一種從番石榴葉中提取總黃酮的方法

2023-05-26 20:04:26

專利名稱：：一種從番石榴葉中提取總黃酮的方法
技術領域：
：本發明涉及黃酮類化合物的製備方法，具體是涉及從植物中提取黃酮類化合物的方法。
背景技術：
：番石榴(Psidiumguaijava)又名雞矢果、香稔、長稔、番桃樹，是桃金孃科、番石榴屬果樹。在我國廣西、福建、臺灣、海南、廣東等地廣泛栽種，夏秋採葉，曬乾。其葉性平、味甘澀，具有收斂止瀉、消炎止血的功效。植物化學研究表明，番石榴葉中可提取的有效部位屬於總黃酮類化合物，黃酮類化合物黃酮類化合物(Flavonoids)是植物經光合作用產生的一大類化合物，其主要作用有抗腫瘤,延緩衰老，增強心血管功能，治療慢性前列腺炎，增強免疫力，調解內分泌等。一項發明專利申請(申請號為200610041855.4)公開了一種從番石榴葉中提取黃酮類化合物的方法(1)將經過乾燥、去雜和粉碎的番石榴葉溶於5倍90%100%酒精，真空提取3040min，按上述工藝將番石榴葉重複提取34次，然後在常壓、110。C12(TC的條件下濃縮成浸膏，冷卻，回收乙醇；(2)將除去乙醇後的浸膏用離心的方法分離出固體，然後用非醚類溶劑在45'C55'C下脫脂4560min，最後烘乾，即可。該方法所得番石榴黃酮乾粉中水分含量30%，藥用黃酮純番石榴葉素含量^10%，但是浸膏中總黃酮的含量較低。
發明內容本發明要解決的技術問題是提高從番石榴葉中提取所得的總黃酮的純度。本發明解決上述技術問題的技術方案是.-一種從番石榴葉中提取總黃酮的方法，該方法由以下步驟組成(1)將番石榴葉乾燥、去雜，然後粉碎至粒度2100目；(2)將經過步驟(1)加工的番石榴葉粉用810倍70%乙醇回流提取24次，每次l3h;合併提取液，然後80'C下加熱濃縮至無醇味，過濾，得粗提液；(3)按製備粗提液所用番石榴葉與溼樹脂的重量比為1:14，將粗提液以14BV/h的流速通過填充有徑高比為1:39的弱極性大孔吸附樹脂的層析柱；接著先以24BV/h的流速用38BV的水洗脫，再以13BV/h的流速用46BV的濃度為0,1%的氫氧化鈉溶液洗脫，最後以24BV/h的流速用3090。/。乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；(4)將所得的乙醇洗脫液經減壓或噴霧乾燥，即可。本發明所述的方法，其中步驟(3)中所述的溼樹脂的用量為製備粗提液所用番石榴葉與溼樹脂的重量比優選l:4。本發明所述的方法，其中步驟(3)中洗脫用的乙醇濃度優選70%。本發明方法首先採用多次乙醇回流提取，儘可能將番石榴葉中黃酮類物質提取出來，提高粗提物總黃酮的得率，然後通過適於分離黃酮類化合物的弱極性大孔樹脂層析柱將黃酮類物質從乙醇提取液中分離出來，達到提高總黃酮純度目的。採用本發明方法所得番石榴葉總黃酮的得率可高達2032%，純度高達50°/。左右。以下詳述本發明人所做的實驗報告和具體實施例，以期公眾更好地掌握本發明方法的實施手段，充分理解本發明方法所能達到的技術效果。一、總黃酮純度的測定由於番石榴葉中的黃酮類化合物在紫外分光區有吸收，因此可以用紫外分光光度法測定本發明方法所得總黃酮的純度。1、對照品的製備和標準曲線的繪製參照《中華人民共和國藥典》總黃酮的測定方法精密稱取在120'C乾燥下至恆重的蘆丁對照品50mg,置25ml量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇置刻度，搖勻。精密量取IOml置100ml量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻作為對照品溶液備用。精密量取對照品溶液l.O、2.0、3.0、4.0、5.0與6.0ira分別置25ml量瓶中，各加蒸餾水至6.0m]，加5%亞硝酸鈉溶液1ral，混勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁溶液1ral搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉溶液10ral再加蒸餾水至刻度，搖勻放置15分鐘，以用紫外分光光度法，于波長500mn處測定吸光度，隨行試劑空白，測定3次，繪製標準曲線。