膠原凝膠人工真皮替代物的製作方法
2023-05-26 17:58:06 2
專利名稱：膠原凝膠人工真皮替代物的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術，特別是膠原凝膠人工真皮及其製備方法。
背景技術：
國內尚無此類產品上市或申請專利；國外有同類產品，但無相同成分的人工真皮上市或申請專利。與本發明密切相關的技術為膠原海綿人工真皮、脫細胞異體真皮、人造材料真皮替代物。膠原海綿人工真皮的製作過程中需使用交聯劑，移植後對機體有毒性；脫細胞異體真皮和人造材料真皮替代物在結構和組成上離正常皮膚尚有一定的差距。
發明內容
本發明的目的是提供一種膠原凝膠人工真皮及其製備方法。本發明可以克服已有技術的缺點，可以直接應用於移植給皮膚缺損病人，促進傷口處肉芽組織生成和臨近上皮遊走，促進皮膚缺損的修復和再生。
本發明的組成和體積比為牛腱膠原分散液20-80份DMEM培養液10份穀氨醯胺溶液0.25-1份碳酸氫鈉溶液1-6份胎牛血清12份人胎真皮成纖維細胞懸液6份。
本發明的組成和體積比可以為牛腱膠原分散液80份DMEM培養液10份穀氨醯胺溶液1份碳酸氫鈉溶液6份胎牛血清12份人胎真皮成纖維細胞懸液6份。
本發明的製備方法包括下述步驟1)在冰浴條件下於容器中依次加入計量的DMEM培養液，穀氨醯胺溶液，碳酸氫鈉溶液，胎牛血清，牛腱膠原分散液份，均勻混合，再加入人胎真皮成纖維細胞懸液混勻；2)加入到培養板中，置於CO2培養箱中，待凝膠形成後加入DMEM-10％胎牛血清培養液，37℃，5％CO2下培養2-3周，即得膠原凝膠人工真皮。
本發明體外培養的膠原凝膠人工真皮呈乳白色，半透明狀，具有一定的機械強度和良好的親水性；HE染色證實，人胎真皮成纖維細胞在凝膠內分布均勻，呈現出典型的梭形；免疫組化染色證實，培養過程中，膠原凝膠內成纖維細胞分泌I型膠原和纖維連接蛋白，使得膠原凝膠的基質組成類似正常皮膚。
本發明膠原凝膠人工真皮製備方法技術簡單，其組成和理化性質接近正常真皮，具有潛在的臨床應用前景，可以直接應用於移植給皮膚缺損病人，促進傷口處肉芽組織生成和臨近上皮遊走，促進皮膚缺損的修復和再生。
圖1膠原凝膠人工真皮培養第2周，凝膠的HE染色(×80)。
圖2膠原凝膠人工真皮體外培養2周，I型膠原免疫組化染色(×160)具體實施方式
實例1取處於指數生長期的第2-3代人胎真皮成纖維細胞，0.25％胰蛋白酶溶液消化，吹打，離心，懸浮於DMEM-10％胎牛血清培養液中，血球計數板計數，調整細胞濃度至5.0×106/ml，待用；用0.01M的醋酸溶液(已滅菌)和本實驗室提取的牛腱I型膠原(已滅菌)配製0.2％的膠原分散液，取40ml待用；配製濃縮的DMEM(10倍)培養液5ml，0.3M的穀氨醯胺溶液0.5ml，1M的碳酸氫鈉溶液1.8ml，胎牛血清6ml；將上述4種溶液和40ml膠原分散液按順序滴入100ml無菌錐形瓶(置於冰塊上，即冰浴條件下)中，再加入3ml成纖維細胞懸液，迅速混勻，立刻用吸管將此膠原-細胞混懸液滴入12孔板中，每孔3ml，37℃培養箱中靜置3-5分鐘，待凝膠形成後，每孔加入DMEM-10％胎牛血清培養液各1ml，37℃，5％CO2下培養。以後每2天換液一次，2-3周後，即得到膠原凝膠人工真皮。測定結果見表1(用拉力試驗機測定)、表2(接觸角測定儀測定)表1 膠原凝膠的機械性能測定結果樣品第1天 第4天 第8天 第12天抗拉強度40，39，4245，45，4653，50，5357，59，60(Kpa)平均40.3 45.3 5259
