一種通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法
2023-05-26 21:08:01 4
專利名稱：一種通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法
技術領域：
本發明屬農作物的生物工程育種領域，具體說，涉及一種通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法。
採用細胞工程育種技術可望獲得抗逆性大幅度提高和抗除草劑的工程植株，也可有效地獲得耐低濃度營養元素的種質材料(其中部分為營養高效型)，並可縮短育種年限，為甜菜抗逆育種和營養高效型育種開闢了新途徑。大量工作表明，植物組織或細胞培養過程中會出現高頻率的廣泛變異即體細胞無性系變異，如果再結合理化因素處理，則可大大提高變異範圍及頻率。選取其中對農業生產有利用價值的性狀可達到植物改良的目的。
採用細胞工程技術創造作物新種質首先依賴於離體培養細胞或組織器官能否高頻率地再生植株，其次取決於是否能有效地誘發和選擇出細胞突變體，並獲得再生植株。由於甜菜組織培養及細胞工程研究難度大，雖有大量工作，但只有少數實驗室建立起可用於遺傳操作的離體培養系統。甜菜愈傷組織誘導率低，在繼代培養過程中易褐化，從愈傷組織再生植株難度大，成功率低，雖有一些成功的報導，但多數工作中只獲得少量植株，且受基因型影響大。甜菜原生質體培養研究開始較早，但獲得的愈傷組織很難再生植株，原生質體再生植株成功的報導只有4篇，且培養過程複雜，植株再生依賴於特定的基因型，限制了該技術在甜菜育種上的廣泛應用。離體培養甜菜的頂芽、葉片、葉柄等外植體雖發生不定芽，但誘導和增殖頻率都不高，只用於特異種質的繁殖和保存。到目前為止，利用甜菜離體培養系統進行細胞誘變並選擇突變體的工作未有報導。
本發明的甜菜叢生芽誘變和篩選方法，主要步驟包括取甜菜花蕾期的幼嫩花序切段為外植體，在誘導培養基上誘導叢生芽發生，然後轉移到增殖培養基上增殖，剝取叢生芽小葉及葉柄，裸露生長點，進行誘變處理，對誘變處理後的叢生芽塊進行恢復培養和擴增，然後轉入附加選擇劑或降低某種營養成分的增殖培養基上連續培養數代，篩選出存活的小芽轉入生根培養基中誘導生根，也可將未經誘變處理的叢生芽塊直接轉入篩選培養基進行篩選，生根小苗長大後，檢測其抗逆性或利用營養的效能。
上述的甜菜是糖甜菜品種、飼用甜菜品種和兼用型品種以及特用型品種之一。
上述的選擇劑是附加在培養基中的耐鹽、耐旱、兼有耐鹽耐旱、耐高pH值、耐低pH值、耐高鋁濃度、分別耐不同除草劑、耐低磷、耐低鉀及其它營養元素的篩選環境條件之一。
上述降低某種營養成分是指篩選培養基中減量或減去氮、磷、鉀、硫、鋅、錳、鐵、硼、鉬等營養元素。
上述誘變處理中使用的誘變劑是化學試劑或物理因子。
上述物理誘變因子是γ射線、χ射線、紫外線、熱中子、慢中子之一。
上述的小芽在選擇培養基上可連續篩選2---6代，也可間隔篩選3-12代，使用的選擇劑濃度可隨小苗不同生長時期的敏感程度而變化。
上述培養基的配方是，叢生芽誘導培養基的組成為MS培養基、蔗糖30-60g/L、100-500mg/L的水解酪蛋白(CH)、0.5-3.0mg/L的6-BA(6-苄基嘌呤)、0.1-0.8mg/L的NAA(萘乙酸)、瓊脂6-9g/L，pH5.5-6.2；叢生芽增殖培養基組成為MS培養基、蔗糖30-70g/L、50-500mg/L的水解酪蛋白(CH)、0.5-2.0mg/L的6-BA及0.1-0.8mg/L的NAA、瓊脂6-8g/L，pH5.5-6.2；生根培養基的組成為1/2MS培養基、蔗糖20-50g/L、50-300mg/L的水解酪蛋白和1.0-5.0mg/L的NAA、瓊脂6-8g/L，pH5.5-6.2。
上述培養基的配方是，叢生芽誘導培養基的組成為MS培養基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白(CH)、1.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、瓊脂7g/L，pH5.8；叢生芽增殖培養基的組成為MS培養基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白(CH)、1.0-2.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、瓊脂7g/L，pH5.8；小苗生根培養基的組成為1/2MS培養基、蔗糖30-50g/L、200mg/L的水解酪蛋白和2.5mg/L的NAA、瓊脂7g/L，pH5.8。
