一種用於治療乳腺癌的藥物及其製備方法

2023-05-26 13:19:06 1

專利名稱：一種用於治療乳腺癌的藥物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗腫瘤藥物及其製備方法，尤其是一種用於治療乳腺癌的藥物及其製備方法。
背景技術：
·乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤。2011年美國CA:A Cancer Journal forClinicians雜誌(2010年影響因子94. 262)公布的最新統計數據顯示，美國2011年預計將有230480例女性罹患乳腺癌，佔女性新發惡性腫瘤的30%，排名女性惡性腫瘤發病率第一位。在我國北京、上海、天津等大城市的統計顯示乳腺癌同樣是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發病率呈逐年上升趨勢。現有的乳腺癌治療過程中對患者免疫系統的損害極大，導致腫瘤治療過程中遇到無法突破的瓶頸，腫瘤無法完全治癒。現階段細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK)是具有細胞毒作用的免疫活性細胞；樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是最具潛力的抗原提呈細胞，在初始性免疫和獲得性免疫中具有重要作用。因此將CIK聯合DC進行耐藥乳腺癌的聯合治療具有非常重要的臨床應用價值。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種用於治療乳腺癌的藥物。本發明所要解決的另一技術問題在於提供上述用於治療乳腺癌的藥物的製備方法。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是一種用於治療乳腺癌的藥物，為抗原衝擊的DC與CIK的共培養物(簡稱AP-DC+CIK的組合方式)，其中，所述抗原為凍融抗原，是由下述方法得到的收集對數生長期的MCF-7/ADR細胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，製成濃度為I X 107/mL的細胞懸液，加入100 u L生理鹽水中，放入液氣中，5min後,迅速放入37 C水浴中，待其完全融化後，再次放入液氣中，反覆3次，微孔濾膜過濾，收集濾液，4°C保存備用；所述抗原衝擊的DC是由下述方法得到的收集健康人外周血細胞，通過淋巴細胞分離液體分離獲得單個核細胞，置於含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養基中，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養2h後，收集黏附細胞，加培養液調細胞濃度為I X IOVmL,接種於24孔培養板，加入終濃度為1000U/mL的rhGM_CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養，48h進行半量換液並加入首次濃度1/2量的上述細胞因子，在培養到第5天時，部分DC和上述凍融抗原按原細胞數I : 5進行凍融抗原衝擊，於第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續培養至第8天；所述CIK是由下述方法得到的收集單個核細胞中的非黏附細胞，並用R/MINI-1640完全培養基調細胞數為3 X 107mL，接種於24孔平底培養板，當天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h後，加入抗CD3單抗50 u g/L及300U/mL的rhIL_2，以後每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養液全量換液，培養到第7天。優選的，上述用於治療乳腺癌的藥物，所述DC與CIK細胞的體積比為I : 10。上述用於治療乳腺癌的藥物的製備方法，將抗原衝擊的DC與CIK進行共培養，具體步驟為(I)製備抗原收集對數生長期的MCF-7/ADR細胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，製成濃度為IXlOVmL的細胞懸液，加入IOOii L生理鹽水中，放入液氮中，5min後，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化後，再次放入液氮中，反覆3次，微孔濾膜過濾，收集濾液，4°C保存備用，得到凍融抗原；
