酯醯還原酶的製作方法

2023-05-30 12:25:21

專利名稱：酯醯還原酶的製作方法
本申請是USSN 07/796，256(1991年11月20日申請)和USSN 07/767，251(1991年9月27日申請)的部分後續申請，而上述後一申請又是USSN 07/659，975(1991年2月22日)的部分後續申請。
本發明涉及植物酶，純化及獲得這些酶和與其相關的胺基酸和核酸序列的方法，以及使用這些組合物的方法。
脂肪酸是具有約4-24個碳原子的碳烴鏈的有機酸。已知許多不同種類的脂肪酸其鏈的長度以及是否存在雙鍵，其數量和位置不同。在細胞中，脂肪酸通常以共價鍵形式存在，羧基部分被稱作脂醯基。這些分子的鏈長度與飽和度經常以通式CX∶Y表示，其中X是指碳原子，Y是指雙鍵數。由於脂醯分子的碳鏈總是含有偶數碳原子，所以也可以用通式「C2X」表示碳鏈長度。
脂醯基是很多脂的主要成分，其長的、非極性烴鏈造成了這些脂分子的水不溶性。脂醯基與其他因子共價鍵合的類型是可以變化的。例如，在生物合成反應中它們可以通過硫酯鍵，按照特定的酶促反應與醯基載體蛋白(ACP)或者與輔酶A(CoA)共價鍵合。在蠟中，脂醯基通過酯鍵與脂肪醇連接，而三醯基甘油具有三個脂醯基，它們通過酯鍵與甘油分子連接。
我們已經對很多能貯存脂例如主要由長鏈(具有16或18個碳)脂醯基構成的三醯基甘油的植物進行了研究。特定長鏈的(具有20-24個碳)單不飽和脂醯基是通過醯基輔酶A的延長作用從C18∶1形成的，並且在很多植物種子，特別是十字花科成員中發現了它們。沙漠灌木，Simmondsia chinensis，更好稱為希蒙德木，是較高級植物(產生種子的植物)中唯一能夠產生並貯存大量液體蠟的，這些液體蠟是其種子貯存脂的主要成分。這些簡單的蠟化合物是特殊長鏈單烯脂醯基與醇的氧酯。
其他類型的蠟可以由某些種的植物形成。植物合成的表皮或上皮蠟，以及由細菌例如不動細胞屬(Fixter et al.(1986)J.Gen.Microbiol.132∶3147-3157)和微球菌屬(Lloyd(1987)Microbios 52∶29-37)，以及由單細胞綠藻，眼蟲屬合成的蠟是眾所周知的。但是，這些蠟的組成及生物合成途徑不同於希蒙德木種子蠟。
例如在眼蟲屬貯存蠟的形成中，已經證實醇部分是由脂醯輔酶A還原酶催化脂醯化合物的依賴於NADH的還原反應形成的。在希蒙德木種子中，該反應是依賴於NADH的。可以假定特殊長鏈的脂醯輔酶A還原成相應的醇依賴於一種單一的酶，其活性已經在發育中的希蒙德木種子的粗提取物中發現(Pollard等人(1979)Lipids 14∶651-662;Wu等人(1981)Lipids 16∶897-902)。通過對植物上皮蠟的形成進行比較，還報導了一種兩步法(Kolattukudy(1980)，The Biochemistry of plants(Stumpf，P.K.和Conn，E.E.eds)第4卷第571-645頁)。通過NADH依賴性還原酶作用，脂醯輔酶A轉化成為游離的醛，隨後通過NADPH依賴性脂肪醛還原酶作用形成醇。
由於缺乏識別與酶活性有關的多肽的方案，因而阻礙了對形成植物中蠟酯的酶的進一步表徵。因此需要進一步研究植物脂醯還原酶蛋白以設計一種純化方案，從而可以識別還原酶多肽。通過建立這些方法，可以得到足量的植物脂醯還原酶蛋白，並可以測定該蛋白質的胺基酸序列和/或可以得到脂醯還原酶的特異性抗體。所得到的胺基酸序列可以用於聚合酶鏈反應(PCR)技術或用於篩選cDNA或基因庫。或者，抗體可用於篩選表達基因庫以識別表達脂醯還原酶蛋白的克隆。可以對以此方式獲得的克隆進行分析以識別出與植物脂醯還原酶相對應的核酸序列。
已有報導，發育中的希蒙德木胚胎的無細胞勻漿具有NADPH依賴性脂醯輔酶A還原酶活性。其活性物結合到差速離心所形成的浮動的蠟墊中(Pollard等人(1979)上文;Wu等人(1981)上文)。
Karplus等人描述了在已知的結合了二核苷酸的幾倍數種還原酶蛋白中保存的功能性殘基(Science(1991)251∶60-66)。
Wildner和Hallick報導了Euglena gracilis中具有脂醯輔酶A還原酶活性的多酶複合物的增溶作用(摘自The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting.April 22-24，1990，Las Cruces，NM)。
Pushnik等人報導了純化3000倍的希蒙德木還原酶蛋白(摘自The Southwest Consortium Fourth Annual Meeting，1989年2月7日，Riverside，Ca.)。


圖1提供了希蒙德木脂醯還原酶的核酸序列和轉譯的胺基酸序列。
通過本發明，提供了部分純化的脂醯還原酶蛋白，其中所述蛋白在從脂醯底物形成脂肪醇中是有活性的。本發明的還原酶對於各種脂醯底物包括醯基輔酶A和醯基-ACPs是有活性的。儘管所給出的還原酶優選作用特定鏈長度的醯基底物或者它可以對具有很寬範圍碳鏈長度的醯基底物具有活性，這些底物的碳鏈長度仍是可以改變的。
儘管可以對其他醯基底物進行實驗並進一步發現活性，但是通常本發明還原酶至少對具有16-24碳鏈長度的那些醯基底物具有活性，該碳鏈長度可以用通式「C2X」表示，其中，「X」是8-12的數。另外，由於獲得了本發明的還原酶蛋白，可以使用如下文中進一步詳述的其它的操作方法。利用這些操作可以產生或發現其他有關的還原酶。
因此，第一方面，本發明涉及證明脂醯還原酶酶促活性的蛋白質製劑，並且以種子植物的蛋白質製劑舉例說明。通過分離希蒙德木胚芽以產生微粒體膜製劑、使該膜製劑中的還原酶蛋白質溶解並通過色譜法進一步純化得到上述製劑。儘管希蒙德木還原酶對其他醯基底物也具有活性，但是優先作用於特定長鏈的醯基輔酶A底物，並且已證實它是NADPH依賴性的。
通過這些方法，得到含有兩種重要多肽的部分純化的還原酶製劑，這兩種多肽在聚丙烯醯胺凝膠上遷移成雙帶，其表觀分子量約為54和52KD。因此提供了通過從種子植物源純化獲得醯基還原酶蛋白的方法，以及獲得這些還原酶蛋白的胺基酸序列的方法。
本發明的另一方面是考慮與本發明還原酶有關的核酸序列。我們將描述這些方法，以識別這些序列，並從本發明還原酶蛋白的胺基酸序列得到這些核酸序列。本文描述了使用該結構基因序列分離其他還原酶序列，以及構建於重 組構件中以在宿主細胞中轉錄還原酶核酸序列和/或表達還原酶蛋白。本發明還考慮了使用其它與還原酶蛋白有關的核酸序列，例如使用5′和3′非編碼區。
本發明的再一個方面是考慮含有本發明重組構件的細胞。尤其是考慮那些含有優選的希蒙德木還原酶底物的細胞，例如在芸苔屬植物胚胎中的細胞。
另外，本發明考慮了由本發明重組構件表達的含有本發明還原酶蛋白的細胞。因此，本發明中也考慮了在宿主細胞中表達這種蛋白，回收而得到的還原酶蛋白。進一步可以認識到本發明的還原酶可用於在這些宿主細胞中生產脂肪醇。
本發明的脂醯還原酶包括任何能催化脂醯基還原成相應的醇的胺基酸序列，例如蛋白質，多肽或肽片段。脂醯基是指任何與載體例如ACP或輔酶A共價結合的脂醯基。
由於該酶促反應包括可通過兩步進行的4個電子還原過程，所以脂醯基還原成醇可以需要或不需要其他的酶。第一步可以將醯基轉化成醛，然後將醛還原成相應的醇。因此，本發明的還原酶可以在從脂醯基至醇的整個4電子還原中具有活性，或者可以催化還原反應形成醛，然後由第二種酶將醛進一步還原成為醇。所得到的證據進一步表明，由單一的酶進行了醯基輔酶A至醇的整個還原過程。本發明的脂醯還原酶在下文中又稱作「醯基還原酶」或「還原酶」。
因此，本發明涉及能使脂醯基轉化成為醇的種子植物脂醯還原酶。更具體地說，本發明涉及NADPH依賴性還原酶。另外，值得注意的是，本發明的植物脂醯還原酶對脂醯輔酶A或脂醯-ACP兩種分子都具有活性，並且發現其活性依賴於所用的底物。但是，我們希望對於脂肪酸合成酶(FAS)醯基輔酶A延長途徑的操作，該活性對特殊長鏈醯基輔酶A底物是優先的。
通過本發明測定了種子植物脂醯還原酶蛋白是完整的膜蛋白。通常與膜有關的蛋白是難於純化的，因為將它們溶解時即從其具有正常功能的膜環境中分離時，它們會失去酶促活性。但是，所獲得的仍然保留其酶促活性的種子植物脂醯還原酶可以進行各種應用，而使用膜結合蛋白不可能具有這些用途。
例如，一旦獲得純化的或部分純化的醯基還原酶蛋白，可以將其固定，並且在還原的吡啶核苷酸再生體系存在下用於反應器系統以製備脂肪醇。進一步說，對還原酶蛋白的研究導致對進一步特徵的位點特異性誘變研究，以改善其催化性質或改變其醯基底物特異性。我們發現具有改變了底物特異性的還原酶可以與其他FAS酶結合使用。例如，優選的中等鏈長(C12-C14)的硫酯酶(見共同申請的美國專利申請07/662，007)和合適的醯基轉移酶可以與改變的還原酶結合使用，以產生中等鏈醇，然後將其酯化成脂肪酸以產生酯。
當使用膜結合蛋白時需要考慮的一個重要因素是蛋白與膜結合的程度。外周及完整膜蛋白都是已知的。外周蛋白在自然狀態下是典型的微親水性，它們與膜只是鬆散地結合，並且容易被溶解。完整蛋白則與此相反，它們具有包埋在脂膜中的高度疏水區，並且如果要保留其酶促活性，通常需要將它們與脂結合。
已經用於溶解完整膜蛋白的技術包括將去汙劑或有機溶劑加入到一種合適的膜成分製劑中。然後可以使用常規的純化技術，例如沉澱、離子交換、凝膠過濾和親合層析，假定所需蛋白仍然保留了功能活性，該活性可以用特定的酶促分析法測定。
為了獲得溶解的蛋白製劑，通常第一步需要具有脂醯還原酶活性的種子植物組織的微粒體膜製劑。標準的微粒體膜製劑利用無細胞勻漿(CFH)的差速離心得到不含完整細胞、胞核及可溶性蛋白的膜成分。(參見例如Moore等人，(1987)Biological Membranes∶A Practical Approach，第37-72頁，eds.Finalay and Evans.)對於油籽，開始的離心步驟通常產生團塊，上清液和浮動的脂墊，然後通過對上清液進一步離心可以回收微粒體部分。