上述的甜菜叢生芽誘變和篩選方法在創造抗逆新種質中的應用，取花蕾期幼嫩花序頂端切段為外植體，在叢生芽誘導培養基上誘導叢生芽發生；叢生芽塊擴增後，剝去小葉，將組織塊切成2-3毫米大小，用5-30Gy的γ射線輻照，恢復培養3天後，轉入補加1.5-2.5％的NaCl的增殖培養基進行選擇，連續篩選3-4代，獲得耐鹽的小苗；將2-3cm的小苗轉入生根培養基中生根，獲得耐鹽植株，植株移栽成活後自交結實，檢測子代的耐鹽性和農藝性狀，選出耐鹽新種質。
通過本發明的方法，獲得了能耐2％NaCl的甜菜育種材料。
本發明的甜菜叢生芽誘變和篩選方法的優選技術方案取甜菜植株處於花蕾期的幼嫩花序頂端，切成1.0cm左右切段，滅菌後，再用解剖刀切成含3-5個花蕾的小段，接種於誘導培養基進行誘導培養。外植體滅菌程序為在無菌條件下用70％酒精消毒1-1.5分鐘，0.1％HgCl2水溶液殺菌3-8分鐘，無菌水衝洗3-5次。誘導培養基的組成為MS培養基、蔗糖30-60g/L、100-500mg/L的水解酪蛋白(CH)、0.5-3.0mg/L的6-BA及0.1-0.8mg/L的NAA、瓊脂6-9g/L，pH5.5-6.2。小切段在26±5℃條件下暗培養1周後，放置1500-3000lx光照下培養，15--20天繼代1次。繼代培養基為叢生芽增殖培養基，培養基組成為MS培養基、蔗糖30-70g/L、50-500mg/L的水解酪蛋白(CH)、0.5-2.0mg/L的6-BA及0.1-0.8mg/L的NAA、瓊脂6-8g/L，pH5.5-6.2。不同基因型的切段產生叢生芽的速率不同。一般在接種8-10天後開始在花蕾基部的花託上開始分化叢生芽，少數品種則在17天後才開始分化叢生芽。隨著培養時間的延長，叢生芽大量產生，聚集成叢。繼代培養3次後，外植體產生叢生芽頻率一般在80％以上。在繼代培養中每個叢生芽每一次又可產生4-8個次生芽。
剝去叢生芽長出的幼葉，將芽塊切成2-3mm小塊，放入培養皿中用於誘變處理。每小塊由5-20個幼芽組成。若用射線進行輻照，先確定半致死劑量。然後選用接近半致死劑量的射線劑量進行誘變處理。叢生芽小塊以3×3mm的間距放置在增殖培養基上生長2-3天時進行輻照。輻照後的叢生芽塊在暗中恢復培養2天左右，再在光下培養1周，然後轉入到篩選培養基上篩選。若用化學誘變劑進行誘變，首先根據誘變劑的理化性質選擇合適的緩衝液和處理方法，處理並培養叢生芽小塊，以半致死率為參考，確定合適的誘變劑濃度和處理時間以及洗滌時間和方法等。然後選取適宜參數進行規模化處理叢生芽小塊。處理後芽塊轉入增殖培養基上暗中恢復培養2天，光下恢復培養3天，然後轉入不同選擇培養基進行篩選。
篩選培養基中的選擇劑種類及濃度因所選材料的特點確定。如篩選耐鹽變異體，培養基中添加NaCl或NaCl和Na2SO4的組合。NaCl濃度可分別為1.5％、2.0％、2.5％、3.0％。若選擇耐旱變異體，培養基中添加聚乙二醇或聚乙二醇與甘露醇或山梨醇的適宜組合。聚乙二醇的濃度可為12-22％。若選擇耐低磷或耐低鉀的變異體，篩選培養基則去掉含磷化合物或含鉀化合物。若選擇耐低鋅或其它營養元素的變異體，篩選培養基則不僅要去掉含鋅化合物或含其它營養元素的化合物，而且用於製備培養基的無機鹽應全部為分析純或標定純，水為無離子水或雙蒸水，瓊脂條必須經過金屬絡合物溶液浸泡和無離子水浸泡洗滌。
