結合基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測的方法
2023-05-26 06:59:06
專利名稱：結合基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測的方法
技術領域：
本發明涉及一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測的方法。
背景技術：
植物microRNA是一類20-24鹼基長的非編碼RNA，是重要的基因調控元件[10]。 裝載到RNA引導沉默複合體(RISC)後，植物microRNA會引導與其高度互補的靶基因mRNA 在互補位點的切割，降低靶基因的表達水平[10]。靶基因中大部分編碼轉錄因子，這使得植 物microRNA的調控範圍幾乎遍及整個基因組[12]。因此microRNA在植物的多種生物過程 中都起到了重要作用，包括植物發育、應激反應以及microRNA途逕自身[12]。對植物microRNA的研究發現了大量的植物microRNA，在此基礎上建立了專門的 microRNA資料庫[9，19]。miRBase是一個綜合的microRNA資料庫，包含了動植物中已經 發表的microRNA，提供了 microRNA序列、前體序列、前體二級結構、基因組上下文及參考文 獻等信息[9]。PMRD是一個專門的植物microRNA資料庫，涵蓋了更多的植物物種，並包含 了大量預測到的無實驗驗證的micr0RNA[19]。對於水稻和擬南芥等有mRNA序列數據的物 種，PMRD還列出了預測到的靶基因[19]。作為重要的模式生物，水稻和擬南芥有大量的生物信息學資源，包括詳細注釋的 基因組序列，多態性數據，以及大量的高通量測序數[7，11，13-17]。這些數據中，很多可以 用於植物microRNA的研究。用測序數據或者微陣列實驗，探測到了水稻和擬南芥亞種間大量的單核苷酸多態 性(SNP) [7，13，15]。microRNA前體的SNP會影響microRNA前體的摺疊，進而影響到DCLl 對microRNA前體的識別與切割[10]。microRNA成熟體或者靶基因結合位點的SNP會改變 microRNA與靶基因mRNA的互補程度，從而改變microRNA對mRNA的切割效率[10]。可以 利用SNP數據來研究SNP在microRNA途徑層次對亞種間差異的貢獻。大規模並行信號測序(MPSS)是一種研究基因表達的高通量測序技術，水稻和擬 南芥有大量的MPSS數據[14]。植物microRNA是獨立的轉錄單元，與蛋白編碼基因一樣 由RNA 二型聚合酶轉錄，具有5』帽和3』聚腺苷酸尾[10]。因此，可以用MPSS數據來分析 microRNA基因的表達。另外，MPSS的轉錄信號可以為microRNA基因的轉錄區間及基因模 型提供參考。RNA末端並行分析(PARE)是一種降解組高通量測序技術，測定有聚腺苷酸尾的3』 端切割產物的5』端序列，水稻和擬南芥也有大量的PARE數據[14]。植物microRNA與靶基 因mRNA高度互補，主要引導靶基因mRNA的切割，切割產物能被PARE技術探測到[8]。因 此，PARE數據可以用於microRNA對靶基因mRNA切割作用的分析。另外，microRNA的生物 發生需要DCLl的切割，microRNA也可能引導microRNA前體自身的切割，可以用PARE數據 來分析這些切割作用[8]。
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發明內容
本發明的目的是提供一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預 測的方法。基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測的方法包括如下步驟1)收集植物microRNA和基因組數據；
2)處理植物microRNA數據；3)使用miRU預測植物microRNA的靶位點；4)收集PARE信號數據；5)建立PmiPKB資料庫的「MiR-Tar」模塊；6)利用PARE信號數據驗證植物microRNA靶位互作關係；7)構建植物microRNA靶位互作網絡。所述的收集植物microRNA和基因組數據步驟為水稻和擬南芥的microRNA數據 來自於版本15的miRBase，其中，水稻有成熟體序列498條，前體序列449條，擬南芥有成熟 體序列224條，前體序列199條，水稻的基因組數據來自於版本6. 1的TIGR，擬南芥的基因 組數據來自於版本9的TAIR。