在共同申請的USSN 07/659，975(1991年2月22日申請)中描述了一種方案，通過該方案獲得了含有活性脂醯還原酶蛋白的膜成分，與CFH中成分相比，該膜成分具有良好復原的還原酶活性。在此方法中關鍵的步驟是除去希蒙德木胚芽上的種子表皮，因為我們發現該表皮中含有幹擾酶學測量的因子。該方法在開始的部分方案中使用了高鹽溶液，下面還將描述該步驟，並且在下面的實施例中將進行更詳細的描述。
製備希蒙德木胚芽樣品粉末，將粉末在高鹽(3M NaCl)蔗糖(0.3M)溶液中、以80ml溶液/20gm胚芽的比率進行均化，製備勻漿。然後將勻漿過濾並以100，000Xg的速度離心約1小時，得到團塊、上清液和浮動的脂墊。除去脂墊，收集上清液，並在含有100mM HEPES(pH7.5)、2mM DTT和0.5mM EDTA的1M NaCl溶液中透析。然後將透析液以100，000Xg的速度，優選以200，000Xg的速度離心約1小時，得到團塊DP2，其中含有具有脂醯輔酶A還原酶活性的微粒體膜。
通過設計一種脂醯還原酶的最佳特定分析方法，可以有利於發現微粒體膜製劑中和進一步純化過程中脂醯還原酶活性的進一步特徵。例如，對於希蒙德木使用這樣一種分析法，該方法利用特定長鏈脂醯輔酶A分子作底物，在高鹽(0.2M至0.5M NaCl)條件下進行。已經發現高鹽能顯著增加脂醯輔酶A還原酶的可測活性。該分析方法將在實施例中進行詳細描述。
酶的其他特徵及純化所需的另一重要步驟是獲得溶解的還原酶蛋白，該蛋白是從其天然脂雙層膜環境中分離出來，但是保留了足夠量的可測還原酶酶促活性。通常使用兩親洗滌劑的水溶液將完整膜蛋白從脂雙層中除去，儘管在某些情況下也使用有機溶劑。市售的洗滌劑有很多不同的種類，包括離子型的和非離子型的，它們的離解效應，臨界膠束濃度(CMC)，對酶促活性和進一步純化的影響以及從溶液中除去的難易程度不同。對於本領域的專業人員來說，許多不同的洗滌劑和膜蛋白溶解方法是已知的，這些方法已經由Neugebauer(Methods Enzymol.(1990)182∶239-253)和Hjelmiland(Methods Enzymol.(1990)182∶253-264)綜述。
經常發現，用於使膜蛋白增溶的洗滌劑會抑制所需蛋白的酶促活性。用代表很寬範圍特徵的幾種洗滌劑測試其對希蒙德木脂醯還原酶的溶解性，發現所有洗滌劑都具有抑制作用。但是，由於還原酶活性的表觀洗滌劑抑制作用可以歸因於除不可逆性酶抑制作用外的某些效應，所以對CHAPS引起的可逆性抑制作用進行測定。
儘管洗滌劑CHAPS(3-[(3-乙醇醯氨基丙基)-二甲基-氨]-1-丙磺酸)在高於CMC的濃度時具有很強的抑制作用，我們仍然發現，如果將酶暴露於冰上的CHAPS中，然後恢復至CMC值或低於CMC值的CHAPS濃度，那麼還原酶活性可以完全恢復。因此，還原酶不是被洗滌劑CHAPS不可逆地抑制。已經設計出利用洗滌劑CHAPS使希蒙德木脂醯還原酶活性溶解的方案，通過該方法從微粒體膜製劑中產生約85%的還原酶活性。在實施例2中將詳細討論該方法。同樣可以對其他洗滌劑引起的可逆性表觀還原酶抑制作用進行研究，以識別能夠使希蒙德木或其他候選還原酶的脂醯還原酶活性溶解的其他有用的洗滌劑。
由於獲得了溶解的脂醯還原酶蛋白，因此，目前可以對酶的對底物特異性，對輔助因子的要求以及可能的活性抑制劑這些特性進行進一步試驗。例如已經發現，本發明的希蒙德木脂醯還原酶具有很寬範圍的底物，包括ACP和輔酶A底物。例如已經發現對具有至少16個碳的脂醯-ACP底物具有活性，並且對具有至少18個碳的脂醯輔酶A底物具有活性。優選的是對[C15]-15-二十四碳烯醯基輔酶A(C24∶1)具有活性。
對於候選的植物脂醯還原酶蛋白，還可以進一步濃縮蛋白製劑，例如採用在固定的反應染料上進行的層析。許多這樣的反應染料基質是已知的，包括用於本發明的Cibacron Blue F3GA(Blue A)。通過本發明證明了當用含有約0.2M NaCl、優選的是0.5MNaCl或優選0.4M NaCl的緩衝液載樣時，希蒙德木脂醯還原酶活性結合在柱子上，而同時大於約85%的其他蛋白通過柱子或者被隨後衝洗掉。還證明，通過用含有約1.0M NaCl的緩衝液洗脫Blue A柱，可以回收希蒙德木脂醯還原酶活性物。
通過將從Blue A柱濃縮的蛋白製劑加到填有大小篩析材料的柱(有時也稱凝膠過濾柱)上，對脂醯還原酶活性進一步純化。利用該大小篩析柱還可以估算天然還原酶的大小。尤其是，使用很窄範圍尺寸的柱材料例如Ultragel AcA54或Sephacryl S100可以獲得進一步純化的希蒙德木脂醯還原酶成分。特別令人感興趣的是這樣的方法和緩衝液，利用這些方法和緩衝液可以在一個主峰中回收由大小篩析柱負載的大於約40-60%的還原酶活性物或其等同物。
將大小篩析柱中的還原酶活性物加至親合柱上，可以進一步純化還原酶蛋白。例如，可以將活性成分加至在約0.1M NaCl中的棕櫚醯輔酶A瓊脂糖柱上。然後用含有15mM NaDPH和希蒙德木還原酶輔助因子的緩衝液將約70%的還原酶活性物洗脫。
在純化過程中，還可以對含有本發明脂醯還原酶活性的成分使用其他技術，例如SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳以及隨後染色。用這種方法可以識別具有還原酶活性的這些成分中顯著的多肽帶。例如，在由棕櫚醯輔酶A瓊脂糖柱部分純化的希蒙德木還原製劑中，可以識別出兩條帶，它們代表約53KD的多肽，特別是代表具有54和52KD表觀分子量的多肽，它們佔製劑中蛋白的95%以上。使用不同的標記進行進一步的SDS-PAGE分析表明，這些還原酶蛋白的表觀分子量可以更準確地確定為54和56KD，或者約55KD。
正如本文的大小篩析色譜法所證實的，由於天然還原酶的表觀粒度約為49KD，所以這些帶不能代表一種還原酶的兩個不同的亞單位。更確切地說，還原酶活性是與這些多肽中的一種相關，或者與兩者相關。這些實驗，包括陰離子交換，染料柱，已醯輔酶A親合柱，凝膠過濾，肝素柱以及硫醇相互作用色譜，都沒有獲得其他資料。
由於用於該純化過程的希蒙德木種子是從不同的希蒙德木植物群收集的，因此這些多肽可以代表同一酶的密切相關的變異體，即同功酶。如上所述，利用對兩種多肽的Tryptic消化及胺基酸序列分析，可以使54和52KD帶更具特徵性。
現在使用各種方法都可以回收基本純化的還原酶蛋白。例如，可以進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，並將蛋白轉移至膜支持物上，例如硝基纖維素或聚亞乙烯基二氟(PVDF)。然後可以得到含有被識別蛋白的這些膜的切片，這樣所識別的蛋白就基本上不含其他蛋白。利用本領域已知的和下面實施例所描述的技術，可以將此蛋白從膜上分離，並進行進一步操作，以測定其胺基酸序列。
例如，可以通過下列方法測定胺基酸序列對完整蛋白的N-末端胺基酸區域進行序列分析，或者通過用化學溴化氰消化製備所需蛋白的片段，或者使用蛋白酶通過酶促裂解製備所需蛋白的片段。有用的蛋白酶的例子包括內蛋白酶，lysC、gluC、AspN和胰蛋白酶。然後可以按照本領域專業人員熟悉的方法，對由此方式得到的片段進行純化並進行序列分析。
54和52KD候選多肽的進一步特徵是可以利用的，例如，在大腸桿菌中表達各種蛋白，隨後驗證還原酶活性。其他實驗可以包括免疫分析法，從而製備候選蛋白的特異性抗體，並發現其可以抑制蛋白製劑中的還原酶活性。
此外，需要從所測定的與脂醯還原酶活性相關的蛋白的胺基酸序列中分離核酸序列，以證實識別了脂醯還原酶蛋白，並在宿主細胞(原核或真核)中轉錄該序列和/或表達該蛋白。對於在細胞中表達還原酶需要進行各種操作。例如，如果在原核生物(例如大腸桿菌)中產生高濃度的該蛋白，那麼它就是破壞性的甚至有毒的，因為它嵌入了細胞膜中。因此需要使用弱啟動子低水平表達。或者，如果發現了能夠引起膜嵌入的引導肽，就可以製備只含有能編碼成熟還原酶蛋白的那些核酸序列的構件。以這種方式，可以在大腸桿菌中產生還原酶蛋白。如果大腸桿菌中的還原酶活性不能測定，例如蛋白可能沒有嵌入膜雙層中，那麼可以通過其他方法，例如使用抗體製劑來證實大腸桿菌細胞中存在還原酶蛋白。
由於脂醯還原酶是膜結合蛋白，所以需要在植物細胞中表達候選蛋白以驗證還原酶活性。
利用對植物組織進行電擊穿或轟擊試驗可以完成瞬間表達，從而達到此目的。但是最終需要在植物(例如能產生被該酶識別的底物的芸苔屬成員)中穩定地表達還原酶蛋白。按照這種方法，可以得到脂醯醇產物，它們用於藥物，化妝品、洗滌劑、塑料和潤滑油中。
本發明的還原酶核酸可以是基因組或cDNA，它們可以從cDNA或基因組庫中分離，或者直接從植物DNA中分離。一旦分離出蛋白和/或得到該蛋白的胺基酸序列，那麼基因序列的分離方法就是本領域專業人員已知的。
例如，可以製備分離到的蛋白的抗體，並用於篩選表達文庫，從而識別產生植物脂醯還原酶蛋白或其抗原片段的克隆。或者，可以從胺基酸序列合成寡核苷酸，並用於分離核酸序列。寡核苷酸可適用於PCR以產生核酸片段，然後該核酸片段可用於篩選cDNA或基因組文庫。按照不同的途徑，寡核苷酸可直接用於分析Northern或印跡，以識別有用的探針和雜交條件，在此雜交條件下，這些寡核苷酸可用於篩選cDNA或基因組文庫。
本發明的脂醯還原酶核酸序列包括那些與希蒙德木脂醯輔酶A還原酶蛋白相應的序列，以及能夠從希蒙德木蛋白或核酸序列獲得的序列。「相應的」是指核酸序列，可以是DNA，也可以是RNA，包括編碼希蒙德木脂醯還原酶蛋白或其一部分的核酸序列，存在於所述編碼序列的5′或3′端的調節基因序列[它能指導希蒙德木胚芽中還原酶的轉錄或轉錄和轉譯(表達)]，cDNA中不存在的內含子序列，以及編碼任何前體還原酶蛋白的引導或信號肽的序列，該前體還原酶蛋白對於嵌入內質網膜是需要的，但是在成熟的或加工過的脂醯還原酶中沒有發現。