誘變處理後叢生芽塊在篩選培養基上照光培養，每隔15--20天繼代一次，連續篩選或間隔篩選2-6代(次)，以未誘變的叢生芽塊為陰性對照，觀察統計幼苗的長勢及死亡情況。轉移到加有選擇劑的培養基上的經誘變處理的叢生芽塊雖在篩選初期長勢較弱，但一周後旺盛增生(在高選擇劑濃度的培養基上增生相對較慢)，組織塊不斷增大，篩選半個月後，部分小芽生長變差或逐漸壞死。在第二次繼代培養時(一般已篩選培養一個月以上)，切去叢生芽塊壞死部分和葉片。在第二代篩選培養中，叢生芽塊生長速率和小芽增殖情況取決於細胞所受的脅迫情況，選擇濃度高，組織塊壞死比例高，產生的小芽少。在第三代篩選培養中，若培養基中選擇劑濃度適宜，多數組織塊變褐或死亡，少數組織塊有生長正常的區域和新生的小芽。若選擇劑濃度過高，則全部組織塊死亡。選擇劑濃度過低，多數組織塊存活，篩選出的高抗性材料比例低。在減去某種營養元素的篩選培養基上，經誘變處理的叢生芽塊雖在篩選初期長勢較弱，但一周後旺盛增生，組織塊不斷增大，繼代時需切成小塊轉入新的篩選培養基。在第二代篩選培養中，叢生芽塊生長速率和小芽增殖速率下降，下降幅度取決於缺失的養分種類和細胞所受的脅迫程度，大量元素的缺乏導致組織塊生長明顯變差，甚至出現局部細胞死亡。微量元素缺乏則造成生長速率下降，小芽數減少或生長不正常。在第三代篩選培養中，組織塊生長慢並出現局部壞死，產生的小芽數少。在第四、五代篩選培養中，只有少數組織塊的局部區域細胞能正常地增生和產生小芽。這些小芽可轉入全組分的增殖培養基上生長和產生叢生芽。
從篩選培養基得到的小芽在轉入增殖培養基後能迅速生長和產生大量的叢生芽。可將快速倍增的叢生芽用解剖刀分離成單芽或叢生芽小塊，轉移到6-BA0.5-2.0mg/L的增殖培養基上，待小苗長到3-5片小葉時轉移到生根培養基上，在26±2℃下暗培養，誘導生根，15天繼代一次。生根培養基的組成為1/2MS培養基、蔗糖20-50g/L、50-300mg/L的水解酪蛋白和1.0-5.0mg/L的NAA、瓊脂6-8g/L，pH5.5-6.2。待小苗長出3-5條白色小根後，轉移到2000-4000lx光強下照光培養約一周，再在自然散射光下照光三天，揭蓋煉苗2天後，洗去根基部瓊脂，移栽到上層蛭石下層壤土的花盆中，隔天澆灌一次營養液，連續兩周。移栽後小苗稍遮陰，一周後可在陽光下生長。溫度以夜間不低於15℃、白天不高於28℃最佳。移栽半月後，小苗產生新根系，一月後定植於大田。甜菜試管苗生根率因基因型不同而有明顯的差異，均在75％以上，不同基因型的試管苗移栽成活率高達98％。
對移栽成活苗，根據育種目標可進行二次篩選或抗性鑑定，以未經篩選的幼苗為陰性對照。若選擇抗除草劑植株，則以適宜濃度的除草劑噴灑小苗，選擇抗性植株進行恢復培養，然後定植于田間。若選擇耐鹽或耐旱植株，可選擇帶5片葉子的健壯植株栽於沙盆中，分別用含不同濃度選擇劑的營養液澆灌，連續澆灌15天。存活植株經恢復培養後定植于田間。若選擇耐低磷或耐低鋅植株，也以去掉含磷化合物或含鋅化合物的營養液澆灌健壯生長於沙盆中的小植株，一般連續澆灌15天，選取長勢較好和缺素症狀不明顯的植株進行恢復培養，然後定植于田間。
具體實施方式
實施例1甜菜耐鹽突變體的篩選及利用1、叢生芽誘導和擴增選用甜菜品種KWS6441、KWS9306、KWS5075、酒引抗4號、工農201、7721，取植株處於花蕾期的幼嫩花序頂端1.0cm，用70％酒精消毒1分鐘，0.1％HgCl2水溶液殺菌3-5分鐘，無菌水衝洗3次。滅菌後，將莖段切成含3-5個花蕾的小段，接種於誘導培養基進行誘導培養。誘導培養基的組成為MS培養基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白(CH)、1.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、瓊脂7g/L，pH5.8。小切段在26±2℃條件下暗培養1周後，放置1500lx光照下培養，18天繼代1次。繼代培養基為叢生芽增殖培養基，培養基組成為MS培養基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白(CH)、1.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、瓊脂7g/L，pH5.8。
不同基因型的切段產生叢生芽的速率不同，一般在接種8天後在花蕾基部的花託上開始分化叢生芽。隨著培養時間的延長，叢生芽大量產生，聚集成叢。繼代培養3次後，外植體產生叢生芽頻率在80％以上。在繼代培養中每個叢生芽每一次又可產生4-8個次生芽。
