循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片及其製造和使用的製作方法

2023-05-26 13:42:41 2

循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片及其製造和使用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片及其製造和使用。所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，包括玻璃基片，所述的玻璃基片上設有微流控通道，其特徵在於，所述的微流控通道包括主流道，主流道的流入端分別連接樣本管道和緩衝液管道，主流道的流出端連接流出道，主流道的側面從流入端到流出端的方向上依次連接至少兩個捕獲區域，每個捕獲區域內皆設有捕獲微結構，每個捕獲區域各連接一個鑑定釋放管道。本發明可以實現通過一次樣品進樣即完成單/多標誌物循環腫瘤分離、分類和釋放收集的功能。
【專利說明】循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片及其製造和使用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片及其製造和使用。
【背景技術】
[0002]目前全世界癌症患者約達1400萬，每年新發病人數約700萬，每年約有500萬人死於癌症，而且這一數字還將會繼續上升。在我國，估計每年新增病例約120萬，每年約有100萬人死於癌症。目前包括手術治療、化療、放療在內多種治療手段還遠遠不能達到治癒癌症目的，腫瘤聞復發、轉移及耐藥等特性，成為進一步提聞癌症患者總體生存的瓶頸。
[0003]近來研究提示循環腫瘤細胞在腫瘤轉移和復發中扮演關鍵角色。我們在前期研究中發現循環肝癌細胞的數量與肝癌切除術後早期肝內復發和肺轉移密切相關，並且那些具有幹細胞特性的循環腫瘤細胞具有很強的成瘤、抗凋亡能力。因此精確地捕獲分類這些導致癌症轉移、復發的「種子」細胞具有重大的臨床和科研意義。然而這群細胞在外周血中極其稀有，平均IO6個白細胞中只有一個循環腫瘤細胞。目前已有的循環腫瘤細胞捕獲技術如梯度密度離心技術、濾膜技術和流式細胞技術在實現循環腫瘤幹細胞的捕獲分類方面均存在一定的缺陷。梯度密度離心和濾膜技術通過循環腫瘤細胞與血細胞之間物理特性的差異(密度、大小)實現細胞的捕獲，由於這兩種基於物理特性實現捕獲的技術其靈敏度和特異性較低，無法對捕獲細胞進行分類，細胞易丟失，限制了其在循環腫瘤細胞捕獲中的應用。流式細胞術通過對待測樣品進行特定的螢光標記，然後利用複雜的光學檢測系統進行鑑定分選，該技術雖可實現不同類別腫瘤細胞的分類收集，但是設備本身成本昂貴、檢測效率低、需專人操作，同時檢測微量細胞靈敏度差，無法對細胞形態學進行觀察，也很難廣泛應用於循環腫瘤幹細胞的捕獲。因此亟需開發一款小型、廉價、操作簡單，具有高靈敏度、特異性、一次性使用的、集多標誌物捕獲和分類的循環腫瘤細胞捕獲器件。
[0004]微流控晶片技術具有`檢測高效、集成化、試劑消耗量小等諸多優點正被越來越多地應用於生物醫學領域，並已發展出多種微流控細胞捕獲技術。然而目前大多數已報導的細胞捕獲晶片仍停留在單標誌物、單種細胞的捕獲，對於多標誌物、多類別細胞捕獲仍然缺乏相應的手段。它們中的代表是Nagrath S等2007年於Nature上報導的一種單標誌物循環腫瘤細胞捕獲晶片，該晶片在流道內設置圓形的微柱陣列，經過化學修飾，在流道內壁及微柱表面結合上皮細胞黏附因子抗體，通過細胞流動中與微柱的碰撞來捕獲靶細胞。該類晶片無法實現多標誌物循環腫瘤幹細胞捕獲及分類的功能。此外這種晶片的應用還受制於捕獲的細胞很難釋放收集和前期晶片化學修飾過程複雜等缺點。為了實現多標誌物癌細胞捕獲的目的，XuY等2009年在Anal Chem上提出蛇形管道劃定不同捕獲區域，在每個捕獲區域的上下遊設置進出樣開孔，利用開孔的交替開放與封閉在不同區域固定上各自不同的核酸適體，以此來達到在同一管道中並行捕獲不同癌細胞的目的。該方法雖然可以實現多標誌物細胞的捕獲，但多次重複的流道固定使晶片製備過程時間長、步驟多，又由於在同一管道內進行流動固定，容易產生上下遊的交叉汙染，使假陽性增高，而為了控制假陽性率，必須加長各區域的長度，這對晶片的進一步集成造成了障礙。[0005]因此，為了適應臨床和科研需要，亟需開發一種新型的循環腫瘤細胞捕獲微流控晶片，這類晶片無需對其內部進行繁複的化學修飾，具備一次樣品進樣就能對完成包括多標誌物循環腫瘤細胞的捕獲、分類和釋放收集等功能，同時還具有操作簡便、集成度高的特點。