所述的處理植物microRNA數據步驟為miRBase的microRNA數據為EMBL格式， 基因組坐標數據為GFF格式，使用PERL腳本解析這些數據，將其存入資料庫，所有的序列均 轉換成大寫字母。所述的使用miRU軟體預測植物microRNA的靶位點步驟為分別輸入水稻的 microRNA和水稻基因組數據，選擇miRU軟體的默認參數，然後對水稻microRNA的基因靶 位點進行預測；分別輸入擬南芥的microRNA和擬南芥基因組數據，選擇miRU軟體的默認參 數，然後對擬南芥microRNA的基因靶位點進行預測。所述的收集PARE信號數據步驟為PARE信號數據來自NGSD的10個數據集和 Yongfang Li的1個數據集，原數據進行歸一化處理。所述的建立PmiPKB資料庫的「MiR-Tar」模塊步驟為用SVG圖形表示microRNA 基因附近的PARE信號數據。圖示的範圍為microRNA前體基因組坐標左右共一萬鹼基對， 數據集縱向排列，方便用戶進行比較。所述的利用PARE信號數據驗證植物microRNA靶位互作關係步驟為使用PmiRKB 資料庫中的「MiR-Tar」模塊，圖形化輸出含PARE信號數據的全部靶位點互作關係，共計 8253對，再進行人工篩選校正，最終獲得3077對可靠性較高的microRNA靶位互作關係。所述的預測植物microRNA靶位互作網絡步驟為將獲得的3077對可靠性較高的 microRNA靶位互作關係存儲到以tab鍵分隔的文本文件中，利用NeAT將該文本文件轉化為 通用的GML網絡格式文件，使用yED網絡可視化工具對這3077對microRNA靶位互作關係 進行可視化處理，構建出植物microRNA靶位互作網絡。本發明整合了水稻、擬南芥的RNA末端並行分析數據，提供了映射到靶基因mRNA 與microRNA結合位點附近的PARE信號信息，可用於鑑別預測的microRNA-target mRNA 之間是否存在真實的切割調控關係；來自不同組織材料的PARE數據集間可以進行比較 以揭示這種調控關係的組織特異性。此外，又整合了已有的PARE數據，提供了映射到 pre-microRNA上的PARE信號情況，可用於監測DCLl對pri-或pre-microRNA的加工情況， 以及microRNA或microRNA*對其microRNA前體的自切割作用，組織間的差異依然可以通 過跨庫比較來觀察到。最後對水稻和擬南芥現有microRNA靶位互作關係進行人工篩選校 正，獲得3077對可靠性較高的microRNA靶位互作關係，構建了網絡模型並進行網絡可視化 處理，此網絡模型具有相當高的可靠性。
圖1是PmiRKB資料庫簡要的ER圖；圖2是PmiRKB資料庫的「MiR-Tar」模塊中使用PARE信號數據驗證擬南芥miR156h 對AT5G50570. 1的切割；圖3是預測到的水稻microRNA靶位互作網絡局部示意圖；圖4是預測到的擬南芥microRNA靶位互作網絡局部示意圖。
具體實施例方式基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測的方法包括如下步驟1)收集植物microRNA和基因組數據；
2)處理植物microRNA數據；3)使用miRU預測植物microRNA的靶位點；4)收集PARE信號數據；5)建立PmiPKB資料庫的「MiR-Tar」模塊；6)利用PARE信號數據驗證植物microRNA靶位互作關係；7)構建植物microRNA靶位互作網絡。所述的收集植物microRNA和基因組數據步驟為水稻和擬南芥的microRNA數據 來自於版本15的miRBase，數據包括了 microRNA名稱、microRNA序列、前體名稱、前體序 列、前體的基因組坐標以及參考文獻。其中，水稻有成熟體序列498條，前體序列449條，擬 南芥有成熟體序列224條，前體序列199條，一條前體可能對應有多條成熟體。水稻的基因 組數據來自於版本6. 1的TIGR，擬南芥的基因組數據來自於版本9的TAIR。所述的處理植物microRNA數據步驟為miRBase的microRNA數據為EMBL格式， 基因組坐標數據為GFF格式，使用PERL腳本解析這些數據，將其存入資料庫，所有的序列 均轉換成大寫字母。水稻的MIR156f和MIR531前體都對應有兩個基因組坐標，為了簡 化資料庫結構，將對應於不同基因組坐標的同一前體分作多個前體來表示MIR156f(l)、 MIR156f (2)、MIR531 (1)和 MIR531 (2)。對於未給出 microRNA* 序列的 microRNA，根據前體 的二級結構，選擇microRNA*序列使雙鏈體3』端有兩個鹼基的突出[10]。所述的使用miRU軟體預測植物microRNA的靶位點步驟為分別輸入水稻的 microRNA和水稻基因組數據，選擇miRU軟體的默認參數，然後對水稻microRNA的基因靶 位點進行預測；分別輸入擬南芥的microRNA和擬南芥基因組數據，選擇miRU軟體的默認參 數，然後對擬南芥microRNA的基因靶位點進行預測。所述的收集PARE信號數據步驟為RNA末端並行分析(PARE)是一種降解組高通 量測序技術，PARE信號數據可以用於microRNA對靶基因mRNA切割作用的分析。