從希蒙德木序列或蛋白「可以獲得的」序列是指與所需脂肪酸還原酶蛋白相關的核酸序列，它可以從希蒙德木脂醯還原酶胺基酸序列合成，或者在不同的生物體中識別，並且用希蒙德木還原酶核酸序列或所製備的抗希蒙德木還原酶蛋白的抗體作探針進行分離。按照這種方法，可以看出，通過核酸雜交或抗原方法利用希蒙德木序列從所需生物體分離的其他脂醯還原酶序列同樣可以用於分離其他脂醯還原酶。這些通過藉助於希蒙德木還原酶分離種子植物還原酶獲得的還原酶在本發明中也認為是「可獲得的」。
為了分離核酸序列，可以使用質粒或病毒載體以及本領域專業人員眾所周知的技術製備cDNA或基因組庫。用於篩選所需序列的有用的核酸雜交及免疫方法也是本領域專業人員眾所周知的，並且已經由例如Maniatis等人描述(Molecular Cloning∶A Laboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。
通常，利用核酸探針獲得的序列將顯示出在靶序列和所給出的編碼令人感興趣的脂醯還原酶的序列之間具有60-70%序列同一性。當然也可以獲得只有50-60%序列同一性的過長的序列。核酸探針可以是核酸序列過長的片段，也可以是較短的寡核苷酸探針。當使用較長的核酸片段作探針(大於約100bp)時，可以在不太嚴格的條件下進行篩選以從靶樣品獲得這樣的序列，該序列有20-50%不同於(即50-80%序列同源)用作探針的序列。寡核苷酸探針可以比編碼脂醯還原酶的完整核酸序列短，但是它至少應該是約10個，優選至少約15個、更優選至少約20個核苷酸。當使用較短的區域作為較長區域的相對鏈時，需要高度的序列同一性。因此需要識別胺基酸序列高度同一的酶活性位點以設計寡核苷酸探針來檢測同源基因。
為了測定是否可以通過與所給出的序列雜交來分離有關的基因，可以對該序列進行標記以使其可以檢測，通常使用放射性標記，也可以使用其他方法。將標記的探針加至雜交溶液中，用含有所需核酸的濾膜，可以是Northern印跡或Southern印跡，進行培養(以篩選所需的同種來源)，或者用含有cDNA或基因組克隆的濾膜進行培養，以進行篩選。雜交與洗滌條件可以改變，以使探針與所需序列的雜交最佳化。對於相關更遠的序列(不太嚴格的)，可以使用較低溫度或較高鹽濃度的條件進行雜交。如果在不太嚴格的條件存在背景雜交的問題，可以在雜交或洗滌步驟中升高溫度，和/或降低鹽含量，以提高對特定雜交序列的測定。按照Beltz等人討論的方法(Methods in Enzymology(1983)100∶266-285)，雜交和洗滌溫度可以根據估計的探針熔化溫度進行調節。
如上所述已經識別出有用的探針和合適的雜交與洗滌條件後，使用標記的序列和最佳的條件對cDNA或基因組庫進行篩選。首先將此基因組庫接種到固體瓊脂基質平板上，並將DNA結合到合適的膜上，通常是硝基纖維素或尼龍濾膜。然後，用標記的探針與這些濾膜進行雜交，並按照上面描述的方法進行洗滌，以識別含有相關序列的克隆。
為了進行免疫篩選，可以通過用純化的蛋白對兔或鼠注射來製備希蒙德木脂醯還原酶的抗體，這些製備抗體的方法是本領域專業人員眾所周知的。儘管通常多克隆抗體更有利於基因分離，但是可以製備單克隆抗體，也可以製備描述多克隆抗體。
為了篩選所需的植物品種，進行Western分析，測定存在於所需植物的粗提取物中的相關蛋白，這些蛋白與希蒙德木還原酶的抗體進行交叉反應。通過將植物提取物蛋白固定於膜上，通常為硝基纖維素，然後進行電泳，並用抗體進行培養，來完成此分析。為了檢測硝基纖維素濾膜上的抗體/蛋白複合物，可以使用很多不同的體系，包括放射標記的抗體和第二抗體/酶共軛物體系。Oberfelder描述了一些可用的體系(Focus(1989)BRL/Life Technologies，Inc.11∶1-5)。如果發生交叉反應，可以通過篩選代表所需植物品種的表達文庫來分離編碼相關蛋白的基因。如Maniatis等人所述(見上文)，可以用各種市售載體包括λgtll構建表達文庫。
然後使用已知技術，將上述利用DNA雜交或免疫篩選技術識別的克隆進行純化，分離DNA並進行分析。在此方法中，已證實這些克隆編碼相關的脂醯還原酶蛋白。按照與使用希蒙德木還原酶相同的方法，通過使用這些還原酶可以得到其他種子植物的脂醯還原酶。
本領域內任一普通專業人員將會認識到，使用位點特異性突變或PCR這些標準技術，可以對本發明的脂醯還原酶核酸序列進行修飾，或者在產生合成核酸序列的過程中修飾此序列。這些修飾的序列也可以認為是本發明的脂醯還原酶核酸序列。例如，可以改變密碼子中不穩定的位置，以使該核酸序列能編碼同樣的胺基酸序列，或者可以改變密碼子，以使胺基酸被永久替代。在這兩種情況下，肽或蛋白都保持了所需的酶促活性，因此可認為是本發明的一部分。
本發明脂醯還原酶的核酸序列可以是DNA或RNA序列，它們可以從基因組DNA、cDNA、mRNA獲得，也可以全部合成或部分合成。可將該基因序列進行克隆，例如通過從合適的來源中分離基因組DNA，以及利用聚合酶鏈反應(PCR)對所需序列進行擴增和克隆。或者，基因序列可以全部合成或部分合成，特別是當需要提供優選的植物序列時。因此利用所選擇的宿主的優選密碼子可以合成所需結構基因的全部或部分(能編碼還原酶蛋白的基因部分)。宿主優選的密碼子可以從例如最頻繁地用於所需宿主中表達的蛋白中的密碼子測定。
我們將發現與脂醯還原酶蛋白有關的核酸序列有許多用途。例如，可用於製備重組構件可用作探針，或者在宿主細胞中表達脂醯還原酶蛋白。根據其應用，這些構件可以含有編碼整個還原酶或其一部分的序列。例如，可以識別還原酶的重要區域，如活性位點。因此可用於製備只含有部分還原酶序列的進一步的構件，這部分還原酶序列能編碼對所需還原酶活性必需的胺基酸。
為了從相應的脂醯基底物製備脂肪醇，可以在優選含有脂醯還原酶蛋白底物的宿主細胞中表達。表達還原酶蛋白所用的體系包括原核細胞例如大腸桿菌、酵母細胞、以及植物細胞包括存在於所需宿主中的維管和非維管植物細胞。在此方法中，可以產生還原酶蛋白。此外，對編碼序列進行位點特異性誘變可用於研究特異性突變對還原酶蛋白反應性質的影響。
因此可以製備反意義構件，用於轉錄脂醯還原酶編碼序列或其片段的互補序列。在此方法靶宿主生物體中所產生的還原酶蛋白的量可以降低。
本發明編碼脂醯還原酶的DNA序列可以以各種方式與外源DNA序列結合。「外源」DNA序列是指任何非天然存在的與還原酶連接的DNA序列，包括非天然存在的連接在一起的、來自同一生物體的DNA序列的結合物。例如可以將編碼運輸肽的序列與本發明的還原酶序列連接。在此方法中，以還原酶作為葉綠體上的靶，可以利用葉綠體中的脂醯底物、特別是脂醯-ACPs。
可以將本發明的編碼脂醯還原酶的DNA序列與正常情況下與還原酶相關的全部或部分基因序列相結合。在其組成部分中，編碼還原酶的DNA序列結合到一個重組構件中，該重組構件在5′→3′的轉錄方向上含有能夠在一個宿主細胞中啟動轉錄和轉譯的轉錄起始控制區，編碼還原酶的核酸序列以及一個轉錄終止區域。
調節區將根據宿主而改變，它們包括來自病毒，質粒或染色體基因等的區域。對於在原核或真核微生物、特別是單細胞宿主中表達，可以使用各種組成的或可調節的啟動子。在微生物中表達可以提供現成的植物酶來源。所描述的轉錄起始區是來自細菌和酵母宿主例如大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母，包括基因，例如β-半乳糖苷酶、T7聚合酶和色氨酸E等的區域。
對於大多數情況來說，重組構件包括在產生脂醯還原酶的植物中具有功能的調節區域。編碼植物還原酶或其功能片段的開放閱讀框架在其5′末端與轉錄起始調節區連接。轉譯起始區也是需要的，它可以由還原酶cDNA序列的5′非編碼區提供，或者由與該結構的轉錄起始區天然結合的轉譯起始區提供。通常，轉錄與轉譯調節區的結合物被稱為是啟動子。許多啟動子區是可以得到的，它們能夠在植物中進行各種組成型的或可調節的例如可誘導的結構基因表達。
已知可用於在植物中進行組成型基因表達的序列是與土壤農桿菌基因如胭脂鹼合成酶(Nos)，Mannopine合成酶(Mas)，或章魚鹼合成酶(Ocs)相關的調節區，以及編碼病毒基因表達的區域，例如，菜花鑲嵌病毒(CaMV)的35S和19S區域。本文所用的術語「組成型的」不一定是指在所有細胞類型中以同一水平表達的基因，而是指在很寬範圍的細胞類型中表達基因，儘管經常可以測到許多變化。其他有用的轉錄起始區優先在某些組織或在某些生長條件下轉錄，例如來源於napin、種子或葉ACP以及RUBISCO的小亞單位等的轉錄起始區。
在需要在植物宿主中表達脂醯還原酶蛋白的具體例子中，可以需要使用全部或部分完整植物脂醯還原酶基因，即可以將5′上遊的非編碼區(啟動子)與結構基因序列以及3′下遊的非編碼區一起使用。如果需要不同的啟動子，例如令人感興趣的植物宿主的天然啟動子或修飾過的啟動子，即具有從一個基因源獲得的轉錄起始區和從一個不同的基因源獲得的轉譯起始區的啟動子，或強化的啟動子如雙倍35SCaMV啟動子，則這些序列可以利用標準技術連接在一起。
對於應用，如果5′上遊的非編碼區是由在種子成熟過程中調節過的其他基因獲得，則需要那些優先在植物胚芽組織中表達的調節區，例如產生ACP和napin的轉錄起始控制區。按照1988年1月25日申請的美國專利申請07/147，781(現在為US 07/742，834，1991年8月8日申請)以及美國專利申請07/494，722(大約在1990年3月16日申請，題為「優先在早期種子萌發中表達的新的序列以及它所涉及的方法」)指導的方法，可以獲得並使用這種「種子特異性啟動子」，上述所有未決申請均引入本文作為參考。對於脂肪醇的生產，需要優先在種子組織中表達的轉錄起始區，以使在其他植物部分中基因產物的任何破壞性或副作用降至最小。