(2)製備抗原衝擊的DC :收集健康人外周血細胞，通過淋巴細胞分離液體分離獲得單個核細胞，置於含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養基中，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養2h後，收集黏附細胞，加培養液調細胞濃度為I X 106/mL,接種於24孔培養板，加入終濃度為1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL-4，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養，48h進行半量換液並加入首次濃度1/2量的上述細胞因子，在培養到第5天時，部分DC和上述凍融抗原按原細胞數I : 5進行凍融抗原衝擊，於第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續培養至第8天；(3)所述CIK是由下述方法得到的收集單個核細胞中的非黏附細胞，並用R/MINI-1640完全培養基調細胞數為3 X 107mL，接種於24孔平底培養板，當天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h後，加入抗CD3單抗50 u g/L及300U/mL的rhIL_2，以後每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養液全量換液，培養到第7天；(4)將上述CIK細胞與上述抗原衝擊的DC繼續共培養。優選的，上述用於治療乳腺癌的藥物的製備方法，所述步驟(4)中DC與CIK細胞按照體積比I : 10的比例共培養15天。本發明的有益效果是上述用於治療乳腺癌的藥物，其中CIK細胞是來源於T淋巴細胞的具有免疫活性的異質細胞群，具有較強的抗腫瘤毒性，可以殺傷對化療耐藥的腫瘤細胞，是治療多藥耐藥腫瘤的最具潛力的方法，DC細胞是最具潛力的抗原提呈細胞，可以識別、加工、提呈抗原給T細胞，是激發特異性免疫應答的中心和抗腫瘤免疫的重要載體，AP-DC+CIK的組合方式對於抑制腫瘤的生長、延長患者生存時間的效果突出；所述製備方法簡單，適合規模化工業生產的需要。


圖I是各組腫瘤標本RT-PCR檢測MDRl和P -actin結果，其中I :AP_DC+CIK治療組，2 DC+CIK治療組，3 :CIK單獨治療組，4 :生理鹽水對照組；圖2是TUNEL染色檢測示腫瘤細胞凋亡(TUNEL X 400)； 圖3是各組荷瘤標本BCL-2染色結果(免疫組化X 200 );圖4是各組荷瘤標本Bax免疫組化染色結果(免疫組化X 400)。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明所述技術方案作進一步的說明。
下述實施例中所用材料包括SPF級SCID裸鼠，5飛周齡，購自北京軍事醫學科學院動物研究所；R/MINI_1640粉劑(美國Hyclone公司)、新生牛血清(HycloneLaboratories Inc),淋巴細胞分離液(Sig_ma)、重組人巨卩遼細胞集落刺激因子(rhGM-CSF )、重組人白細胞介素(rh IL ) -4、重組人腫瘤壞死因子(rhTNF ) - a、rh IL-2、(Bioscience公司)、抗人⑶3單抗(北京思科達生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒、一步法 RT-PCR 試劑盒(QIAGEN 公司)，MDRl 引物上遊 5』 -CCCATCAITGCAATAGCAGG-3』，下遊 5』-TGITCAAACTTCTGCTCCTGA-3』，總長 158bp ; P-actin 內參引物上遊5』 -GCCAACACAGTGCTGTCTGG-3』，下遊 5』 -GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3 』，總長 12 Ibp ;瓊脂糖凝膠(上海生工公司)，TUNEL試劑盒(羅氏公司)，抗人BAX單抗(北京中杉)，抗人BCL-2單抗、免疫組化二抗試劑盒(基因科技公司)。實施例I( I)靶細胞及細胞凍融抗原的製備 MCF-7/ADR細胞購自中國醫學科學院血液病醫院，收集對數生長期的MCF-7/ADR細胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，製成濃度為I X 107/mL的細胞懸液，加入100 u L生理鹽水中，放入液氮中，5min後，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化後，再次放入液氮中，反覆3次，微孔濾膜過濾，收集濾液，4°C保存備用；(2) DC體外誘導培養收集健康人外周血細胞，通過淋巴細胞分離液體分離獲得單個核細胞，置於含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養基中，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養2h後，收集黏附細胞，加培養液調細胞濃度為I X 106/mL,接種於24孔培養板(ImL/孔)，加入終濃度為1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養，48h進行半量換液並加入首次濃度1/2量的上述細胞因子，在培養到第5天時，部分DC和上述凍融抗原按原細胞數I : 5進行凍融抗原衝擊，與未衝擊的DC共同於第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續培養至第8天。