【發明內容】

[0006]本發明的主要目的在於克服現有微流控細胞捕獲晶片技術的不足，構建一種基於磁性及微捕獲結構的循環腫瘤細胞多標誌物分類捕獲的微流控晶片，其可實現將標記有不同大小/磁強免疫磁粒子的外周血或淋巴液一次注入微流控晶片內即能完成包括多標誌物循環腫瘤細胞的捕獲、分類和釋放收集等功能。
[0007]為了達到上述目的，本發明提供了一種循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，包括玻璃基片，所述的玻璃基片上設有微流控通道，其特徵在於，所述的微流控通道包括主流道，主流道的流入端分別連接樣本管道和緩衝液管道，主流道的流出端連接流出道，主流道的側面從流入端到流出端的方向上依次連接至少兩個捕獲區域，每個捕獲區域內皆設有捕獲微結構，每個捕獲區域各連接一個鑑定釋放管道。
[0008]優選地，所述的主流道的側面從流入端到流出端的方向上依次連接第一捕獲區域、第二捕獲區域和第三捕獲區域。
[0009]優選地，所述的每個捕獲區域內的捕獲微結構共有至少兩排，相鄰兩排中的捕獲微結構交錯排列，每個捕獲微結構包括對稱設置的第一側壁和第二側壁，第一側壁和第二側壁的前後兩端皆不連接。
[0010]更優選地，所述的第一側壁和第二側壁的前端之間的距離為4-7 μ m，第一側壁和第二側壁的後端之間的距離為15-25 μ m,第一側壁和第二側壁的長度為20 μ m,每排中相鄰的捕獲微結構之間的距離為25-30 μ m，相鄰兩`排捕獲微結構的距離為40-50 μ m。
[0011]更優選地，所述的捕獲微結構的對稱中軸線與主流道中線的夾角為45-60度。
[0012]優選地，所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片還包括生物分子標記磁粒子(免疫磁粒子)。
[0013]更優選地，所述的生物分子標記磁粒子包括粒徑為10_50nm的生物分子標記磁粒子、粒徑為300-500nm的生物分子標記磁粒子、粒徑為I μ m的生物分子標記磁粒子以及粒徑為2.8 μ m的生物分子標記磁粒子的一種或兩種以上的組合。
[0014]更優選地，所述的生物分子標記磁粒子為至少一種可與靶細胞特異性結合的標記有生物分子抗體的磁粒子。
[0015]更優選地，所述的靶細胞為肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、食管癌、膽囊癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、淋巴瘤、宮頸癌、子宮內膜癌或卵巢癌釋放的循環腫瘤細胞。
[0016]更優選地，所述的生物分子為蛋白質、核酸、脂類或糖類。
[0017]本發明還提供了上述循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片的製造方法，其特徵在於，具體步驟包括:在矽片基底上進行SU8膠光刻，獲得所需要的微流控通道的陰模，然後通過聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)成型,製備微流控通道；最後將微流控通道與玻璃基片進行鍵合，得到循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片。[0018]本發明還提供了上述循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片的使用方法，其特徵在於，具體步驟包括:
[0019]第一步:將含有複雜細胞成份的樣品預處理後獲得全部有核細胞重懸液，加入生物分子標記磁粒子進行孵育，得到細胞懸液；
[0020]第二步:在循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片外部施加外磁場，將細胞懸液和PBS緩衝液分別通過樣本管道和緩衝液管道以相同的流速或壓力泵入循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片；