本發明的重組構件也可以包括調節轉錄終止區。轉錄終止區可以由編碼植物脂醯還原酶的DNA序列提供，或者是由來自不同基因源的合適的轉錄終止區提供，特別是該轉錄終止區與轉錄起始區自然結合。該轉錄終止區通常含有至少約0.5kb、優選約1-3kb的從3′端到結構基因的序列，由該結構基因衍生出該終止區。
具有植物脂醯還原酶如以表達它的令人感興趣的DNA序列存在的植物表達構件可以與各種植物一起使用，特別是產生特長鏈脂醯輔酶A分子的植物，例如芸苔屬，以及特別是在油菜籽的高芥酸變化階段。其他令人感興趣的植物產生所需底物例如基質或長鏈脂醯分子，這些植物包括但不限於油菜籽(Canola變種)、向日葵、紅花、棉花、Cupher、大豆、花生、椰子和油棕櫚以及玉米。根據將DNA表達構件導入宿主細胞中的方法的不同，需要不同的DNA序列。重要的是，本發明可用於雙子葉植物和單子葉植物其類似種，並且可容易地用於新的和/或改進的轉化與再生技術。
轉化方法對於本發明不是重要的;各種植物轉化方法目前都是可行的。作為轉化作物的較新的可行方法，它們在下面可直接使用。例如，許多對土壤桿菌感染天然敏感的植物可以通過土壤桿菌介導的三個成分交配或雙載體轉化的方法成功地轉化。可用於將核酸序列轉移至宿主植物細胞中的其他序列可以從植物病原病毒或植物轉位因子得到。另外，已經發展的微注射，DNA粒子轟擊，電擊穿技術能夠轉化各種單子葉和雙子葉植物。
在製備重組構件時，通常將該構件或其片段的各種成分插入合適的克隆載體中，該載體能夠在細菌宿主例如大腸桿菌中複製。在文獻中已經描述了存在的許多載體。每次克隆後，可以將質粒分離並進行進一步操作，例如限制、插入新的片段、連接、缺失、插入及切除等，以製作所需序列的成份。一旦該構件製作完成，就可以根據宿主細胞轉化的方法將該構件轉移至合適的載體中以進行進一步的操作。
通常，重組結構中包含具有在宿主中表達所必需的調節區並且提供對轉化細胞選擇的結構基因。該基因能提供對細胞毒性劑例如抗菌素、重金屬和毒素等產生抗性，還能夠為營養缺陷型宿主補充養分使之成為原養型，以及提供病毒免疫性等。同樣，也可以使用編碼能產生通過顏色變化而識別的化合物如GUS的酶或編碼能發光物質的酶如螢光素酶的基因。根據引入表達構件的宿主種類的不同，可以使用一個或多個標記以對轉化組織進行選擇或檢測，此時對於不同宿主使用不同的選擇條件。
如果用土壤農桿菌進行植物轉化，要求在核酸序列的一個或兩個末端加上T-DNA作邊緣，具體地說是左和右邊緣區，尤其是至少有右邊緣區。如果使用其他的轉化方法，也可以使用這些邊緣區。
如果將土壤農桿菌或Rhizogenes序列用於轉化植物，可以利用這樣的載體，該載體引入土壤桿菌宿主後能與宿主中存在的Ti-或Ri-質粒上的T-DNA進行同源重組。可以將含有重組所需的T-DNA的Ti-或Ri-進行裝配(能夠使半乳糖苷酶形成)，也可以去除裝配物(不能使半乳糖苷酶形成)，後者只有當其在轉化的土壤農桿菌宿主中能補充vir基因的功能時才是允許的，其中vir基因編碼將DNA轉移至植物宿主中所必需的轉移作用因子。利用裝配的土壤農桿菌菌株可以產生正常植物細胞的混和物，其中的一些含有所需的核苷酸序列，在腫瘤形成基因存在下植物細胞可以形成半乳糖苷酶。可以從混合物中篩選出含有所需核酸序列，但缺失腫瘤基因的細胞以獲得正常的轉基因植物。
在優選的方法中，以土壤農桿菌作為轉化植物細胞的載體，將連接有T-DNA邊緣區的表達或轉錄構建體插入到能在大腸桿菌和土壤農桿菌中複製的寬宿主範圍載體中，這裡所說的寬宿主範圍載體描述於文獻中。通常使用的pRK2或其衍生物。參見，例如Ditta等人(Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.(1980)77∶7347-7351)和EPA0120515，這些都引入本文作參考文獻。或者可以將此在植物細胞中表達的序列插入到含有獨立複製序列的載體中，這些結構之一可以使E.coli中的載體穩定，而另一個可以使載體在土壤農桿菌中穩定。參見，例如，McBride和Summerfelt(Plant Mol.Biol.(1990)14∶269-276)，其中利用了pRiHRI(Jouanin等人，Mol.Gen.Genet.(1985)201∶370-374)的複製原點，並且能夠為土壤農桿菌宿主細胞提供增加穩定性的植物表達載體。
優選使用能夠在土壤桿菌中複製的如上所述的載體。在此方法中，不需要進行質粒重組，並且宿主土壤農桿菌vir區域可以提供將序列的T-DNA邊緣區轉移到植物宿主細胞所需的轉移作用因子。
對於芸苔屬細胞的轉化，例如，可以使用土壤農桿菌轉化方法。Radke等人描述了其中的一種方法(Theor.Appl.Genet.(1988)75∶685-694)。
現在已大體上對本發明進行了描述，通過參照下面的實施例將更加容易理解本發明，除非特別說明，這些實施例僅用於說明本發明而不是對本發明的限制。
實施例1 醯基輔酶A還原酶的測定本實施例描述了測定微粒體膜製劑中或加溶蛋白質製劑中醯基輔酶A還原酶活性的方法。
A.放射性標記物用14碳氰化鉀和相應的烷基甲磺醯化反應，然後鹼解所得的烷腈生成游離脂肪酸製得比活為51-56Ci/mol的(1-14碳)長鏈脂肪酸，即11-順-二十烷酸，13-順-二十二烯酸和15-順-二十四碳烯酸。用醚制重氮甲烷將游離脂肪酸轉化為其甲基酯，然後用製備性硝酸銀薄層層析(TLC)純化。將脂肪酸甲酯水解重新生成游離脂肪酸。用正常相矽膠TLC、硝酸銀TLC和C18反相TLC三種方法評估放射化學純度。由上述方法測得的放射化學純度是92-98%。用Young和Lynen的方法(J.Bio.Chem.244∶377，1969)從相應的[1-14碳]長鏈游離脂肪酸製備[1-14碳]長鏈醯基輔酶A(比活為10Ci/mol)。其它的[1-14碳]醯基輔酶A，如[1-14碳]二十四碳烯基輔酶A購自Amersham(Arlington Heights，IL)。應用經稍微修改的Pletcher和Tate的方法(Tet.Lett.1601-1602，1978)對[1-14碳]十六烷醇進行重鉻酸鹽氧化製備[1-14碳]十六烷-1-醇。所得產物經製備性矽膠TLC純化。貯存於己烷溶液中置-70℃備用。
B.測定微粒體膜製劑中還原酶活性1.測定1微粒體膜製劑中的還原酶活性，是將20μm[1-14碳]醯基輔酶A(通常是二十四碳烯基輔酶A，比活為2-5Ci/mol)與要檢測的樣本和2mMNADPH於0.25ml的總體積中一起保溫測得。保溫混合物還含有10%w/v甘油，1mMDTT，並經50mM HEPES(4-[2-羥乙基]-1哌嗪乙烷磺酸)緩衝(這裡或下文所指的HEPES是從其pH7.5的1M貯存液中取用的)。
測定是從加入醯基輔酶A底物開始，於30℃保溫一小時。然後把測定管置於冰上中止測定，並馬上加入0.25ml異丙醇∶乙酸(5∶1v/v)。再加入0.1mg未標記的蠟酯和0.1mg油醇作為載體。用經按比例縮小的Hara和Radin方案(Anal.Biochem.90∶420，1978)提取[14碳]脂類。向中止測定的管中加入6ml己烷/異丙醇(3∶2，v/v)。旋轉混合樣本後加入2ml硫酸鈉水溶液(5.5%w/v)，再次旋轉混合樣本。
2.測定2微粒體膜製劑中還原酶活性的測定，是將20μm[1-14碳]醯基輔酶A(通常是二十四碳烯基輔酶A，比活為2-5Ci/mol)與待檢樣本及2mM NADPH於0.25ml的總體積中一起保溫。保溫混合物還含有10%w/v甘油，1mM DTT，並用50mM HEPES(4-[2-羥乙基]-1-哌嗪乙烷磺酸)緩衝(這裡或下文指的HEPES是從其pH7.5的1M貯存液中取用的)。如果需要抑制同時存在於膜製劑中醯基輔酶A乙醇醯基轉移酶活性(該酶消耗還原酶反應的產物)，可以在測定混合物中含有0.3%w/v CHAPS。該濃度的CHAPS對還原酶的影響最小但能完全抑制醯基轉移酶反應，從而簡化對還原酶活性的定量測定。
測定從醯基輔酶A底物的加入開始，於30℃保溫1小時，然後將測定管置於冰上中止測定，隨後加入0.25ml異丙醇∶乙酸(4∶1v/v)。加入25μg未標記的蠟酯，50μg油醇和50μg油酸作為載體。用按比例縮減的Hara和Radin方案(Anal.Biochem.90∶420，1978)提取[14碳]脂類。向中止測定的管中加入4ml己烷/異丙醇(3∶2，v/v)，旋轉混合樣本後加入2ml硫酸鈉水溶液(6.7%w/v)，再次旋轉混合樣本。
C.測定溶解還原酶活性為了測定溶解還原酶活性，需要進行包括添加使酶激活的鹽在內的幾種變化。在溶解還原酶測定中所用的測定緩衝液就是上述微粒體膜製劑測定中的緩衝液，但作如下的改變a.加入終濃度為0.3-0.5M的NaCl;
b.包含～1mM EDTA;
c.將一般含0.75%CHAPS的待測酶樣本稀釋到≤0.3%(CHAPS的CMC是-0.5%)。
D.測定產物的分析為了分析微粒體膜製劑還原酶測定中或溶解還原酶測定中的產物，提出了兩種方案。一種是在下文被稱作「廣泛測定」的方案，它較為費時，但能獲得更高產量，另一種方案在下文稱為「快速檢測」，它也是對還原酶活性的測定，但更為快速，方便，產量較少。
1.廣泛分析向樣本中加入硫酸鈉並旋轉混合樣本，然後移出上層有機相，用4ml己烷/異丙醇(7∶2v/v)洗滌下層水相。收集有機相併在氮氣中蒸發中至乾燥。脂質殘餘物重新懸浮於小體積的庚烷中，取一份等量試樣經液體閃爍計數測定放射活性，樣本的剩餘部分或者用於進行標記物種類的TLC分析，或者用於裂解蠟酯的衍生過程，從而檢測所產生的醇總量。