(3)CIK細胞的分離及培養收集單個核細胞中的非黏附細胞，並用R/MINI-1640完全培養基調細胞數為3X 106/mL，接種於24孔平底培養板(ImL/孔)，當天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h後，加入抗CD3單抗50 u g/L及300U/mL的rhIL-2,以後每3d以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養液全量換液；培養到第7天，將CIK細胞分為3組繼續培養，分別是抗原衝擊的DC與CIK共培養組(AP-DC+CIK組)、DC與CIK共培養組(DC+CIK組)和CIK單獨培養組(CIK組)，其中DC與CIK細胞按照體積比I : 10的比例進行共培養15天。實施例2I、建立荷瘤裸鼠模型收集對數生長期的MCF-7/ADR細胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，製成濃度為IXlOVmL的細胞懸液，按每隻裸鼠接種ImL細胞懸液，在每隻裸鼠右側腋下進行接種，腫瘤體積生長到直徑為0. 5cm為成瘤。2、分組第一組抗原衝擊的DC與CIK共培養組(AP-DC+CIK組)；第二組DC與CIK共培養組(DC+CIK組)；
第三組CIK單獨培養組(CIK組)；第四組生理鹽水(空白組)。3、實驗裸鼠模型治療分組以接種MCF-7/ADR的SCID裸鼠腫瘤體積生長到直徑為0. 5cm為成瘤，將荷瘤裸鼠隨機分到4組中，分別注射AP-DC+CIK、DC+CIK、CIK和生理鹽水，從注射開始每7天測量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b) I次，腫瘤體積=0. 5 XaXb2，觀察腫瘤生長的情況；注射治療35天後 ，處死荷瘤裸鼠，取出瘤體，部分瘤體標本中性甲醛液固定、石蠟包埋，留作免疫組化用，其餘標本稱質量，留做逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。( I ) RT-PCR測定MDRl基因表達情況標本稱質量後，按不同治療組順序，取同質量瘤體，研碎，並按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，提取物定量檢測。然後按照一步法RT-PCR試劑盒步驟，配加25 u L反應體系，包括總RNA 0. 5 u g, 5 X Buffer 5 u L, dNTPMix I u L,上下遊引物各I u L, Enzyme Mix I u L, Rnase-free水補齊至25 u L。反應條件為5(TC 30min, 95°C 15min, 94°C 45s,58°C 45s,72°C Imin 35 個循環，72°C 10min，4°C。將PCR產物置I. 5%瓊脂糖中電泳，溴化乙錠染色，每次上樣量均為6 ii L，包括Marker，目的基因MDRl及內參照P-actin，置紫外燈下觀察電泳結果並照片。(II) TUNEL試劑盒檢測凋亡(I)石蠟包埋的切片的預處理常規脫蠟脫水，用蛋白酶K工作液(20mg/L溶於IOmmoI/L Tris/HCl 中，pH 7. 4 8. 0)室溫孵育 15 30min，PBS 洗 2 次；(2)標記PBS衝洗2次，擦乾樣品周圍的水，滴加50 ii L的TUNEL反應混合溶液，在溼盒中37°C孵育60min (為防止蒸發和保證TUNEL反應混合物均勻分布，可以在孵育過程中加蓋蓋玻片)，PBS衝洗3次，至此樣品可在螢光鏡下分析結果；(3)信號轉化和分析擦乾樣品周圍的水分，加入50 ii L轉化劑-P0D，在溼盒中37°C孵育30min，為防止蒸發和保證轉化劑-POD均勻分布，可以在孵育過程中加蓋蓋玻片；PBS衝洗3次，加入5(Tl00 u L DAB底物溶液，室溫孵育lOmin，PBS衝洗3次；復染、封片，在光鏡下分析結果；同時設立陰性對照組；光鏡下觀察結果，陽性細胞(即凋亡細胞)的胞核為棕黃色或棕褐色均勻或顆粒狀染色。觀察凋亡細胞的數量和分布，以20 X 10倍顯微鏡計數一個視野內的凋亡細胞數，隨機計數5個高倍(X400)視野，求出平均每個高倍視野內凋亡細胞的凋亡指數(apoptotic index，Al)，Al=凋亡細胞數/觀察細胞總數；以凋亡指數計，〈O. I為陰性(_) ；0. I 0. 2為弱陽性(+ ) ；0. 2 0. 3為中等陽性(++) ；>0. 3為強陽性(+++)。(III)免疫組化檢測Bcl-2和Bax表達(I)石蠟切片脫蠟、水化室溫放置60min，後置於二甲苯浸泡20min，無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇序貫脫水，各5min，後PBS衝洗3次；
(2)抗原修復用3%H202室溫封閉lOmin，後將切片放入92°C 98°C的0. 01mol/L枸櫞酸鈉緩衝液2次，後PBS衝洗3次；(3)血清封閉用與二抗同種屬動物血清封閉30min後取出；
