Methods.1983Apr29;59(2):129-43.[0354]7Ghose TL Blair AH，Kulkarni PN.Preparation of antibody-linked cytotoxicagents.Methods Enzymo1.1983;93:280-333.[0355]8Davis MT，Preston.1F.A simple modified carbodiimide method forconjugation of sma11-molecular~weight compounds to immunoglobulin G withminimal protein crosslinking.Anal Biochem.198ISep15;116(2):402-7.[0356]9Eliasson DG，ElBakkouri K, Schon K，Ramne A，Fest iens E, LdwenadlerB, FiersI Saelens X，Lycke N.CTAl-M2e~DD:anovel mucosal adjuvant targeted influenzavaccine.Vaccine.2008Feb26;26(9):1243-52.Epub2008Janl0.[0357]10A.Esmat Abou-Arabj Azza Abou-Arab and M.FerialAbu-SalemjPhysico-chmical assessment of natural sweeteners steviosidesproduced from Stevia rebaudiana bertoni, African Journal of Food Science,Vol4 (5)pp269_281，May2010.[0358]11Chaiwat Boonkaewwantj Chaivat Toskulkaoj and Molvibha Vongsakul.Ant1-1nflammatory and Immunomodulatory Activities of Stevioside and ItsMetabolite Steviol on THP-1Cellsj J.Agric.Food Chem.2006，54，7857897)
[0359]13Kerstenj G.F.A.，Spiekstraj A.，Beuveryj E.C.and Cromelin D.J.A.(1991)On the structu re of immune-stimulating saponin lipid complexes (ISCOMs).BBA1062，165-171.
【權利要求】
1.納米顆粒，所述納米顆粒包括留醇和選自於皂樹酸和皂樹皂苷的來自石鹼木的組分，所述留醇優選為膽固醇，其特徵在於，所述納米顆粒不包括磷脂。
2.根據權利要求1所述的納米顆粒，其直徑在10-40納米的範圍內，優選在12-35納米或者15-25納米的範圍內。
3.根據權利要求1或2所述的納米顆粒，其中，所述皂樹組分為皂樹皂苷，優選為皂樹皂苷QHA部分、QHB部分和/或QHC部分。
4.根據權利要求1至3中任意一項所述的納米顆粒，其中，膽固醇和皂樹皂苷的比例為從1:10至10:1，優選從1:2至2:1。
5.根據權利要求1至4中任意一項所述的納米顆粒，其進一步包括至少一種兩親分子或者疏水分子。
6.根據權利要求5所述的納米顆粒，其中，兩親分子或者疏水分子是選自於抗原、佐藥、靶標分子、藥組合物和食物相關化合物中的至少一種。
7.組合物，其包括一種或多種根據權利要求1至6中任意一項所述的納米顆粒。
8.根據權利要求7所述的組合物，其中，每種不同皂樹皂苷部分都結合入不同的納米顆粒。
9.根據權利要求1至6中任意一項所述的納米顆粒或者根據權利要求7或8所述的組合物用作藥物，並任選地用在藥組合物中，所述藥組合物進一步包括藥學上可接受的緩衝液、稀釋賦形劑、佐藥和/或載體。
10.根據 權利要求9所述的藥組合物，其進一步包括至少一種藥學活性化合物，例如抗癌藥物Komplettering Saideh、鉬配位化合物、紫杉燒化合物、喜樹鹼化合物、抗腫瘤長春花生物鹼、抗腫瘤長春花生物鹼、抗腫瘤核苷衍生物、氮芥或者亞硝基脲烷化劑、抗腫瘤蒽環黴素衍生物、赫賽汀和抗腫瘤足葉草毒素衍生物、抗代謝物、類固醇、哺乳動物雷帕黴素靶點、治療癌症的藥物，例如選自於由下列各項組成的組中的藥物:阿糖孢苷、道諾黴素、紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、Toricsel和他比特定，其活性化合物可整合入納米顆粒，或者與組合物混合，石鹼木及其子片段、用於抗體或者單克隆抗體的受體，例如Fe受體，或者金黃色葡萄球菌的蛋白質A的DD。
11.根據權利要求9所述的藥組合物，其用作佐藥。
12.根據權利要求11所述的藥物佐藥製劑，其與在研發過程中的疫苗聯合使用。
13.根據權利要求11所述的藥物佐藥製劑，其與季節性流感病毒疫苗聯合使用。
14.根據權利要求11-13中任意一項所述的藥物佐藥製劑，其與大流行性流感疫苗聯合使用。
15.根據權利要求11-14中任意一項所述的藥物佐藥製劑，其與緊急疫苗聯合使用，所述緊急疫苗例如為抗生物武器的疫苗。
16.藥物疫苗製劑，其包括根據權利要求11-15中任意一項所述的佐藥。
17.用來治療或預防由生物體導致或惡化的疾病的方法，其包括向主體施用根據權利要求16所述的藥物疫苗製劑。
18.一種治療癌症的方法，其包括向需要其的病人施用藥學活性劑量的根據權利要求1至6中任意一項所述的納米顆粒或者根據權利要求7至10中任意一項所述的組合物。
19.根據權利要求18所述的治療癌症的方法，其中，所述癌症的白血病。
20.一種用來生產不含磷脂的納米顆粒的方法，其包括以下步驟: a)提供疏水表面或脂質體的懸浮物； b)將疏水表面或脂質體的懸浮物與留醇溶液接觸，優選為作為單體溶解於有機溶劑或者清潔劑中的膽固醇； c)去除溶劑或清潔劑，在表面形成留醇膜； d)提供皂樹皂苷膠束的水溶液； e)加入包括皂苷膠束的水溶液到留醇膜，通過它們在皂苷和留醇之間形成複合物，並懸浮於水溶液中。
21.根據權利要求20所述的方法，其中，有機溶劑是乙醇和/或氯仿。
22.根據權利要求20或21中任意一項所述的方法，其中，有機溶劑或清潔劑通過揮發來去除。
23.根據權利要求20或21中任意一項所述的方法，其中，所述有機溶劑或清潔劑通過透析、柱色譜法、過濾或者切向流來去除。
24.根據權利要求19至22中任意一項所述的方法，其中，所述皂樹皂苷是皂樹皂苷QHC部分。
25.根據權利要求19至24中任意一項所述的方法，其中，膽固醇和皂樹皂苷之間的比例是從1:10至10:1，優選為從1:2至2:1。
26.一種用於生產根據權利要求20至25中任意一項所述的免疫刺激複合物基質的方法，其中，將至少 一種磷脂加入包括權利要求20中步驟b)中的留醇的懸浮液中。
27.用於評估根據權利要求17或18所述的方法用於個體病人的適用性的方法，其包括 ?將來自所述病人的癌細胞與根據權利要求1至7中任意一項所述的納米顆粒或者根據權利要求8或9所述的藥組合物體外接觸； ?測量所述納米顆粒或藥組合物對所述癌細胞的治療效果的至少一種效果指標； 其中，如果納米顆粒或者藥組合物對所述癌細胞顯示治療效果的顯著效果指標，則將根據權利要求10或11所述的方法評估為可適用於所述個體病人。
28.根據權利要求27所述的方法，其中，治療效果的效果指標為周期素依賴性蛋白激酶的下調或者胸苷激酶的下調，包括分化標記的上調。
【文檔編號】A61K36/00GK103857403SQ201280048961
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年10月1日 優先權日:2011年10月3日
【發明者】布爾·莫雷恩, 塞德·拜瑞堅, 卡非·胡 申請人:莫雷因科斯股份公司