對於脂類分析而言，向矽膠TLC板上樣，把該板鋪展於己烷/二乙基醚/乙酸(80∶20∶1或70∶30∶1 v/v/v)中。用AMBIS放射分析顯影系統(AMBIS Systems InC.，San Diego，CA)檢測放射性在脂類，主要是蠟酯(當有連接酶存在的情況下，如同在微粒體膜製劑測定中)，游離脂肪酸，脂肪醇和起始時的極性脂之間的分布。如果需要，可以從TLC板上回收單一脂類作進一步分析。
對於蠟脂的裂解，可應用基於對Pina等人的(Lipids 22∶358-361，1987)Grignard衍生方法按比例縮減進行。在固定了襯聚四氟乙烯螺絲帽的小玻璃管中乾燥加有200μg蠟酯載體的樣本。然後依次加入0.4ml幹二乙基醚，3μl乙酸乙酯和溶於0.1ml二乙基醚中的3M溴化乙基鎂。旋轉混合樣本後，靜置於室溫下至少2小時，然後小心加入經水飽和的二乙基醚以除去過剩的試劑。加入2ml1M HCl和2ml己烷，旋轉試管。上層有機相用水洗滌(2×2ml)，在50-100μl乙醇存在下蒸發至乾燥。
將樣本重新懸浮於50-100μl己烷中，向TLC板上樣。正常相和反相TLC系統兩者都用於樣本分析。正常相TLC用矽膠TLC板，並鋪展於己烷/二乙基醚/乙酸(70∶30∶2v/v/v)中。反相系統用C18板，鋪展於甲醇中。
2.快速分析在向樣本中加入硫酸鈉並旋轉混合後，取出已知百分比的有機相，用液體閃爍計數。這一計算值用於評估有機相中的總數。然後取出有機相的其餘部分，通氮氣乾燥，重新溶解於庚烷中，如在具體測定中描述的方法於TLC板上點樣和鋪展，掃描。用這種方式即可確定摻入到醇類中總數的百分比。
實施例2 希蒙德木屬中醯基輔酶A還原酶的定性本實施例描述了獲得具還原酶活性的希蒙德木蛋白製劑的方法和有關酶活性研究結果。
A.種子發育和醯基輔酶A還原酶活性對Davis，CA的5種植物的胚發育追蹤了兩個夏季，發現胚鮮重和乾重從約80天到約130天以相當穩定的速度增加。脂質提取物顯示出當胚鮮重達約300mg(約第80天)時，脂質重與乾重的比達最大值的50%。
發育胚中醯基輔酶A還原酶活性的測定如實施例1所述。由於所測定的希蒙德木種子表皮是某種抑制因子的來源，所以在於液氮-70℃凍存植物胚之前去掉種子表皮。
對無細胞勻漿或是膜部分中醯基輔酶A還原酶活性的發育全貌的檢定都表明還原酶活性的很大誘導作用，其峰值在開花期之後約115天。收集開花期後約90-110天的胚用於酶學研究，如果該時期還原酶活性高，其脂沉積未達到最高水平，且種子表皮易於剝除。觀察到還原酶的最大增長率是在花開期後80-90天。因此收集花開期後80-90天的胚用於構建cDNA文庫，推定這一時期還原酶蛋白合成速率將達到最大。並推測出編碼醯基輔酶A還原酶的mRNA水平在這一時期也達到最高。
B.分離研究早期用於分離希蒙德木屬胚胎樣品的方法導致在離心後的脂肪墊，上清液及特定餾分中還原酶活性的可變性分布。進行了許多可能對活性分布具有效影響的處理試驗，如超聲波處理，浮選梯度法以及向提取緩衝液中添加各種試劑。在提取緩衝液中包含鹽類可以使以100，000Xg離心1小時所得的上清部分中回收的活性連接酶得到最大改善。提取緩衝含有3M NaCl、0.3M蔗糖、100mM HEPES、2mM DTT和蛋白酶抑制劑，1mM EDTA、0.7μg/ml、抑蛋白酶醛肽、0.5μg/ml抑胃肽和17μg/ml苯甲磺醯氟(PMSF)。
C.微粒體膜製劑含高水平還原酶活性的顆粒可得自上述經透析後離心(100，000Xg)的上清部分或經硫酸銨分離的上清部分。透析方法的詳細描述見實施例3。對這些具有還原酶活性顆粒進行諸如密度梯度離心、凝膠滲透層析和蛋白/磷脂分析的進一步分析表明，這些顆粒是一個膜部分。該膜製劑還具有高細胞色素C還原酶活性，該活性作為內質網(ER)膜的標誌。這些研究表明該還原酶活性是與膜相關的。
對於硫酸銨分離法，100，000Xg離心上清得自基本如實施例3所述的希蒙德木屬胚。將等體積的硫酸銨溶液(33.2g/100ml)緩慢加到上清部分(同時不斷攪拌)，使硫酸銨濃度達到30%，該濃度將有效地沉澱還原酶。再攪拌30分鐘後將懸液離心(26，000Xg)30分鐘，所得沉澱重新懸浮於含25mM HEPES、1M NaCl、1mM DTT和0.1mM PMSF溶液中，其體積是第一次上清部分(S1)的1/10。懸液再離心(100，000Xg)1小時，所得沉澱再懸浮於25mM HEPES，10%甘油中(體積為1/10的S1體積)。離心(100，000Xg)該懸液產生洗滌過的微粒體丸P4，將P4再懸浮於1/20S1體積的25mM HEPES，10%甘油中，使蛋白濃度達到約3-4mg/ml。分等量試樣凍存於-70℃備用。
D.膜相關性還原酶活性的研究應用Bordier描述的Triton X114相分離方法(J.Biol.Chem.256∶1604-1607，1981)測定希蒙德木屬還原酶是否是一種完整的膜蛋白，或者是更緊密地與膜層(親水性更高的蛋白)相聯。該技術一般包括將膜與1% Triton X114一起於冰上溫育，然後在這些條件下將混和物溫度升至去垢劑的濁點以上(濁點是指較大的膠粒開始自發形成的溫度，1% Triton X114的濁點是-20℃)。通過離心，可以觀察到兩個不同的相下層相富含去垢劑，上層相缺乏去垢劑(這裡指的是水相)。已經表明完整的膜蛋白優先分配到富含去垢劑相而親水性更高的蛋白質可從水相中回收。當希蒙德木屬膜製劑用這一Triton X144相分離方法處理時，還原酶活性是與富含去垢劑相有關而在水相中檢測不到還原酶活性。這一事實證明該還原酶是一種完整膜蛋白。
E.還原酶更進一步的特徵上述微粒體膜製劑用於進一步鑑定還原酶的特徵。還原酶顯示出活性的pH值範圍是5-9。確定還原酶特徵的實驗是在pH7.5中進行，該pH值接近所推測的胞漿生理pH值。
1.鹽效應用0.5M標準濃度的一元鹼鹽檢測各種鹽對還原酶活性的影響。含二價陽離子或陰離子的鹽用0.167M濃度(與0.5M一元鹼鹽產生相同的離子強度)也可以在0.5M進行檢測，加入0.5M NaCl後觀察到產生了15倍的刺激作用。儘管單價或雙價的其它鹽類(如LiCl、KCl、MgCl2、CaCl2和Na2SO4)與NaCl的刺激作用相比一般說來程度較低，但它們都顯示出了對還原酶活性的刺激作用。強的離液序列高的鹽，如KSCN和NaSCN對還原酶活性不產生刺激作用或產生勉強的刺激作用。
2.其它效應物已發現二硫蘇糖醇(DTT)對還原酶活性有刺激性，但不是專性的，而乙二胺四乙酸(EDTA)產生一定刺激作用的合適濃度是2.5mM。在0.02-0.075mg/ml低濃度BSA(牛血清白蛋白)中觀察到弱的刺激活性，而BSA在濃度為或大於0.2mg/ml時產生抑制活性。
早期觀察到醯基輔酶A還原酶具NADPH特異性的結果(Pollard etal.，同上文)得以證實。在上述背景下(＜2%的NADPH依賴性活性)可檢測出非NADH依賴性活性。而且，還原酶反應的水溶性終產物輔酶A和NADP+在毫摩爾濃度產生明顯的抑制活性，而NADH和NAD+對還原酶活性只有勉強的影響。
3.底物特異性把不同鏈長的脂肪酸的硫酯、醯基脂醯載體蛋白(acyl-ACPS)和醯基輔酶A作為還原酶的底物。由於二十四碳烯基輔酶A(24∶1輔酶A)底物在較高的濃度時顯示了強的底物抑制作用，所以試驗在底物濃度為10μM條件下進行。在這些測定中NaCl濃度為0.5M。底物特異性實驗結果示於下文表1中。
表1還原酶的乙醯特異性還原酶活性(Pmol/min/μl)Acyl-ACP Acyl-CoAAcyl基 (10μM) (10μM)12∶0 ＜0.01 ＜0.1516∶0 2.9 ＜0.418∶0 - 1.418∶1 1.05 0.7520∶1 - 1.022∶1 - 1.024∶1 - 19.9二十四碳烯基輔酶A在這些試驗物中具有最高的底物活性，因此它被用於酶的進一步純化和確定特徵的實驗中進行還原酶測定。令人感興趣的是，棕櫚醯輔酶A(C16∶0-CoA)和棕櫚醯-ACP(C16∶0-ACP)可直接當作底物。還原酶對棕櫚醯輔酶A的活性僅僅勉強高於其背景活性，而還原酶對棕櫚醯-ACP的活性卻很高。以前的研究還表明硬脂醯-ACP(C18∶0-ACP)底物活性(Pollard et al.，同上文)。
還值得感興趣的是，儘管棕櫚醯輔酶A對於還原酶似不是很好的底物，但在用未標記的棕櫚醯輔酶A(O-30μM)和[1-14碳]二十四碳烯基輔酶A(20μM)進行的競爭性抑制實驗中，在5μm棕櫚醯輔酶A時對還原酶還原二十四碳烯基輔酶A的活性產生了50%的抑制作用。因此，雖然棕櫚醯輔酶A在所用的測定條件下不是很好的酶作用底物，但它是一種有效的抑制劑。
4.還原酶抑制劑測定檢測了幾種已知的其它類型還原酶蛋白的抑制劑對希蒙德木醯基輔酶A還原酶活性的影響。HMG-CoA還原酶(3-羥-3-甲基戊二酸單醯輔酶A還原酶)的強抑制劑，Mevinolin僅在比抑制HMG-CoA還原酶時的濃度(Ki約1nM)相對高的濃度(100μm)時才對希蒙德木屬醯基輔酶A還原酶有影響。已經熟知Cerulinen共價結合於β-酮脂醯基硫酯合成酶，但它對希蒙德木醯基輔酶A還原酶不具有強的抑制作用。
篩選測定Sulphydryl阻斷劑對還原酶活性的影響。N-乙基馬來醯亞胺顯示出了強的抑制活性，對-羥汞苯甲酸酯也有一定的抑制作用，而碘乙醯胺沒有抑制作用。據這一事實得出的結論是醯基輔酶A還原酶含有對各種Sulphydryl阻斷劑顯示出相當的選擇性的必要Sulphydryl基團。
實施例3 醯基輔酶A還原酶的純化本實施例描述了用於分離具有還原酶活性的希蒙德木膜製劑，增溶還原酶活性和進一步純化還原酶蛋白質的方法。
A.微粒體膜製劑在開花後約90-110天收集希蒙德木屬胚，這可以通過檢測胚的水含量(45-70%)來確定。去掉外殼和種子表皮，將豬耳草於液氮中快速冷凍，並貯存於-70℃備用。對於初蛋白製劑，在液氮溫度下於鋼研缽和研杵中將冷凍胚搗成粉末狀。在一般的實驗中經處理的胚為70克。