[0021]第三步:將相應的生物分子螢光抗體分別通過鑑定釋放管道泵入各捕獲區域，同時，將PBS緩衝液以相同的流速從樣本管道和緩衝液管道泵入，孵育後，將PBS緩衝液通過鑑定釋放管道泵入，螢光顯微鏡下觀察捕獲的循環腫瘤細胞，即可實現捕獲循環腫瘤細胞的分類鑑定；或者，撤除外磁場，在樣本通道和緩衝液通道內以相同的速度泵入細胞培養液或緩衝液，按照從流出端到流入端的順序依次打開各捕獲區域連接的鑑定釋放管道的閥門，將細胞培養液或緩衝液從鑑定釋放管道泵入，鑑定釋放管道內液體的流速要等於或高於樣本通道和緩衝液通道內液體的流速，在流出道順序收集不同捕獲區域捕獲的循環腫瘤細胞。
[0022]優選地，所述的含有複雜細胞成份的樣品為靜脈血樣本、動脈血樣本或淋巴液樣本。
[0023]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0024]本發明的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片內具有特定形狀的微捕獲結構陣列，可以實現通過一次樣品進樣即完成單/多標誌物循環腫瘤分離、分類和釋放收集的功能。使用時，被不同大小/磁強免疫磁性粒子標記的靶細胞在流道內受磁場作用產生特定的偏轉角度和範圍，使 不同種類的靶細胞被其所對應的不同微捕獲結構陣列區域捕獲。不同微捕獲結構陣列區域內分離的不同種類的靶細胞可順序被釋放並收集。對於不同微捕獲結構陣列區域內分離的不同種類的靶細胞，可使用不同分子生物學鑑定方法(如但不限於生物分子抗體，原位RNA檢測技術等)進行分類鑑定。本發明具有較高的靈敏度和特異性，捕獲細胞易於收集，無需晶片內部微流通道複雜的表面修飾過程。本發明可用於循環腫瘤細胞的捕獲、鑑定、回收、分子生物學分析和基因組學分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片內部設計示意圖。
[0026]圖2為圖1中A處放大圖；
[0027]圖3為循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片分類捕獲的示意圖。
[0028]圖4為循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片分類鑑定的示意圖。
[0029]圖5為循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片實施外周血循環腫瘤細胞順序的示意圖。
[0030]圖6為循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片實施肝癌患者外周血循環腫瘤細胞檢測結果。右上，紅色螢光標記EpCAM+循環肝癌幹細胞，藍色螢光標記細胞核；左上，紅色螢光標記CD133+循環肝癌幹細胞，綠色螢光標記CD45+白細胞，藍色螢光標記細胞核；右下，綠色螢光標記CD90+循環肝癌幹細胞，紅色螢光標記CD45+白細胞，藍色螢光標記細胞核；左下，紅色螢光標記CD24+循環肝癌幹細胞，綠色螢光標記CD45+白細胞，藍色螢光標記細胞核。
[0031]圖7為循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片實施肝癌患者外周血循環腫瘤細胞捕獲並釋放後，使用單細胞PCR檢測系統，對EpCAM+、⑶133+、⑶90+和⑶24+循環腫瘤幹細胞實施47個癌症和幹細胞相關基因的表達譜檢測。以證明循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片捕獲得到的細胞可以應用於下遊分子生物學實驗。
[0032]圖中，?為閥門，@白細胞，㊣紅細胞，@、⑩、?不同類別的循環腫瘤細胞。
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例來具體說明本發明。
[0034]實施例1