(4)抗原抗體反應、染色按照免疫組化試劑盒步驟，先後加入一抗，4°C過夜，PBS衝洗3次，加二抗，室溫20min，PBS衝洗3次，加DBA顯色液，室溫5min，PBS衝洗3次。(5)蘇木素復染、酸乙醇分化、氨水反藍、衝洗切片、脫水、透明、封片，光鏡下分析結果，同時設立陰性對照組。4、統計學處理採用SPSS 10. 0軟體，計量資料數據以均數土標準差(x土s)表示，多組間均數比較進行方差分析，組間多重比較用Tamhane法，P〈0. 05為差異有統計學意義。
5、結果(I) RT-PCR檢測MDRl基因表達各組均有MDRl基因表達，MDRl表達由I 4逐漸增強；4組P-actin表達無明顯區別，見圖I。I 4組MDRl/0-actin比值分別為0. 14、0. 57、0. 81 及 0. 98。(2) TUNEL凋亡評價生理鹽水組、CIK組、DC+CIK組和AP-DC+CIK組平均凋亡指數分別為 0. 088±0. 008,0. 297±0. 049,0. 390±0. 035 及 0. 565±0. 065，差異有統計學意義(F=96. 931，P〈0. 001)。凋亡細胞胞核為棕黃色或棕褐色均勻或顆粒狀染色，見圖2。(3) Bcl-2與Bax蛋白表達Bcl_2蛋白定位於細胞膜或胞眾,Bax蛋白定位於細胞漿，陽性細胞為包漿出現棕黃色或棕褐色顆粒，染色強度高於背景非特異性染色者，OD值比較差異均有統計學意義(P〈0. 01)，見表1，圖3、4。Bcl-2/Bax AP-DC+CIK 組為 0. 10，DC+CIK 組為 0. 46，CIK 組為 I. 44，生理鹽水組為 6. 16。·表I各組Bcl-2和Bax積分光密度值比較(n=10，OD值，f 士s)
組別Bcl-2Bax
生理鹽水組(I)_52.54±1.57_8.53±0.30_
CIK 組(2)_37.48 ±1.07_26.05 土 0.89_
DC+CIK 組(3)_22.45±0.45_48.66±1.89_
AP-DC+CIK 組(4) 6.25 土0.22_62.62±1.46_
_F_4052.21 林_3469.39**_**P<0. 01 ;各指標間兩兩比較均P〈0. 001綜上，CIK細胞是來源於T淋巴細胞的具有免疫活性的異質細胞群，具有較強的抗腫瘤毒性，可以殺傷對化療耐藥的腫瘤細胞，是治療多藥耐藥腫瘤的最具潛力的方法；DC細胞是最具潛力的抗原提呈細胞，可以識別、加工、提呈抗原給T細胞，是激發特異性免疫應答的中心和抗腫瘤免疫的重要載體。通過上述實施例的結果顯示，AP-DC+CIK組、DC+CIK組、CIK組和生理鹽水組均有MDRl基因表達，表達量無明顯差別，AP-DC+CIK組MDRl/^-actin最低，生理鹽水組最高，提示荷瘤裸鼠模型成瘤後，各自經過CIK、DC+CIK和AP-DC+CIK治療後，MDRl基因表達均不同程度減少。在AP-DC+CIK治療後，MDRl基因減少最為明顯，其次為DC+CIK治療組，單獨CIK治療組減少的效果最弱，此現象亦表明負載乳腺癌抗原的DC激發出的CIK，其殺傷能力得到提高的同時，其逆轉MDRl基因表達的能力亦增強，提示耐藥腫瘤細胞在AP-DC+CIK組被殺傷程度強於DC+CIK組和CIK組，與腫瘤細胞在不同組別其MDRl基因逆轉程度不同有關，逆轉程度強的腫瘤細胞被CIK殺傷程度大，逆轉程度差的腫瘤細胞被殺傷程度減低。進一步的實驗發現，經脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)檢測體外細胞凋亡得出，各組比較差異有統計學意義，進一步證實治療組對荷瘤小鼠均具有促進凋亡的治療作用，其中CIK組、DC+CIK組及AP-DC+CIK組對腫瘤細胞的促凋亡能力逐漸增強。Bcl-2基因是7 (14，18)染色體易位斷點處的一種原癌基因，其轉位造成Bcl-2蛋白水平增高。Bcl-2蛋白主要表達在線粒體的外膜、細胞核膜及內質網上。Bcl-2基因是線粒體膜滲透性改變的內源性抑制物，並可阻止線粒體內Ca2+與細胞色素C向外釋放，具有抑制凋亡的作用。Bcl-2是目前發現的抗凋亡作用最強的基因之一。Bax也是Bcl-2基因家族重要成員之一，屬於抑癌基因，一般出現在胞質中，機體出現損傷和刺激時重新定位於線粒體表面並破壞Bcl-2蛋白在正常狀態下的抗凋亡功能，促進細胞凋亡，還可直接促進細胞凋亡。它表達於許多腫瘤組織中，如乳腺癌、肺癌、大腸癌、白血病等。上述CIK組、DC+CIK組及AP-DC+CIK組均能抑制Bcl_2的表達，增加Bax的表達。其中各組間Bcl-2及Bax比較差異均有統計學意義。其中在AP-DC+CIK組Bcl-2/Bax比值最低，表明其凋亡活性最強；生理鹽水組Bcl-2/Bax比值最高，表明其凋亡活性最低。因此，由於其誘導的細胞凋亡程度不同，腫瘤抗原負載的DC激活的CIK產生的殺傷作用要強於單純DC激活的CIK和單獨CIK。 