將所得粉末以每280ml溶液中含70克胚的比例加入到下列高鹽溶液中3M NaCl、0.3M蔗糖、100mM HEPES、2mM DTT和蛋白酶抑制劑，1mM EDTA、0.7μg/ml抑蛋白酶醛肽、0.5μg/ml抑胃肽和17μg/mlPMSF。將粉末胚分散於存在於Polytron組織勻漿器中的緩衝液中，約30秒後形成無細胞勻漿(CFH)。再將勻漿通過有三層結構的Miracloth(CalBioChem，LaJolla，CA)濾器進行過濾，所得濾液離心(100，000Xg)1小時。
離心所得樣本包括沉澱、上清液和漂浮的脂肪塊。去掉脂肪塊，收集上清部分並相對含1M NaCl、100mM HEPES、2mM DTT和1mM EDTA的溶液進行透析過夜(更換緩衝液3次)。將透析液離心(200，000Xg)1小時產生沉澱DP2。將DP2懸浮於相當於初始CFH體積約1/20的25mM HEPES(pH7.5)，10%(w/v)甘油，1mM EDTA和0.5M NaCl中產生微粒體膜製劑。
如實施例1所述進行活性測定。檢測到回收的醯基輔酶A還原酶活性是無細胞勻漿中原始活性的約30%。當膜製劑貯存於-70℃時其中的醯基輔酶A還原酶活性是穩定的。
B.還原酶蛋白質的溶解將固體CHAPS(3-[(3-膽醯胺丙基)-二甲基-ammonio]1-丙磺酸鹽)加到微粒體膜製劑中使終濃度達到2%(w/v)。樣本於冰上緩慢搖動溫育約1小時，然後用25mM HEPES(pH7.5)，10%甘油，1mM EDTA，0.34M NaCl稀釋樣本使其中CHAPS濃度降低至0.75%，NaCl濃度約為0.4M。再將樣本離心(200，000Xg)1小時，上清的回收和還原酶活性的測定如實施例1所示。一般情況下，可從上清部分回收來自微粒體膜製劑還原酶活性的85%。當樣本貯存於-70℃時，溶解的還原酶活性是穩定的。
C.Blue A柱層析製備柱床體積約25ml並含有Blue A(Cibacron Blue F3GA;Amicon Division，W.R.Grace Co.)的柱(1.8×～10cm)，用含0.4MNaCl的緩衝液A(25mM HEPES(pH7.5)，20%(w/v)甘油，0.75%CHAPS，1mMEDTA)對柱進行平衡處理。將上述溶解的還原酶製劑上樣到Blue A柱上。
用幾倍於柱體積的含0.4M NaCl的緩衝液A衝洗層析柱，然後再用含0.5M NaCl的緩衝液A衝洗。90%以上的還原酶活性結合至層析柱上，而85%以上的其它蛋白質從柱中衝走。用含1.0M NaCl的緩衝液A從柱中洗脫還原酶活性物，如實施例1所述收集餾份並對還原酶活性進行測定。收集到的含還原酶活性的餾分貯存於-70℃。一般情況下，用含1.0M NaCl的緩衝液洗脫能回收上樣還原酶活性的30-50%。
D.大小篩析層析(Size Exclusion Chromatography)將從Blue A柱收集的活性餾份在固定有YM30膜(Amicon Division，W.R.Grace)的壓力槽中通過超濾而濃縮10倍。一般說來，從Blue A柱流出的含還原酶活性的洗脫液為～90ml，經濃縮後為～8ml，然後上樣到下述兩個Sephacryl S100柱。該兩個層析柱(2.5×75cm)用S100HR介質(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ)填充，並用含0.5M NaCl的緩衝液A平衡。用下列蛋白標準物校準層析柱體積牛血清白蛋白(66KD)、碳酸酐酶(29KD)、細胞色素C(12.4KD)和藍葡聚糖(Blue dextran)(用於確定空隙體積)。將濃縮樣本的4ml等份試樣上樣於每一個S100柱，它們以約17釐米/小時的線性流速展開。收集～4小時內流出的餾份，用實施例1所述方法檢測餾份中的還原酶活性。
在洗脫出的表觀分子質量約為49KD的一條主峰中回收的活性大於上樣活性的60%。收集的活性餾份的體積是～30-35ml/柱。
E.親和層析用棕櫚醯輔酶A瓊脂糖(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)填充層析柱，並用緩衝液B(含0.1M NaCl的緩衝液A)進行平衡。從凝膠過濾柱收集的活性餾份通過上述超濾處理濃縮～16倍。濃縮樣本經用緩衝液A稀釋其中的NaCl水平從0.5M降至～0.1M。將稀釋樣品上柱，然後用幾倍於柱體積的緩衝液B衝洗層析柱。再用10ml含15mM NADH的緩衝液B衝洗柱，接著用緩衝液B作進一步衝洗。用15ml含15mM NADPH的緩衝液B流過層析柱而洗脫還原酶活性。一般情況下，在一定時間從一個凝膠過濾柱收集的物質再經親和柱處理，經NADPH洗脫回收的活性大於樣品上柱時活性的70%。收集活性餾份進行還原酶活性，蛋白質濃度和多肽成份分析。根據Bradford描述的染料結合法(Analy.Biochem.72∶248-254，1978)用商售藥盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Richmond，CA)估測蛋白質濃度。BSA用作參照蛋白質。
F.SDS-PAGE分析樣本的多肽成分用SDS-PAGE分析(Laemmli，U.K.(1970)Nature London)227∶680-685)。通過加入SDS和二硫蘇糖醇貯存液至終濃度分別為2%和30mM而製備樣品用於電泳。將約50μl的樣品上樣到含有12%分離膠(NOVEX，San Diego，CA)的丙烯醯胺凝膠樣孔中。分子量標準物購自Bio-Rad Laboratories。通過銀染法(Blum et al.，Electrophoresis 8∶93-99，1987)檢測蛋白質。
在來自親和柱的活性樣本中檢測到表觀分子量約52KD和54KD的兩條主要多肽帶，它們一起代表了該製劑中95%以上的蛋白質。因為在自然狀態下還原酶的表現大小約為49KD(由如上文所述和大小篩析層析法確定)，所以這些條帶很可能表示還原酶的相關形式而不是一種酶的兩個不同亞單位。
G.蛋白質吸印到膜上為了進行胺基酸測序，在SDS-PAGE電泳後將上述還原酶多肽轉移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上，或轉移到Immobilon-P膜(Millipore;Bedford，MA)或ProBlott膜(Applied Biosystems;Foster City，CA)上以進一步分離蛋白質。如果要對蛋白質按順序地酶解時最好選用硝酸纖維素膜，而PVDF對N-末端測序法和對來自溴化氰消化的肽的測序有用。
1.吸印至硝酸纖維素膜如果蛋白質經電轉印轉至硝酸纖維素膜上時，則於5-20%甲醇中含25mM Tris、192mM甘氨酸的緩衝液中轉印的時間一般是1-5小時。電轉印後，將膜在存在於1%(v/v)乙酸中的0.1%(w/v)麗春紅S中染色2分鐘，在0.1%(v/v)乙酸中脫色，更換脫色液2-3次，每次持續2分鐘。然後將膜溼潤著於-20℃存於熱封閉的塑膠袋中。如果時間允許的話，吸印膜不必冷凍而馬上進行消化以產生如下文所述確定的胺基酸序列的肽。
2.轉印至PVDF當蛋白質經電轉印轉移到Immobilon P PVDF上時，在溶於10%(v/v)甲醇的12.5mM Tris/5mM甘氨酸的緩衝液中的轉印時間一般約1-2小時。電轉印之後，將膜在溶於50%(v/v)甲醇/10%(v/v)乙酸的0.1%(w/v)考馬斯蘭中染色5分鐘，再於50%(v/v)甲醇/10%(v/v)乙酸中脫色，更換脫色液2-3次，每次脫色持續2分鐘。然後將PVDF膜於空氣中乾燥30分鐘，再將乾燥的膜置入熱封口的塑膠袋中貯於-20℃。吸印到PVDF膜，如ProBlott上的蛋白質可直接用於完整蛋白質的N-末端序列測定。在下文的實施例4A中描述了電轉印蛋白質至ProBlott上的方法。
實施例4 胺基酸序列的測定本實施例描述了測定與醯基輔酶A還原酶活性相關的植物蛋白質的胺基酸序列的方法。
A.用溴化氰裂解蛋白質和肽的分離用在《探針設計肽分離系統技術手冊》(Probe-Design PeptideSeparation System Technical Manual)(Promega，Inc.Madison，WI)中描述的方法對感興趣的蛋白質進行溴化氰裂解。如上所述將還原酶蛋白吸印到PVDF膜上。從吸印膜上剪下蛋白質條帶，放入溶於70%(v/v)甲酸的溴化氰溶液中，一起於室溫下溫育過夜。溫育之後去除溴化氰溶液，收集，並用Reacti-Vap蒸發器(Pierce，Rockford，IL)於連續氮氣流下進行乾燥處理。用肽洗脫溶劑，如70%(v/v)異丙醇，0.2%(v/v)三氟乙酸，0.1mM賴氨酸和0.1mM巰基乙酸對溴化氰肽進行再次洗脫以保證溴化氰完全去除，去除洗脫液，加到含乾燥過的溴化氰的試管中按上述方法乾燥。可以用新鮮洗脫溶劑重複洗脫過程。加50μl HPLC級的水到乾燥肽中，再經Speed-Vac(Savant，Inc.，Farmingdale，NY)蒸發去掉水份。
用類似於Schagger和von Jagow描述的方法(Anal.Biochem.166∶368-379，1987)藉助於Tris/N-三羥甲基甘氨酸SDS-PAGE系統分離肽。在125-150V的恆壓下進行凝膠電泳約1小時或電泳至指示染料跑出凝膠的底邊為止。轉移前，先將凝膠浸泡在轉移緩衝液中(125mM Tris、50mM甘氨酸、10%(v/v)甲醇)15-30分鐘。在50V恆壓下將凝膠轉印到ProBlott測序膜(Applied Biosystems，Foster City，CA)上，轉印2小時，將轉印膜在考馬斯蘭(0.1%溶於50%(v/v)甲醇/10%(v/v)乙酸)中染色，再於50%(v/v)甲醇/10%(v/v)乙酸中脫色3次，每次2分鐘。膜在空氣中乾燥30-45分鐘，然後貯存於-20℃。