結果如表l所示，以蘆丁標準品的濃度(mg/ml)為橫坐標x，吸光度為縱坐標y，繪製標準曲線，得回歸方程y=10.925x+0.00i7，r=0.9998。表1不同濃度蘆丁的紫外分光光度法測定結果tableseeoriginaldocumentpage42、樣品中總黃酮的測定取本發明所得總黃酮用甲醇溶解作為待測樣品溶液于波長500nm處測定吸光度y，代入標準曲線方程y=10.925x+0.0017計算樣品中總黃酮的濃度x。二、工藝參數對提取效果的影響1.上柱時藥材量與溼樹脂的不同比例對提取效果的影響1.1樹脂的預處理以95%乙醇浸泡FL-1型樹脂24h，充分溶脹後，除去上浮樹脂碎片和雜物，用溼法裝柱，繼續用95%乙醇以適當流速通過樹脂柱，洗至流出液與水(l:5)混合不呈渾濁，再用水洗至無醇味，備用。1.2上柱溶液的製備稱取番石榴葉粗粉適量，10倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1h。兩次提取液合併，減壓回收乙醇至無醇味，加入適量熱水，抽濾，即得上柱溶液。1.3藥材上樣量的確定準確稱取2、4、6、8g已處理好的FL-1型大孔吸附樹脂，分別以溼法裝柱(12cmX20cm),精密吸取10ml上柱溶液(藥材濃度為0.2g/ml，總黃酮濃度為13.22mg/邁l)，以流速2ml/min上柱，過柱液重吸附一次，經充分吸附後，收集吸附後的樣品液，採用上述報告一中所述總黃酮純度的測定方法測定其中總黃酮的濃度，計算吸附量及吸附百分率，結果見表2。表2不伺比例的藥材與樹脂對提取效果的影響吸附後濃度tableseeoriginaldocumentpage5從表2可以看出，當藥材量溼樹脂量=1:i4時，大孔樹脂對總黃酮的吸附量可達67%以上，其中比例為1:4時效果最佳，吸附量高達92.42%。2.洗脫時不同乙醇濃度對提取效果的影響2.1上柱液的製備取番石榴葉250g，10倍量70%乙醇煎煮2次，每次lh。合併提取液，過濾，回收乙醇，濃縮至150ml。2.2大孔樹脂分離將上述上柱液分為6組，每組25ml，分別以1ml/min的流速通過填充有F-l樹脂(2cmX45cm)的層析柱，然後用水洗至無色，再用相當於裝柱體積5倍的0.l呢NaOH洗脫，最後16組分別用30%、40%、50%、60%、70%和80%的乙醇洗脫，洗脫流速為2ml/min，收集乙醇洗脫液，80。C水浴濃縮至幹，得番石榴葉總黃酮粗品。採用上述報告一中所述總黃酮純度的測定方法測定該樣品中總黃酮的量，結果如表3所示。表3乙醉濃度對提取效果的影響(n=3)tableseeoriginaldocumentpage5從表3可以看出，總黃酮的收率和洗脫時所用乙醇的濃度密切相關，乙醇濃度小於70%時，總黃酮的收率與乙醇濃度呈遞增關係，當乙醇濃度大於70%時，總黃酮的收率開始有下降的趨勢，當乙醇濃度等於70%時，總黃酮的收率最高，總黃酮的純度也最高。三、本發明方法提取番石榴葉所得的總黃酮治療輪狀病毒性腹瀉的效果試驗1.動物68w齡SPF級BALB-C小鼠(南方醫科大學實驗動物中心提供，合格證號粵檢證字第2006B023,2006A049號)84隻，體重1822g。2.試劑番石榴葉廣東產桃金孃科番石榴(Psidumguajava)的嫩葉水煎劑，由南方醫科大學中醫系製劑室完成；思密達博福-益普生(天津)製藥有限公司生產，批准文號為國藥準字H20000690;糞便HRV抗原檢測試劑盒，由北京萬泰生物藥業有限公司提供(酶標法)批准文號為S20050030;總黃酮取下述實施例1從番石榴葉中提取得到的總黃酮。3.試驗步驟觀察小鼠84隻，先取小鼠糞便用病毒診斷試劑盒檢測均為陰性，①將84隻小鼠隨機分為7組，每組12隻，即正常對照組、感染對照組、番石榴葉治療組、思密達治療組、總黃酮高劑量組、總黃酮中劑量組、總黃酮低劑量組。除正常組不用病毒灌胃外，其餘每組小鼠給予濃度為1(/TCID輪狀病毒懸液100ul灌胃，第2天小鼠開始出現腹瀉、水樣便、少食等症狀，大便試劑盒檢測陽性。