[0035]如圖1所示，為循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片內部設計示意圖，所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片包括玻璃基片I，所述的玻璃基片I上設有微流控通道，所述的微流控通道包括主流道2，主流道2的流入端分別連接樣本管道3和緩衝液管道4，主流道2的流出端連接流出道5，主流道2的側面從流入端到流出端的方向上依次連接第一捕獲區域11、第二捕獲區域12和第三捕獲區域13，每個捕獲區域內皆設有捕獲微結構，如圖2所示，每個捕獲區域內的捕獲微結構共有至少兩排，相鄰兩排中的捕獲微結構交錯排列，每個捕獲微結構包括對稱設置的第一側壁21和第二側壁22，第一側壁21和第二側壁22的前後兩端皆不連接。所述的第一側壁21和第二側壁22的前端之間的距離a為5 μ m，第一側壁21和第二側壁22的後端之間的距離b為20 μ m，第一側壁21和第二側壁22的長度c為20 μ m，每排中相鄰的捕獲微結構之間的距離d為30 μ m，相鄰兩排捕獲微結構的距離e為45 μ m。捕獲`微結構的對稱中軸線與主流道2中線的夾角α為45度。每個捕獲區域各連接一個鑑定釋放管道6。循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片的長度和寬度分別為50mm和10mm。每個捕獲區域的寬度為15mm。
[0036]所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片還包括生物分子標記磁粒子(免疫磁粒子)。所述的生物分子標記磁粒子包括粒徑為300m的EpCAM標記磁粒子、粒徑為50nm的⑶133標記磁粒子、粒徑為I μ m的⑶90標記磁粒子、粒徑為2.8 μ m的⑶24標
記磁粒子。
[0037]所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片的製作方法為:在矽片基底上進行SU8膠光刻，獲得所需要的微流控通道的陰模。將PDMS預聚體(Dow Coming, USA)與固化劑(Dow Coming, USA))按照10: I的質量比充分混合後，在真空箱中抽真空脫氣0.5h以上，直至肉眼可見的小氣泡完全消失。將脫氣後的混合物小心傾倒在處理好的SU-8陰模上，靜置待PDMS混合物充分填充入SU-8陰模上的空隙裡，PDMS混合物表面流平，然後放入烘箱中，在95°C下固化一個小時，手工脫模，即得到具有微流控通道結構的PDMS基片，清洗，將待鍵合的玻璃片和PDMS基片依次用丙酮、乙醇超聲清洗5min，用大量去離子水衝洗；將玻璃片放入120°C烘箱，PDMS基片放入80°C烘箱，去水烘乾；將玻璃片和PDMS基片的待鍵合面放在氧等離子體腔中(真空度27Pa，氧氣流量lOOOsccm，電壓10V，功率10W，時間60s)，進行表面活化；將氧等離子體處理後的玻璃基片和PDMS基片貼合，小心的趕走氣泡，放入烘箱，升溫到95°C烘烤lOmin，即可形成永久鍵合，得到循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片。
[0038]所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片的操作方法為:
[0039](l)Hep3B細胞株(購自中科院上海生命科學園，肝細胞肝癌腫瘤細胞，表達EpCAM、CD133、CD90和CD24的H印3B細胞陽性率分別為99.8%分、98%、0.2%和1%，本實施例中以!fep3B細胞作為摻入法的循環腫瘤細胞)。取4X IO7的!fep3B細胞，按每份I X IO7細胞分別與如下螢光抗體以1: 100比例混合CD24-PE(Catalog n0.130-095-403,MiltenyBiotec), CD90-FITC(Catalog n0.130-095-953，Milteny Biotec), EpCAM-PE(Catalogn0.130-091-253, Milteny Biotec), CD133-PE(Catalog n0.130-080-801, MiltenyBiotec) ,4 °C 孵育 15min,使用流式細胞儀(BD FACSAria, BD Biosciences)分別分選EpCAM+、CD133+、CD90+ 和 CD24.的 H印3B 細胞各 1000 個，分別用 Iml PBS(PBS1X, Catalogn0.21-040-CVR, Coming)重懸。取4支Eppendorf管，每個管中放入上述四種Hep3B細胞懸液各100 μ I (每個管內含有100個!fep3B細胞)。