吸印到ProBlott上的肽可直接上樣到蛋白質測序儀的筒(cartridge)上而不需加入包被Polybrene的玻璃纖維濾器。用經細微改動的反應循環BLOT-1(由Applied Biosystems提供)對肽測序。另外，溶液S3(丁基氯化物)也用50∶50的S1和S2(正庚烷和乙酸乙酯)的混合物代替。當對吸印到ProBlott上的樣本測序時都用到了這兩處變動。
B.蛋白酶消化和肽的分離吸印到硝酸纖維素膜上的蛋白質可以用蛋白酶進行消化而獲得用以測序的肽。所用的方法是Aebersold等人描述的(PNAS84∶6970，1987)。從硝酸纖維素膜上取下還原酶蛋白條帶，同時取等量空白硝酸纖維素膜用作對照，用HPLC級的水對獲取的膜衝洗數次以去掉麗春紅S。衝洗後，將1.0ml溶於0.5%乙酸中的0.5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40，Aldrich，Milwaukee，WI)加到膜條帶中，並於37℃溫育30分鐘。為了徹底去除PVP-40，用大體積的HPLC級水(8×5ml)衝洗硝酸纖維素條塊，並用分光光度計檢測洗出液在214nm的吸光度。而且，如果硝酸纖維素條帶在PVP-40處理和衝洗兩個步驟之後才切割成小片，PVP-40就更容易去掉。這兩處改動消除了PVP-40幹擾的問題。
將處理後的小片然後懸浮於適宜的消化緩衝液中，例如胰蛋白酶消化緩衝液，100mM碳酸氫鈉pH8.2，或蛋白內切酶gluC緩衝液，25mM碳酸銨/1mMEDTA，pH7.8。向消化混合物中加入乙腈使其濃度為5-10%(v/v)。用消化緩衝液稀釋蛋白酶，然後加到消化混合物中，一般情況下，蛋白酶與所消化蛋白質之比為1∶10(w/w)。溫育18-24小時進行消化。例如，胰蛋白酶消化於37℃溫育，而蛋白內切酶gluG消化要在室溫下溫育。同樣地，其它蛋白酶，包括lysC和aspN可以用於消化還原酶蛋白。儘管單個的消化緩衝液條件可以不同，但消化、肽分離、純化和測序過程基本與上述用gluC和胰蛋白酶消化的相應程序相同。
溫育過夜後，加入10μl(v/v)三氟乙酸(TFA)或1μl100%TFA中止消化反應。從硝酸纖維素片塊上除去消化混合物，用1-5 100μl體積的含5-10%乙腈的消化緩衝液衝洗硝酸纖維素片塊，並且將該體積溶液於Speed-Vac中濃縮至小於100μl。用安裝於應用生物系統(Applied Biosystems，Foster City，CA)130-型高效液相色譜(HPLC)上的Vydac反相C18柱(2.1mm×100mm)分離肽，用於洗脫肽的移動相是緩衝液A0.1nM磷酸鈉pH2.2;緩衝液B溶於0.1mM磷酸鈉中的70%乙腈(pH2.2)。所應用的流速為50μl/分的三步梯度洗脫是10-55%緩衝液B二小時，55-75%緩衝液B5分鐘和75%緩衝液B常液洗脫15分鐘。於214nm檢測肽，由專人收集後貯存於-20℃。
C.蛋白質和肽的N-末端測序應用在Applied Biosystems 477A液相脈動蛋白測序儀進行Edman降解而進行所有測序步驟;由測序儀產生的乙內醯苯硫脲(PTH)胺基酸是用相聯的應用生物系統120A PTH分析儀進行分析。藉助用於Apple Macintosh的應用生物系統610A型數據分析系統和用來自PE NELSON，Inc.(Cupertino，CA)的ACCESS＊CHROM軟體的數字微型Vax計算機收集和貯存數據。從經PTH分析儀接收輸入的圖型記錄儀閱讀到測序數據，並用得自610A型軟體的定量數據證實讀到的測序數據。所有測序數據由兩個操作人員藉助於數據分析系統各自讀出。
對於得自HPLC峰圖的肽樣本，可上樣於已在測序儀中經過3次預循環的包被Polybrene的玻璃纖維濾器(Applied Biosystems，Foster City，CA)上。對於已經還原和鹼解的肽，用液體閃爍計數器對每次測序儀循環所產生的PTH-胺基酸產物的一部分進行計數。對於已經電轉印轉移到Immobilon-P上的蛋白樣本，切出感興趣的條帶，然後置於如上所述經預循環的包被Polybrene玻璃纖維濾器上，根據製造商的指示安裝反應筒。對於經電轉印轉移到ProBlott上的蛋白樣本，不需要玻璃纖維濾器。
為了從小量樣本(5-30pmol)中獲得蛋白質序列，應用如Tempst和Riviere(Anal.Biochem，183∶290 1989)描述的477A轉換循環和120A分析儀。
D.還原酶肽的胺基酸序列應用SDS-PAGE分離純化還原酶製劑，分離出54和56KD蛋白質，將分離出的物質轉移到硝酸纖維素型膜(Immobilon N)上，用麗春紅R染色對條帶進行定位。用胰蛋白酶處理從吸印膜上切割下來含56或54KD蛋白質的部分，再經反相HPLC分離胰蛋白酶肽。從每一個還原酶的蛋白的幾個肽獲取的序列信息示於下列表2中。
表254KD和56KD還原酶蛋白質的肽序列56KD 還原酶肽 54KD 還原酶肽1)AILVTGATGSLAK 1)AILVTGATGSLAK2)LQNExFGKELFK 2)LGLDINVEK3)VTVVPGDITGEDL 3)TIDNVPVYYG4)LGLDINVEK 4)YVEPVTYxVGSSAAN5)TIDNVPVYYGK 5)LVDIYKp6)YVEPVTYHVGSSAANPM 6)EGIVEADMFYF
7)LSALPEMAHR 7)AINWEDYFL8)LVDIYK 8)THFPGVVEHVL9)EGIVEADMFYFD10)AINWEDYFLKTxFPGVVEXVL表中所列出的肽序列應用的是代表胺基酸的標準一字母密碼。「X」表示該位置上的胺基酸還末鑑定出。以小寫字母出現的胺基酸標示表示對該胺基酸的鑑定是不確定的。
從上述肽序列可以看到兩種還原酶蛋白質相似性這一事實。從54KD蛋白質得到的所有肽序列也見於被測序的56KD肽中。在被測定的胺基酸序列與從編碼56KD還原酶的cDNA(圖1)推導出的相應還原酶胺基酸序列之間有一處不相符合，根據cDNA序列資料胺基酸460是絲氨酸，而分別來自54KD和56KD肽6和9的信息表明這一位置是甘氨酸。
對用4種不同的限制性酶消化的希蒙德木屬基因組DNA進行的Southern吸印分析測出了與還原酶cDNA探針雜交的一條主帶和一條次帶。
實施例5 希蒙德木屬cDNA文庫本實施例描述了從收集於開花期後80-90天的希蒙德木屬胚中分離poly(A)+RNA，然後構建希蒙德木屬胚cDNA文庫的方法。
A.希蒙德木屬RNA的分離用Jackson和larkins最早提出(Plant physiol.57∶5-10，1976)經由Goldberg等人改良的方法(Deve-lopmental Biol.83∶201-217，1981)從多核糖體中分離RNA。除非有特別說明，提取過程的所有步驟都在4℃下進行。將10mg組織在液氮中於Waring攙合器裡磨碎直到所有組織都變成細粉為止。蒸發掉液氮後，加入170ml提取緩衝液(200mM Tris pH9.0、160mM KCl、25mM EDTA、70mM MgCl2、1%Triton X-100、0.5%脫氧膽酸鈉，1mM亞精胺，10mMβ-巰基乙醇和500mM蔗糖)，並將組織勻漿化約2分鐘。勻漿經無菌的(miracloth)過濾，再離心(12，000Xg)20分鐘。將上清液輕輕倒入500ml無菌燒瓶中，並於室溫下加入1/19體積的20%去垢劑溶液(20%Brij35，20%吐溫40，20%Noidet p-40w/v)。用中速在4℃下攪拌所得溶液30分鐘，再將上清離心(12，000Xg)30分鐘。
約30ml上清被等分後加入到已放有7ml溶液(40mM Tris pH9.0、5mM EDTA、200mM KCl、30mM MgCl2，1.8M蔗糖，5mMβ-巰基乙醇)的無菌Ti60離心管中。用提取緩衝液將離心管充滿，用Ti60轉子於4℃離心(60，000rpm)4小時。離心後，吸掉上清，向每隻離心管中加入0.5ml重懸浮緩衝液(40mM Tris pH9.0、5mM EDTA、200mM KCl、30mM MgCl2，5mMβ-巰基乙醇)。將離心管置於冰上10分鐘，到沉澱團丸徹底重新懸浮後貯存。然後將上清再離心(120Xg)10分鐘以去掉不溶性物質。將1體積的溶於20mM Tris pH7.6、200mM EDTA，2%N-月桂基-肌氨酸中的自消化性蛋白酶K(1mg/ml)加到上清中，混合物於室溫下溫育30分鐘。
加入1/10體積乙酸鈉和2體積乙醇沉澱RNA於-20℃下沉澱數小時後，經於4℃下離心(12，000Xg)30分鐘沉澱RNA。將團丸重新懸浮於10mlTE緩衝液(10mM Tris，1mM EDTA)中，並用等體積的Tris pH7.5飽和酚提取。於4℃下離心(10，000Xg)20分鐘進行相分離，移去水相，用1體積TE緩衝液重新抽提有機相。然後收集水相，用1體積氯仿提取。經離心再次分相，如前所述用乙醇沉澱水相獲得多核糖體RNA。
多核糖體RNA製劑中的多糖雜質是通過把RNA於高鹽緩衝液(0.5M NaCl、20mM Tris pH7.5、1mM EDTA、0.1%SDS)過纖維素柱(Sigma-cell 50)來去除。雜質結合於柱上而從洗出液中收集RNA。收集洗出液餾份並用乙醇沉澱RNA。沉澱得到的總RNA重新懸浮於一小體積溶液中，應用寡聚-dT纖維素柱分離多腺苷酸化的RNA。