水煎劑組給予番石榴葉水煎劑0.5ml灌胃，思密達組給予思密達0.5ml灌胃，總黃酮高(10mg/ml)、中(20mg/ml)、低劑量組(30mg/ml)分別給予各組相應劑量的總黃酮混懸液0.5ml灌胃，每天1次，連續3天，同時均給予普通飼料及飲水進行飼養。4.試驗結果4.1對小鼠糞鈉、糞糖的影響於治療後採集糞便新鮮樣本，取lg加入2ml蒸餾水，充分攪勻，3000rmp離心3分鐘，取上清液測試；結果見表4:低、中、高劑量組在番石榴葉總黃酮的治療下，輪狀病毒性腹瀉引起的糞鈉、糞糖有明顯的降低，量效關係明確，對正常動物無明顯影響。4.2對小鼠輪狀病毒轉陰率的影響治療前後分別用試劑盒檢測糞便輪狀病毒抗原。檢測步驟取適量糞便樣本放入容器內，加入9倍體積生理鹽水，攪拌混勻2分鐘，靜置或離心後在加樣處滴加34滴糞便上清液，平置於室溫，10分鐘內判斷結果。出現兩條紅線提示為陽性；出現一條紅線提示為陰性；不出現紅色線提示為無效。治療3天後，檢測小鼠糞便中輪狀病毒轉陰率，結果示黃酮高劑量組轉陰ll只(轉陰6率為91.7%),中劑量組轉陰10隻(轉陰率為83.3%),低劑量組轉陰7隻(轉陰率為58.3%)，感染組全部陽性(轉陰率為0)，思密達組轉陰8隻(轉陰率為66.7%)，番石榴葉水煎劑組轉陰9隻(轉陰率為75%)。而總黃酮高、中、低劑量組的小鼠在番石榴葉總黃酮的治療下，輪狀病毒性腹瀉引起輪狀病毒轉陰率有明顯的提高，且量效關係明確。表4各組小鼠糞鈉、糞糖的變化(x±s)tableseeoriginaldocumentpage7具體實施方式例11、利用本發明方法從番石榴葉中提取總黃酮(1)初級加工乾燥取收集來的成熟番石榴葉採用日光曬或烘乾的方法進行乾燥，至含水分《10%;去雜將經過千燥後的番石榴葉經振動分揀篩處理、分離、濾去非金屬雜質；粉碎將經過以上工藝加工的番石榴葉用打碎機進行粉碎，粉碎粒度》100目。(2)粗提稱取番石榴葉粗粉適量，10倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次lh;合併兩次提取液，減壓回收乙醇至無醇味，過濾，即得粗提液。(3)精製將粗提液以2BV/h的上柱流速通過填充有徑高比為1:5的弱極性大孔吸附樹脂的層析柱，上柱時控制藥材量與溼樹脂重量比為1:4,接著用5BV的水洗脫，洗脫流速為2BV/h，再以2BV/h的流速用5BV的濃度為0.1%的氫氧化鈉溶液洗脫，然後用70%乙醇洗脫，洗脫流速為2BV/h,收集乙醇洗脫液，最後將收集所得的洗脫液經減壓乾燥。2、結果鑑定採用常用的中藥幹膏提取物的測算方法以及上述報告一中所述總黃酮純度的測定方法進行測算，本實施例所述方法的總黃酮幹膏得率為30.12%，純度為55.22%。例21、利用本發明方法從番石榴葉中提取總黃酮(1)初級加工乾燥取收集來的成熟番石榴葉採用日光曬或烘乾的方法進行乾燥，至含水分《10。/o;去雜將經過乾燥後的番石榴葉經振動分揀篩處理、分離、濾去非金屬雜質；粉碎將經過以上工藝加工的番石榴葉用打碎機進行粉碎，粉碎粒度》100目。(2)粗提稱取番石榴葉粗粉適量，8倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次lh;合併兩次提取液，減壓回收乙醇至無醇味，過濾，即得粗提液。(3)精提將粗提液以lBV/h的上柱流速通過填充有徑高比為1:3的弱極性大孔吸附樹脂的層析柱，上柱時控制藥材量與溼樹脂重量比為1:1，接著用3BV的水洗脫，洗脫流速為2BV/h，再以3BV/h的流速用6BV的濃度為0.1%的氫氧化鈉溶液洗脫，然後用30%乙醇洗脫，洗脫流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液，最後將收集所得的洗脫液經減壓乾燥。採用實施例1所述方法測得總黃酮幹膏得率為28.43%，純度為47.51%。例31、利用本發明方法從番石榴葉中提取總黃酮(1)初級加工-乾燥取收集來的成熟番石榴葉採用日光曬或烘乾的方法進行乾燥，至含水分《10%;去雜將經過乾燥後的番石榴葉經振動分揀篩處理、分離、濾去非金屬雜質；粉碎將經過以上工藝加工的番石榴葉用打碎機進行粉碎，粉碎粒度》100目。