[0040]將上述製備好的四種Hep3B細胞懸液分別摻入Iml健康人外周血，分別得到100個EpCAM+H印3B/Iml外周血樣本、100個CD133+Hep3B/lml外周血樣本、100個CD90+!fep3B/lml外周血樣本和100個CD24+!fep3B/lml外周血樣本。
[0041](2)將含有複雜細胞成份的樣品預處理:將上述製備好的血液樣本,與其9X體積的紅細胞裂解液(Red blood cell lysis solutionlOX,Catalog n0.130094183,MiltenyiBiotec)室溫混勻2分鐘，加入等體積的PBS緩衝液(PBS1X, Catalog n0.21-040-CVR,Coming)終止裂紅反應，室溫下以350g的離心力離心5分鐘，去除上清，加入300 μ I PBS緩衝液(pH = 7.4)重懸,獲得外周血全部有核細胞(包括腫瘤細胞、白細胞、內皮細胞等)重懸液；
[0042](3) 300nm 的 EpCAM 標記磁粒子(EasySep? H uman EpCAM positive selectionkit, Catlog n0.18356, StemCell technologies)、粒徑為 50nm 的 CD 133 標記磁粒子(CD133MicroBead Kit, human C`atalog n0.130-050-801, Milteny Biotec)為直接標記磁粒子，無需用戶自行標記。90-biotin 抗體(Catalog n0.130-099-266, Milteny Biotec)和 CD24_biotin 抗體(Catalog n0.130-099-266, Milteny Biotec)分別與 Iym磁粒子(DynabeadsR MyOne? StreptavidinTl, Catalog n0.65601, Life technologies)、粒徑為2.8 μ m磁粒子(DynabeadsR M-280Streptavidin, Catalog n0.11206D, Life technologie)分別以體積比1:1的比例室溫30分鐘混勻。
[0043](4)將上述的生物分子標記磁粒子加入到外周血全部有核細胞重懸液中，每種生物分子標記磁粒子與外周血全部有核細胞重懸液的以體積比1: 3比例，即300 μ I細胞重懸液與100 μ I磁粒子混勻。4°C下孵育60分鐘，加入1ml PBS緩衝液(pH = 7.4)，以350g的離心力離心5分鐘，去除上清，加入5ml PBS緩衝液(pH = 7.4)重懸，得到含有外周血有核細胞和生物分子標記磁粒子的複合液，以進行後續步驟。
[0044](5)如圖3所示，在循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片外部施加外磁場7 (汝鐵硼永磁鐵)，使用精密注射泵，將含有外周血有核細胞和生物分子標記磁粒子的複合液和PBS緩衝液(pH = 7.4)分別通過樣本管道3和緩衝液管道4以相同的流速(2ml/hr)泵入循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，生物分子標記磁粒子在外磁場的磁力作用下發生不同角度的偏轉，並最終在其相對應的捕獲區域內被捕獲收集。未與生物分子標記磁粒子結合的其他血細胞(白細胞、內皮細胞等)則經過流出道流入廢液池。整個操作過程中鑑定釋放管道的閥門處於關閉狀態。
[0045](6)如圖4所示，將相應的生物分子螢光抗體以1: 100比例稀釋後(終體積 l-2ml),進行如下組合:CD24-PE(Catalog n0.130-095-403，MiltenyBiotec)+CD45-FITC(Catalog n0.555482, BD bioscience), CD90-FITC(Catalogn0.130-095-953, Milteny Biotec)+CD45-PE(Catalog n0.561866, BD bioscience),EpCAM-PE(Catalog n0.130-091-253，Milteny Biotec)+CD45-FITC(同上)，CD133-PE (Catalog n0.130-080-801, Milteny Biotec)+CD45-FITC(同上)，打開鑑定 / 釋放管道閥門，以低流速lml/hr分別通過鑑定釋放管道6泵入各捕獲區域，同時，將PBS緩衝液(pH = 7.4)以相同的流速從樣本管道3和緩衝液管道4泵入，避光室溫孵育2小時，將PBS緩衝液(pH = 7.4)通過鑑定釋放管道以2ml/hr的流速泵入，螢光顯微鏡下觀察捕獲的循環腫瘤細胞，即可實現捕獲循環腫瘤細胞的分類鑑定。分類捕獲後的細胞成像結果請參見圖6。整個操作過程必須保持外加磁場的存在。