PARE信號 數據來自NGSD的10個數據集和Yongfang Li的1個數據集，原數據進行歸一化處理，即利 用資料庫提供的算術運算對原數據進行歸一化處理，即將各個序列的讀數除以所在數據集 的總讀數，再乘以一百萬，得到序列的RPM(數據集每百萬讀數中序列的讀數)。所述的建立PmiPKB資料庫的「MiR-Tar」模塊步驟為用SVG圖形表示microRNA基 因附近的PARE信號數據。圖示的範圍為microRNA前體基因組坐標左右共一萬鹼基對，由於 範圍太大，在圖示的上方給出了縮略圖與可移動的窗口，通過JavaScript實現移動窗口查 看詳細信息的功能。PARE序列的RPM用不透明度表示，在滑鼠指到序列時顯示出該序列具 體的基因組坐標和RPM值。數據集縱向排列，方便用戶進行比較。在其中表示出microRNA 與靶基因mRNA間的配對，圖示範圍為mRNA上microRNA結合位點左右共約120鹼基對。對 於唯一映射到該位點的PARE序列，在表示信號的矩形外加邊框，以示區別。所述的利用PARE信號數據驗證植物microRNA靶位互作關係步驟為使用PmiRKB 資料庫中的「MiR-Tar」模塊，圖形化輸出含PARE信號數據的全部靶位點互作關係，共計 8253對，再進行人工篩選校正，最終獲得3077對可靠性較高的microRNA靶位互作關係。所述的預測植物microRNA靶位互作網絡步驟為將獲得的3077對可靠性較高的 microRNA靶位互作關係存儲到以tab鍵分隔的文本文件中，利用NeAT將該文本文件轉化為 通用的GML網絡格式文件，使用yED網絡可視化工具對這3077對microRNA靶位互作關係
8進行可視化處理，構建出植物microRNA靶位互作網絡。實施例1.數據來源水稻和擬南芥的microRNA數據來自於miRBaSe[9]，版本為15。數據包括了 microRNA名稱、microRNA序列、前體名稱、前體序列、前體的基因組坐標以及參考文獻。其 中，水稻有成熟體序列498條，前體序列449條；擬南芥有成熟體序列224條，前體序列199 條。一條前體可能對應有多條成熟體。水稻microRNA前體的基因組坐標基於TIGR6.0偽 分子，擬南芥microRNA前體的基於TAIR9基因組。水稻的基因組數據來自於TIGR[16]，版 本為6. 1。版本6. 1與6. 0僅有少數基因分類不同，因此miRBase提供的水稻microRNA前 體的基因組坐標適用於TIGR6. 1。擬南芥的基因組數據來自於TAIR，版本為9。(見表1)水稻的SNP 數據涉及 了 21 個亞種93-11、Nipponbare, Tainung 67、 Li-Jiang-Xin-Tuan-Hei-Gu> M 202、Azucena、Moroberekan> Cypress、Dom-Sufid> N 22、 Dular、FR13A、Aswina、Rayada>IR64-21、Shan-Huang Zhan-2、Pokkali、Swarna>Sadu-Cho> Minghui 63和Zhenshan 97B。其中Nipponbare為參考亞種。亞種93-11的SNP數據來自 於基因組的序列聯配，原數據提供了 SNP周圍共41鹼基長的序列用於定位[7]。其餘亞種 與Nipponbare間的SNP數據由重測序微陣列技術，結合基於模型(MB)或機器學習(ML)的 計算方法測定[13]。原數據提供了 SNP的TIGR5偽分子坐標和周圍共201鹼基長的序列， 可以用這些序列將SNP定位到TIGR6. 1上。取MB和ML方法的交集，以保證數據的高可靠 性。擬南芥的 SNP 數據涉及了 7 個亞種=Col-O,Bur-0,Tsu-ULer-UBay-O,Sha 和 Cvi-O0 其中Col-O是參考亞種。這些亞種的SNP數據來自TAIR的Polymorphism資料庫，原數據 直接提供了 SNP的TAIR9基因組坐標[15]。水稻和擬南芥的MPSS數據主要來自於NGSD (Next-Gen Sequence Database)的35 個數據集[14]。原數據提供了每一個序列標籤的讀數，需要歸一化處理以便進行數據集間 的對比。另外，Guojie Zhang等人用高通量方法得到的水稻亞種93-11的轉錄組數據，共2 個數據集，與MPSS數據類似，同樣適合做microRNA基因轉錄的分析[17]。因此，可以將這 2個數據作為MPSS數據進行處理。PARE數據主要來自NGSD的10個數據集[14]，原數據需要歸一化處理。另外， Yongfang Li等人的水稻降解組數據，共1個數據集，與PARE數據類似，也可以用來分析 microRNA引導的mRNA切割[11]。因此，把這一數據集作為PARE數據進行處理，構建出植 物microRNA靶位互作網絡。(見表2)表1 植物microRNA及基因組的數據來源
權利要求