2、誘變處理和篩選剝去叢生芽長出的幼葉，將芽塊切成2-3mm小塊，放入加有增殖培養基的培養皿中用於γ射線誘變處理。首先確定射線照射的半致死劑量。取600個叢生芽小塊，放入60個培養皿中，分別用0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30Gyγ射線輻照，然後在暗中培養2天，光下培養30天左右，統計叢生芽塊死亡數，求出半致死輻照劑量約為20Gy。然後選用20Gy劑量進行誘變處理。輻照後的叢生芽塊在暗中恢復培養2天左右，再在光下培養1周，然後轉入NaCl濃度分別為1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的培養基進行篩選。叢生芽塊在篩選培養基上照光培養，每隔15天繼代一次，連續篩選3代(次)，以未誘變的叢生芽塊為陰性對照，觀察統計幼苗的長勢及死亡情況。篩選初期，叢生芽塊雖長勢較弱，但一周後旺盛增生(在高鹽濃度的培養基上增生相對較慢)，組織塊不斷增大，篩選15天後，部分小芽生長變差或逐漸壞死。在第二次繼代培養時(一般已篩選培養30天)，切去叢生芽塊壞死部分和葉片。在第二代篩選培養中，叢生芽塊生長速率和小芽增殖情況取決於細胞所受的脅迫情況，選擇濃度高，組織塊壞死比例高，產生的小芽少。小苗受害程度可分為3類。A、死亡苗生長點變黑死亡，葉片發黃枯死。B、枯黃苗生長緩慢，葉面皺縮，葉片發黃，莖基部變黑，不再分化叢生芽。C、正常苗生長速率受影響不大，葉片舒展，能分化叢生芽。在第三代篩選培養中，若培養基中選擇劑濃度適宜，多數組織塊變褐或死亡，少數組織塊有生長正常的區域和新生的小芽。若鹽濃度過高，則全部組織塊死亡。選擇劑濃度過低，多數組織塊存活，篩選出的高抗性材料比例低。
3、植株再生和抗性鑑定從篩選培養基得到的小芽在轉入增殖培養基後能迅速生長和產生大量的叢生芽。可將快速倍增的叢生芽用解剖刀分離成單芽或叢生芽小塊，轉移到6-BA(6-苄基嘌呤)1.0mg/L的增殖培養基上，待小苗長到3-5片小葉時轉移到生根培養基上，在26±2℃下暗培養，誘導生根，15天繼代一次。生根培養基的組成為1/2MS培養基、蔗糖30g/L、200mg/L的水解酪蛋白和2.5mg/L的NAA(萘乙酸)、瓊脂7g/L，pH5.8。待小苗長出3-5條白色小根後，轉移到2000lx光強下照光培養約一周，再在自然散射光下照光3天，揭蓋煉苗2天後，洗去根基部瓊脂，移栽到上層蛭石下層壤土的花盆中，隔天澆灌一次營養液，連續兩周。移栽後小苗稍遮陰，一周後可在陽光下生長。溫度以夜間不低於15℃、白天不高於28℃最佳。移栽半月後，小苗產生新根系，甜菜試管苗生根率因基因型不同而有明顯的差異，均在75％以上，不同基因型的試管苗移栽成活率高達98％。
對移栽成活苗，也可進行抗性鑑定。將帶5片葉子的健壯植株栽於砂盆中，分別用含不同濃度NaCl(對應於初次篩選所用的鹽濃度)1/2MS無機鹽溶液澆灌，連續澆灌15天。存活植株用不含NaCl的1/2MS無機鹽溶液澆灌一周左右，然後定植于田間。
4、耐鹽植株的利用篩選出的耐鹽植株經春化處理後抽薹開花，用含有1.5％或2.0％NaCl的水溶液澆灌8天，再用含有1.5％或2.0％NaCl的1/2MS無機鹽溶液澆灌40天，此時，植株已有6片葉，定植於大田。只有當代和子代植株都表現出耐鹽性的基因型，才是可用的耐鹽突變體。獲得的耐鹽植株後代用於甜菜耐鹽新品種選育。
權利要求
1.一種通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，主要步驟包括取甜菜花蕾期的幼嫩花序切段為外植體，在誘導培養基上誘導叢生芽發生，然後轉移到增殖培養基上增殖，剝取叢生芽小葉及葉柄，裸露生長點，進行誘變處理，對誘變處理後的叢生芽塊進行恢復培養和擴增，然後轉入附加選擇劑或降低某種營養成分的增殖培養基上連續培養數代，篩選出存活的小芽轉入生根培養基中誘導生根，也可將未經誘變處理的叢生芽塊直接轉入篩選培養基進行篩選，生根小苗長大後，檢測其抗逆性或利用營養的效能。
2.如權利要求1所述的通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，其特徵在於，所述的甜菜是糖甜菜品種、飼用甜菜品種和兼用型品種以及特用型品種之一。
3.如權利要求1所述的通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，其特徵在於，所述的選擇劑是附加在培養基中的耐鹽或耐旱特性、或兼有耐鹽耐旱特性、或分別耐高pH值和低pH值、或耐高鋁濃度、或分別耐不同除草劑、或分別耐低磷、低鉀及其它營養元素的用於篩選的環境條件之一。