[0046](7)本晶片捕獲的EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+的!fep3B細胞數量分別為99個、96個、98個、99個，每種標誌物細胞的捕獲效率高達99%、96%、98%和99%。使用目前商售的MACS細胞富集系統(QuadroMACS? Separator and Starting Kits,Miltenyi Biotec,Germany)，按照產品說明書對相同的血樣進行處理，每種標誌物標誌物Hep3B細胞的捕獲率分別僅為24 %、25 %、30 %、20 %。實驗結果顯示，本發明方案中微流控晶片對外周血不同標誌物循環腫瘤細胞的分類捕獲效率明顯高於目前商售系統。
[0047]實施例2
[0048]循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片及其製造方法與實施例1相同。其操作方法如下:
[0049](I)將含有複雜細胞成份的樣品預處理:採集腫瘤患者外周靜脈血5ml，用PBS緩衝液(pH = 7.4)稀釋2 倍，然後小心加於15ml Ficoll分離液(Ficoll-PaqueTM PLUS,Catalog n0.17-1440-03, GE Healthcare)之上,室溫400g離心30分鐘,收集單個核細胞層內的細胞並用10ml PBS緩衝液(pH = 7.4)重懸，室溫在離心力為300g的條件下離心10分鐘，去除上清，300 μ I PBS緩衝液(pH = 7.4)重懸，獲得外周血全部有核細胞(包括腫瘤細胞、白細胞、內皮細胞等)重懸液；
[0050]步驟⑵、(3)⑷與實施例1中步驟(3)、⑷、(5)相同。
[0051](5)如圖5所示，撤除外磁場，在樣本通道3和緩衝液通道4內以相同的速度(4ml/hr)泵入細胞培養液(DMEM1X，Catlog n0.11995-065，Gibco)，按照從流出端到流入端的順序依次打開各捕獲區域連接的鑑定釋放管道的閥門(按照捕獲區域C — A的順序)，每個閥門打開時間為4min，間隔lmin，將細胞培養液(同上)從鑑定釋放管道泵入，鑑定釋放管道內液體的流速為(4ml/hr)，在流出道5順序收集不同捕獲區域捕獲的循環腫瘤細胞，用於下遊研究。
[0052](6)使用顯微作業系統(TransferMan NK2,Eppendorf,Germany)將步驟⑶中收集的不同標誌物循環腫瘤細胞單細胞分別挑出(每種標誌物各收集4個細胞，共16個細胞)，按照產品說明說使用單細胞表達譜系統(BioMark? HD system, Fluidigm)對16個循環腫瘤單細胞進行單細胞數字PCR檢測。檢測結果見圖7。實驗結果顯示，本發明方案中的微流控晶片捕獲的多種標誌物循環腫瘤細胞保持了較好的細胞活性，可進一步應用下遊分子生物學分析。`
【權利要求】
1.一種循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，包括玻璃基片(I)，所述的玻璃基片(I)上設有微流控通道，其特徵在於，所述的微流控通道包括主流道(2)，主流道(2)的流入端分別連接樣本管道(3)和緩衝液管道(4)，主流道(2)的流出端連接流出道(5)，主流道(2)的側面從流入端到流出端的方向上依次連接至少兩個捕獲區域，每個捕獲區域內皆設有捕獲微結構，每個捕獲區域各連接一個鑑定釋放管道(6)。
2.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，其特徵在於，所述的主流道(2)的側面從流入端到流出端的方向上依次連接第一捕獲區域(11)、第二捕獲區域(12)和第三捕獲區域(13)。