上述參照實施例對該一種用於治療乳腺癌的藥物及其製備方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定範圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種用於治療乳腺癌的藥物，其特徵在於為抗原衝擊的DC與CIK的共培養物，其中， 所述抗原為凍融抗原，是由下述方法得到的收集對數生長期的MCF-7/ADR細胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，製成濃度為I X 107/mL的細胞懸液，加入100 μ L生理鹽水中，放入液氣中，5min後,迅速放入37 C水浴中，待其完全融化後，再次放入液氣中，反覆3次，微孔濾膜過濾，收集濾液，4°C保存備用； 所述抗原衝擊的DC是由下述方法得到的收集健康人外周血細胞，通過淋巴細胞分離液體分離獲得單個核細胞，置於含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養基中，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養2h後，收集黏附細胞，加培養液調細胞濃度為I X IOVmL,接種於24孔培養板，加入終濃度為1000U/mL的rhGM_CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養，48h進行半量換液並加入首次濃度1/2量的上述細胞因子，在培養到第5天時，部分DC和上述凍融抗原按原細胞數I : 5進行凍融抗原衝擊，於第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續培養至第8天； 所述CIK是由下述方法得到的收集單個核細胞中的非黏附細胞，並用R/MINI-1640完全培養基調細胞數為3 X 106/mL,接種於24孔平底培養板，當天加入1000U/mL的rhINF- Y，刺激24h後，加入抗CD3單抗50 μ g/L及300U/mL的rhIL_2，以後每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養液全量換液，培養到第7天。
2.根據權利要求I所述的用於治療乳腺癌的藥物，其特徵在於所述DC與CIK細胞的體積比為I : 10。
3.權利要求I或2所述的用於治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵在於將抗原衝擊的DC與CIK進行共培養，具體步驟為 Cl)製備抗原收集對數生長期的MCF-7/ADR細胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，製成濃度為I X IOVmL的細胞懸液，加入100 μ L生理鹽水中，放入液氮中，5min後，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化後，再次放入液氮中，反覆3次，微孔濾膜過濾，收集濾液，4°C保存備用，得到凍融抗原； (2)製備抗原衝擊的DC:收集健康人外周血細胞，通過淋巴細胞分離液體分離獲得單個核細胞，置於含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養基中，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養a後，收集黏附細胞，加培養液調細胞濃度為IX 106/mL，接種於24孔培養板，加入終濃度為1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C飽和溼度、5%C02孵箱中培養，48h進行半量換液並加入首次濃度1/2量的上述細胞因子，在培養到第5天時，部分DC和上述凍融抗原按原細胞數I : 5進行凍融抗原衝擊，於第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續培養至第8天； (3)所述CIK是由下述方法得到的收集單個核細胞中的非黏附細胞，並用R/MINI-1640完全培養基調細胞數為3 X 107mL，接種於24孔平底培養板，當天加入1000U/mL的rhINF- Y，刺激24h後，加入抗CD3單抗50 μ g/L及300U/mL的rhIL_2，以後每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養液全量換液，培養到第7天； (4)將上述CIK細胞與上述抗原衝擊的DC繼續共培養。
4.根據權利要求3所述的用於治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵在於所述步驟(4)中DC與CIK細胞按照體積比I : 10的比例共培養15天。
全文摘要
本發明提供了一種用於治療乳腺癌的藥物及其製備方法，所述藥物為抗原衝擊的DC與CIK的共培養物，通過將抗原衝擊的DC與CIK進行共培養獲得；所述用於治療乳腺癌的藥物，其中CIK細胞是來源於T淋巴細胞的具有免疫活性的異質細胞群，具有較強的抗腫瘤毒性，可以殺傷對化療耐藥的腫瘤細胞，是治療多藥耐藥腫瘤的最具潛力的方法，DC細胞是最具潛力的抗原提呈細胞，可以識別、加工、提呈抗原給T細胞，是激發特異性免疫應答的中心和抗腫瘤免疫的重要載體，AP-DC+CIK的組合方式對於抑制腫瘤的生長、延長患者生存時間的效果突出；所述製備方法簡單，適合規模化工業生產的需要。
文檔編號A61K35/14GK102949414SQ201210341248
公開日2013年3月6日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者龐華, 司玉玲, 孫雯雯 申請人:龐華, 司玉玲, 孫雯雯