4.如權利要求1所述的通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，其特徵在於，所述降低某種營養成分是指篩選培養基中減量或減去氮、磷、鉀、硫、鋅、錳、鐵、硼、鉬等營養元素。
5.如權利要求1所述的通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，其特徵在於，所述誘變處理中使用的誘變劑是化學試劑或物理因子。
6.如權利要求5所述的通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，其特徵在於，所述物理誘變因子是γ射線、χ射線、紫外線、熱中子、慢中子之一。
7.如權利要求1所述的通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，其特徵在於，所述的小芽在選擇培養基上可連續篩選2～6代，也可間隔篩選3～12代，使用的選擇劑濃度可隨小苗不同生長時期的敏感程度而變化。
8.如權利要求1所述的通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，其特徵在於，所述培養基的配方是，叢生芽誘導培養基的組成為MS培養基、蔗糖30-60g/L、100-500mg/L的水解酪蛋白、0.5-3.0mg/L的6-BA、0.1-0.8mg/L的NAA、瓊脂6-9g/L，pH5.5-6.2；叢生芽增殖培養基組成為MS培養基、蔗糖30-70g/L、50-500mg/L的水解酪蛋白、0.5-2.0mg/L的6-BA及0.1-0.8mg/L的NAA、瓊脂6-8g/L，pH5.5-6.2；生根培養基的組成為1/2MS培養基、蔗糖20-50g/L、50-300mg/L的水解酪蛋白和1.0-5.0mg/L的NAA、瓊脂6-8g/L，pH5.5-6.2。
9.如權利要求8所述的通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，其特徵在於，所述培養基的配方是，叢生芽誘導培養基的組成為MS培養基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、瓊脂7g/L，pH5.8；叢生芽增殖培養基的組成為MS培養基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白、1.0-2.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、瓊脂7g/L，pH5.8；小苗生根培養基的組成為1/2MS培養基、蔗糖30-50g/L、200mg/L的水解酪蛋白和2.5mg/L的NAA、瓊脂7g/L，pH5.8。
10.如權利要求1所述的一種通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，取花蕾期幼嫩花序頂端切段為外植體，在叢生芽誘導培養基上誘導叢生芽發生；叢生芽塊擴增後，剝去小葉，將組織塊切成2-3毫米大小，用5-30Gy的γ射線輻照，恢復培養3天後，轉入補加1.5-2.5％的NaCl的增殖培養基進行選擇，連續篩選3-4代，獲得耐鹽的小苗；將2-3cm的小苗轉入生根培養基中生根，獲得耐鹽植株，植株移栽成活後自交結實，檢測子代的耐鹽性和農藝性狀，選出耐鹽新種質。
全文摘要
本發明公開一種通過叢生芽誘變和篩選創造甜菜抗逆新種質的方法，主要步驟包括取甜菜花蕾期的幼嫩花序切段為外植體，在誘導培養基上誘導叢生芽發生，然後轉移到增殖培養基上增殖，剝取叢生芽小葉及葉柄，裸露生長點，進行誘變處理，對誘變處理後的叢生芽塊進行恢復培養和擴增，然後轉入附加選擇劑或降低某種營養成分的增殖培養基上連續培養數代，篩選出存活的小芽轉入生根培養基中誘導生根，也可將未經誘變處理的叢生芽塊直接轉入篩選培養基進行篩選，生根小苗長大後，檢測其抗逆性或利用營養的效能。本發明為甜菜抗逆育種或營養高效育種創造了優異材料。
文檔編號A01H1/00GK1404719SQ0213573
公開日2003年3月26日 申請日期2002年10月23日 優先權日2002年10月23日
發明者楊愛芳, 張舉仁, 張可煒, 王海峰 申請人:山東大學