3.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，其特徵在於，所述的每個捕獲區域內的捕獲微結構共有至少兩排，相鄰兩排中的捕獲微結構交錯排列，每個捕獲微結構包括對稱設置的第一側壁(21)和第二側壁(22)，第一側壁(21)和第二側壁(22)的前後兩端皆不連接。
4.如權利要求3所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，其特徵在於，所述的第一側壁(21)和第二側壁(22)的前端之間的距離(a)為4-7μπι，第一側壁(21)和第二側壁(22)的後端之間的距離(b)為15-25μπι，第一側壁(21)和第二側壁(22)的長度(c)為20 μ m，每排中相鄰的捕獲微結構之間的距離(d)為25-30 μ m，相鄰兩排捕獲微結構的距離(e)為 40-50 μ m。
5.如權利要求3所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，其特徵在於，所述的捕獲微結構的對稱中軸線與主流道(2)中線的夾角(α)為45-60度。
6.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，其特徵在於，所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片還包括生物分子標記磁粒子。
7.如權利要求6所述的循環腫瘤`細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，其特徵在於，所述的生物分子標記磁粒子包括粒徑為10-50nm的生物分子標記磁粒子、粒徑為300_500nm的生物分子標記磁粒子、粒徑為I μ m的生物分子標記磁粒子以及粒徑為5 μ m的生物分子標記磁粒子的一種或兩種以上的組合。
8.如權利要求6所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片，其特徵在於，所述的生物分子標記磁粒子為至少一種可與靶細胞特異性結合的標記有生物分子抗體的磁粒子。
9.權利要求1-8中任一項所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片的製造方法，其特徵在於，具體步驟包括:在矽片基底上進行SU8膠光刻，獲得所需要的微流控通道的陰模，然後通過聚二甲基矽氧烷成型，製備微流控通道；最後將微流控通道與玻璃基片(I)進行鍵合，得到循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片。
10.權利要求1-8中任一項所述的循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片的使用方法，其特徵在於，具體步驟包括: 第一步:將含有複雜細胞成份的樣品預處理後獲得全部有核細胞重懸液，加入生物分子標記磁粒子進行孵育，得到細胞懸液； 第二步:在循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片外部施加外磁場，將細胞懸液和PBS緩衝液分別通過樣本管道(3)和緩衝液管道⑷以相同的流速或壓力泵入循環腫瘤細胞捕獲和分類磁性微流控晶片；第三步:將相應的生物分子螢光抗體分別通過鑑定釋放管道(6)泵入各捕獲區域，同時，將PBS緩衝液以相同的流速從樣本管道(3)和緩衝液管道⑷泵入，孵育後，將PBS緩衝液通過鑑定釋放管道泵入，螢光顯微鏡下觀察捕獲的循環腫瘤細胞，即可實現捕獲循環腫瘤細胞的分類鑑定；或者，撤除外磁場，在樣本通道⑶和緩衝液通道⑷內以相同的速度泵入細胞培養液或緩衝液，按照從流出端到流入端的順序依次打開各捕獲區域連接的鑑定釋放管道的閥門，將細胞培養液或緩衝液從鑑定釋放管道泵入，鑑定釋放管道內液體的流速要等於或高於樣本通道(3)和緩衝液通道(4)內液體的流速，在流出道(5)順序收集不同捕獲區域捕獲 的循環腫瘤細胞。
【文檔編號】C12M1/42GK103865752SQ201410081500
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】樊嘉, 楊欣榮, 孫雲帆, 陳翔, 徐泱, 周儉 申請人:復旦大學附屬中山醫院