(2)粗提稱取番石榴葉粗粉適量，10倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次ih;合併兩次提取液，減壓回收乙醇至無醇味，過濾，即得粗提液。(3)精提將粗提液以4BV/h的上柱流速通過填充有徑高比為1:9的弱極性大孔吸附樹脂的層析柱，上柱時控制藥材量與溼樹脂重量比為1:4;接著用9BV的水洗脫，洗脫流速為4BV/h，再以lBV/h的流速用4BV的濃度為0.1%的氫氧化鈉溶液洗脫，然後用90°/。乙醇洗脫，洗脫流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；最後將收集所得的洗脫液經噴霧乾燥。採用實施例1所述方法測得總黃酮幹膏得率為32.51%,純度為54.18%。例41、利用本發明方法從番石榴葉中提取總黃酮(1)初級加工-乾燥取收集來的成熟番石榴葉採用日光曬或烘乾的方法進行乾燥，至含水分《10%;去雜將經過乾燥後的番石榴葉經振動分揀篩處理、分離、濾去非金屬雜質；粉碎將經過以上工藝加工的番石榴葉用打碎機進行粉碎，粉碎粒度》100目。(2)粗提稱取番石榴葉粗粉適量，9倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1h;合併兩次提取液，減壓回收乙醇至無醇味，過濾，即得粗提液。(3)精提將粗提液以3BV/h的上柱流速通過填充有徑高比為1:7的弱極性大孔吸附樹脂的層析柱，上柱時控制藥材量與溼樹脂重量比為1:3;接著用6BV的水洗脫，洗脫流速為3BV/h，再以2BV/h的流速用5BV的濃度為0.1%的氫氧化鈉溶液洗脫，然後用50%乙醇洗脫，洗脫流速為3BV/h,收集乙醇洗脫液，最後將收集所得的洗脫液經噴霧乾燥。採用實施例1所述方法測得總黃酮得率為29.82%，純度為51.26%。對比例按照發明專利申請(申請號為200610041855.4)"—種從番石榴葉中提取黃酮類化合物"的方法提取番石榴葉中的總黃酮(l)將經過乾燥、去雜和粉碎的番石榴葉溶於5倍90%100%酒精，真空提取3040min，按上述工藝將番石榴葉重複提取34次，然後在'常壓、110'C12(TC的條件下濃縮成浸膏，冷卻，回收乙醇；(2)將除去乙醇後的浸膏用離心的方法分離出固體，然後用氯仿在45'C55'C下脫脂4560min，最後烘千，即可。採用實施例1所述方法測得總黃酮幹膏得率為44.82%，純度為37.12權利要求1、一種從番石榴葉中提取總黃酮的方法，該方法由以下步驟組成(1)將番石榴葉乾燥、去雜，然後粉碎至粒度≥100目；(2)將經過步驟(1)加工的番石榴葉粉用8～10倍70％乙醇回流提取2～4次，每次1～3h；合併提取液，然後80℃下加熱濃縮至無醇味，過濾，得粗提液；(3)按製備粗提液所用番石榴葉與溼樹脂的重量比為1∶1～4，將粗提液以1～4BV/h的流速通過填充有徑高比為1∶3～9的弱極性大孔吸附樹脂的層析柱，接著先以2～4BV/h的流速用3～8BV的水洗脫，再以1～3BV/h的流速用4～6BV的濃度為0.1％的氫氧化鈉溶液洗脫，最後以2～4BV/h的流速用30～90％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；(4)將所得的乙醇洗脫液經減壓或噴霧乾燥，即可。2、如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(3)中所述的溼樹脂的用量為製備粗提液所用番石榴葉與溼樹脂的重量比為1:4。3、如權利要求l所述的方法，其特徵在於步驟(3)中洗脫用的乙醇濃度為70%。全文摘要本發明提供了一種從番石榴葉中提取總黃酮的方法，該方法是取乾燥、除雜和粉碎後的番石榴葉用70％乙醇回流提取，將提取液濃縮後上弱極性大孔樹脂層析柱，先用水和鹼洗脫將水溶性雜質除去，然後用30％～90％的乙醇洗脫吸附在大孔樹脂中的黃酮類化合物，收集乙醇洗脫液，乾燥，即可。利用本發明方法所得番石榴葉總黃酮提取物的得率可高達20～32％，提取物中總黃酮的含量高達50％左右。文檔編號A61P1/12GK101297865SQ20081002886公開日2008年11月5日申請日期2008年6月17日優先權日2008年6月17日發明者強劉,周迎春,陳寶田申請人:南方醫科大學