表2膠原凝膠的接觸角測量結果樣品 第1天 第4天 第8天 第12天接觸角(度)32，34，3133，34，3335，34，3634，36，33平均 32.3 33.3 3534.3實例2取處於指數生長期的第2-3代人胎真皮成纖維細胞，0.25％的胰蛋白酶溶液消化0.5-1分鐘後，加入2ml胎牛血清中止消化，吹打、分散細胞成單細胞懸液，懸浮於DMEM-10％胎牛血清培養液中，血球計數板計數，調整細胞濃度至5.0×106/ml，待用；用0.01M的醋酸溶液(已滅菌)和本實驗室提取的牛腱I型膠原(已滅菌)配製0.2％的膠原分散液，取80ml待用；配製濃縮的DMEM(×10)培養液10ml，0.3M的穀氨醯胺溶液1ml，1M的碳酸氫鈉溶液3.6ml，胎牛血清12ml；將上述4種溶液和80ml膠原分散液按順序滴入200ml無菌錐形瓶(置於冰塊上)中，再加入6ml人胎真皮成纖維細胞懸液，迅速混勻，立刻用吸管將此膠原-細胞混懸液滴入60mm塑料培養皿中，每皿8ml，37℃培養箱中靜置5分鐘，待凝膠形成後，每孔加入DMEM-10％胎牛血清培養液各2ml，37℃，5％CO2下培養。以後每2天換液一次，培養2-3周後，即得到膠原凝膠人工真皮。
實例3取處於指數生長期的第2-3代人胎真皮成纖維細胞，0.25％胰蛋白酶溶液消化，吹打成單細胞懸液，懸浮於DMEM-10％胎牛血清培養液中，血球計數板計數，調整細胞濃度至5.0×107/ml，待用；用0.01M的醋酸溶液(已滅菌)和本實驗室提取的牛腱I型膠原(已滅菌)配製成0.2％的膠原分散液，取20ml待用；配製濃縮的DMEM(×10)培養液2.5ml，0.3M的穀氨醯胺溶液0.25ml，8.4％的碳酸氫鈉溶液1ml，胎牛血清3ml；將上述4種溶液和40ml膠原分散液按順序滴入50ml無菌錐形瓶(置於冰塊上)中，再加入1ml人胎真皮成纖維細胞懸液，迅速混勻，立刻用吸管將此膠原-細胞混懸液滴入24孔培養板中，每孔1ml，37℃培養箱中靜置3-5分鐘，待凝膠形成後，每孔加入DMEM-10％胎牛血清培養液各0.8ml，37℃，5％CO2下培養。以後每2天換液一次，培養2-3周後，即得到膠原凝膠人工真皮。
實例4使用實例1製得的膠原凝膠人工真皮進行HE染色實驗(常規染色實驗方法和條件)，結果見圖1。I型膠原免疫組化染色(常規染色實驗方法和條件)結果見圖2。
權利要求
1.一種膠原凝膠人工真皮，其特徵在於它的組成和體積比牛腱膠原分散液20-80份DMEM培養液10份穀氨醯胺溶液0.25-1份碳酸氫鈉溶液1-6份胎牛血清12份人胎真皮成纖維細胞懸液6份。
2.按照權利要求1所述的膠原凝膠人工真皮，其特徵在於它的組成和體積比牛腱膠原分散液80份DMEM培養液10份穀氨醯胺溶液1份碳酸氫鈉溶液6份胎牛血清12份人胎真皮成纖維細胞懸液6份。
3.權利要求1所述的膠原凝膠人工真皮的製備方法，其特徵在於該製備方法包括下述步驟1)在冰浴條件下於容器中依次加入計量的DMEM培養液，穀氨醯胺溶液，碳酸氫鈉溶液，胎牛血清，牛腱膠原分散液份，均勻混合，再加入人胎真皮成纖維細胞懸液混勻；2)加入到培養板中，置於CO2培養箱中，待凝膠形成後加入DMEM-10％胎牛血清培養液，37℃，5％CO2下培養2-3周，即得膠原凝膠人工真皮。
全文摘要
本發明涉及生物工程技術，特別是膠原凝膠人工真皮及其製備方法。包括牛腱膠原分散液80份，DMEM培養液10份，穀氨醯胺溶液1份，碳酸氫鈉溶液6份，胎牛血清12份混勻後，加入人胎真皮成纖維細胞懸液6份，體外培養即可製成膠原凝膠人工真皮。本發明膠原凝膠人工真皮製備方法技術簡單，其組成和理化性質接近正常真皮，具有潛在的臨床應用前景，可以直接應用於移植給皮膚缺損病人，促進傷口處肉芽組織生成和臨近上皮遊走，促進皮膚缺損的修復和再生。
文檔編號A61L27/60GK1513565SQ0313038
公開日2004年7月21日 申請日期2003年7月9日 優先權日2003年7月9日
發明者張其清, 馬東瑞 申請人:中國醫學科學院生物醫學工程研究所