一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測的方法，其特徵在於，包括如下步驟1)收集植物microRNA和基因組數據；2)處理植物microRNA數據；3)使用miRU預測植物microRNA的靶位點；4)收集PARE信號數據；5)建立PmiPKB資料庫的「MiR Tar」模塊；6)利用PARE信號數據驗證植物microRNA靶位互作關係；7)構建植物microRNA靶位互作網絡。
2.如權利要求1所述的一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預 測的方法，其特徵在於，所述的收集植物microRNA和基因組數據步驟為水稻和擬南芥的 microRNA數據來自於版本15的miRBase，其中，水稻有成熟體序列498條，前體序列449條， 擬南芥有成熟體序列224條，前體序列199條，水稻的基因組數據來自於版本6. 1的TIGR， 擬南芥的基因組數據來自於版本9的TAIR。
3.如權利要求1所述的一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測 的方法，其特徵在於，所述的處理植物microRNA數據步驟為=HiiRBase的microRNA數據為 EMBL格式，基因組坐標數據為GFF格式，使用PERL腳本解析這些數據，將其存入資料庫，所 有的序列均轉換成大寫字母。
4.如權利要求1所述的一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測 的方法，其特徵在於，所述的使用miRU軟體預測植物microRNA的靶位點步驟為分別輸入 水稻的microRNA和水稻基因組數據，選擇miRU軟體的默認參數，然後對水稻microRNA的 基因靶位點進行預測；分別輸入擬南芥的microRNA和擬南芥基因組數據，選擇miRU軟體的 默認參數，然後對擬南芥microRNA的基因靶位點進行預測。
5.如權利要求1所述的一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測 的方法，其特徵在於，所述的收集PARE信號數據步驟為PARE信號數據來自NGSD的10個 數據集和Yongfang Li的1個數據集，原數據進行歸一化處理。
6.如權利要求1所述的一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測 的方法，其特徵在於，所述的建立PmiPKB資料庫的「MiR-Tar」模塊步驟為用SVG圖形表示 microRNA基因附近的PARE信號數據。圖示的範圍為microRNA前體基因組坐標左右共一萬 鹼基對，數據集縱向排列，方便用戶進行比較。
7.如權利要求1所述的一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測 的方法，其特徵在於，所述的利用PARE信號數據驗證植物microRNA靶位互作關係步驟為 使用PmiRKB資料庫中的「MiR-Tar」模塊，圖形化輸出含PARE信號數據的全部靶位點互作 關係，共計8253對，再進行人工篩選校正，最終獲得3077對可靠性較高的microRNA靶位互 作關係。
8.如權利要求1所述的一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測 的方法，其特徵在於，所述的預測植物microRNA靶位互作網絡步驟為將獲得的3077對可 靠性較高的microRNA靶位互作關係存儲到以tab鍵分隔的文本文件中，利用NeAT將該文 本文件轉化為通用的GML網絡格式文件，使用yED網絡可視化工具對這3077對microRNA靶位互作關係進行可視化處理，構建出植物microRNA靶位互作網絡。
全文摘要
本發明公開了一種基於下一代測序數據的植物microRNA靶位互作網絡預測的方法。它包括如下步驟1)收集植物microRNA和基因組數據；2)處理植物microRNA數據；3)使用miRU預測植物microRNA的靶位點；4)收集PARE信號數據；5)建立PmiPKB資料庫的「MiR-Tar」模塊；6)利用PARE信號數據驗證植物microRNA靶位互作關係；7)構建植物microRNA靶位互作網絡。本發明整合了水稻、擬南芥的RNA末端並行分析數據，提供了映射到靶基因mRNA與microRNA結合位點附近的PARE信號信息，可用於鑑別預測的microRNA-target mRNA之間是否存在真實的切割調控關係；來自不同組織材料的PARE數據集間可以進行比較以揭示這種調控關係的組織特異性。對水稻和擬南芥現有microRNA靶位互作網絡進行預測，並人工進一步篩選得到最終網絡模型，具有相當高的可靠性。
文檔編號C12Q1/68GK101976296SQ20101028168
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月10日 優先權日2010年9月10日
發明者克裡斯汀·克魯卡斯, 孟一君, 白琳, 苟凌峰, 陳迪俊, 陳銘, 黃冬林 申請人:浙江大學