B.用質粒載體構建cDNA文庫用多腺苷酸化的RNA在質粒克隆載體pCGN1703中構建cDNA文庫，pCGN1703是從商售克隆載體Blue-scribe M13-(Stratagene Cloning Systems;San Diego，CA)衍生而來，具體做法如下。通過用BamHI消化，用綠豆核酸內切酶處理，而改變Bluescribe M13的多接頭，連接平齊末端構建成缺失BamHI的質粒pCGN1700。用EcoRI和SstI(吡鄰的限制性位點)消化pCGN1700，用具有BamHI，PstI，XbaI，ApaI和SmaI限制性位點，5′AATT延伸物，3′TCGA延伸物的合成連接頭進行退火。連接頭插入到pCGN1700中消除了EcoRI位點，重新構成了見於Bluescribe中的SstI(有時也稱為「SacI」)位點，增添了包含於連接頭中的新限制性位點。用HindIII消化所得的質粒pCGN1702，並用Klenow酶進行鈍端化處理;用PvuII對線性DNA進行部分消化，並在稀釋液中用T4DNA連接酶進行連接。篩選缺失lac啟動子區域的轉化體(pCGN1703)用作質粒克隆載體。
用於cDNA合成的克隆方法簡要說明如下。用SstI消化質粒克隆載體，用末端脫氧核苷酸轉移酶作用於所得的3′延伸粘末端產生同聚物T-尾。用oligo(dA)纖維素層析從未消化的質粒或未加尾的質粒中分離出加尾質粒。所得的載體充當合成共價結合於載體質粒任一端的cDNA第一條鏈的引物。在鳥苷三磷酸存在下用末端轉移酶處理cDNA-mRNA-載體複合物，於cDNA鏈末端產生G-尾。經BamHI消化去除鄰近BamHI位點的其它cDNA-mRNA複合物，剩下在一端為BamHI粘末端而另一端為G-尾的cDNA-mRNA-載體複合物。
用一退火合成的環化連接使上述複合物環化，該連接子具有5′BamHI粘性末端、限制性酶NotI、EcoRI和SstI的識別序列及3′C-尾端。在連接和修復之後，將環化複合物轉化入大腸桿菌DH5α株(BRL，Gaithersburg，MD)形成cDNA文庫。希蒙德木胚cDNA庫含有約1.5×108克隆，平均cDNA插入量約500bp。
C.用λ載體構建cDNA文庫希蒙德木多腺苷酸化RNA也用於在克隆載體λZAPII/EcoRI(Stratagene，San Diego，CA)中構建cDNA文庫。構建文庫所用的方案，DNA和菌株由製造商提供。同樣，根據製造商的說明用Gigapack Gold包裝提取物(Stratagene)包裝克隆。
以上述方式構建的cDNA文庫含有約1×108克隆，其平均cDNA插入量約400bp。
D.還原酶cDNA的分離用根據還原酶肽序列設計引物和PCR技術生產還原酶核苷酸序列的約1Kb部分，用於篩選pCGN1703細菌性載體中的希蒙德木文庫。
應用現有技術中的已知技術，例如Manistis等人所述(見上文)對文庫進行篩選。獲得了含56KD還原酶蛋白質的克隆pCGN7571，並測定了其DNA序列。pCGN7571的核苷酸序列和推測出的其胺基酸序列示於圖1中。
實施例6 用還原酶構建體轉化植物A.Napin/還原酶表達構建體用Napin基因的5′和3′調節區製備在植物細胞中表達還原酶的構建體的方法如下在未決的美國專利申請中(申請號07/550，804)描述了Napin表達盒pCGN1808，該專利申請引入本文作參考文獻。pCGN1808經修飾後含有位於兩側的限制性位點，僅允許表達序列而不允許抗生素耐性標記向雙載體如pCGN1557(McBride and Summerfelt，同上文)移動。將含KpnI、NotI和HindIII限制性位點的合成寡核苷酸進行退火，與pCNG1808唯一的HindIII位點連接，於是便恢復了唯一的HindIII位點。序列分析證實了所得的質粒pCGN3200在napin3′調節序列的3′端含有唯一的HindIII、NotI和KpnI限制性位點。
用HindIII和SacI消化pCGN3200並與用HindIII和SacI消化的pIC19R(Marsh，et al.Gene 32∶481-485，1984)相連接而將napin表達盒中的主要部分進行亞克隆以形成pCGN3212。藉助於利用pCGN3200作模板以及位於SacI位點兩側的二條引物的PCR技術並與napin5′啟動子和來自pCGN1808構建體的pCGN3200的pUC主要成分相連接重新構建napin啟動子區的5′端最大序列。向前的引物含有ClaI、HindIII、NotI和KpnI限制性位點及napin5′序列的408-423核苷酸(從EcoRV位點計數)，反向引物含有與包括5′啟動子中唯一的SacI位點的napin序列718-739互補的序列。根據製造商的說明，用Perkin Elmer/Cetus熱循環儀進行PCR。PCR片段作為平齊末端片段亞克隆到經HincII消化的pUC8(Vieira and Messing Gene.19∶259-268，1982)中形成pCGN3217。對pCGN3217上的napin插入序列進行測序證實，通過PCR未引入不正確的核苷酸。pCGN3217中的napin5′序列連接到經ClaI和SacI酶解並連接於經ClaI和SacI消化的pCGN3212上的napin表達盒的剩餘部分。所得的表達盒pCGN3221用HindIII酶解，經凝膠純化napin表達序列，連接到用HindIII酶解的pIC20H(Marsh，同前文。)最終的表達盒是pCGN3223，它含有一氨苄青黴素抗性遺傳背景，基本上同於pCGN1808中的1.725napin 5′和1.265 3′調節序列。調節區位於HindIII、NotI和KpnI限制性位點的側端，唯一的SalI、BglII，PstI和XhoI克隆位點位於5′和3′非編碼區之間。
還原酶cDNA pCGN7571用SphI(該位點在3′未轉譯序列的1594-1599鹼基處)酶解，並於該位點處插入SalI連接子。用BamHI和SalI酶解所得質粒，經凝膠電泳純化含還原酶cDNA的片段，並克隆到BglII/XhoI消化的pCGN3223(即上文所述的napin盒)中產生pCGN7585。
含有napin5′/還原酶/napin3′構建體的pCGN7586的HindIII酶解片段克隆到經HindIII酶解的pCGN1578(McBride and Summerfelt，同上文)中形成一種用於植物轉化的雙向載體pCGN7586。應用Holsters等人的方法(Mol.Gen.Genet.163∶181-187，1978)和下文描述的植物轉化方法將pCGN7586轉化到封桿菌屬細胞中，如EHA101株(Hood et al.，J.Bacteriol 168∶1291-1301，1986)。
B.植物轉化將高芥酸種子，例如Reston栽培變種和油菜的Canola型變種的種子在95%的乙醇中浸泡2分鐘，於含1滴吐溫20的1.0%次氯酸鈉溶液中進行表面消毒約30分鐘，然後用無菌蒸餾水漂洗3次。將種子平鋪於Magenta盒中，該盒裝有1/10濃度的Murashige基本有機培養基(Gibco;Grand Island，NY)，培養基中補充了吡哆素(pyriodoxine，50μg/L)、煙酸(50μg/L)，甘氨酸(200μg/L)和0.6%Phytagar(Gibco)pH5.8。種子在細胞培養室中於22-24℃光照16小時發芽，其中冷螢光和紅光的強度約45-50微愛因斯坦/米2/秒(μEm-2S-1)。
切除6-7天老秧苗中的下胚軸，切成2-4mm長的小片，平鋪於飼養盤中(Horsh et al.，Science 227∶1229-1231，1985)。育養盤在用前一天製備在含約30mlMS鹽基質(Carolina Biological，Burlington，NC)100mg/L肌醇，1.3mg/L鹽酸硫胺素、200mgKH2PO4(含3%庶糖)、2，4-D(1.0mg/L)、0.6%w/v Phytagar(高壓滅菌前調pH至5.8)(MS0/1/0培養基)的培養皿(100×25mm)中鋪入1.0ml馬鈴薯培養物。使用前在飼養層的上面放一張無菌濾紙片(Whatman 3mm)。通過將10ml培養物轉移到100ml上述用於飼養盤中並含2，4-D(0.2mg/L)和激動素(0.1mg/L)的新鮮MS培養基中對馬鋶薯懸浮培養物進行再次培養一周，在未用飼養細胞的實驗中，將胚軸組織移植塊切下後放到MS0/1/0培養基上部的濾紙片上。所有的胚軸組織移植塊在22-24℃，連續光照強度30-65μEm-2S-1條件下於飼養盤中預培養24小時。
將含有雙向載體的根癌土壤桿菌株EHA101的單個克隆轉移到5mlMG/L肉湯中於30℃過夜生長。胚軸組織移植塊浸入到其中細菌稀釋到1×108細菌/毫升的約10mlMG/L肉湯中，約10分鐘後再放入飼養盤中。每升MG/L肉湯含有5g甘露糖醇、1gL-穀氨酸或1.15g穀氨酸鈉，0.25g KH2PO4、0.10g NaCl、0.10g MgSO4·7H2O，1mg生物素，5g胰化腖和2.5g酵母提取物。將肉湯pH值調至7.0。與土壤桿菌共培養48小時後，將胚軸組織移塊轉移到含過濾除菌的羧苄青黴素(500mg/L，高壓滅菌後加入)和25mg/L硫酸卡那黴素(Boehringer Mannheim;Indianapolis，IN)的B50/1/0愈傷組織誘導培養基中(B5鹽和維生素並補充1mg/L 2，4-D;0.6%Phytagar)。
在約85μEm-2S-1連續光照培養3-7天後，在切割表面可見愈傷組織，將胚軸組織移植塊轉移到芽誘導培養基B5BZ中(B5鹽和維生素、還補充了3mg/L苯氨基嘌呤，1mg/L玉米素，1%蔗糖、0.6%Phytagar調pH值至5.8)。該培養基還含有羧苄青黴素(500mg/L)和硫酸卡那黴素(25mg/L)。每兩周將胚軸組織移植塊轉至新鮮芽誘導培養基中進行亞培養。
1-3月後胚軸愈傷組織再生出芽。從愈傷組織切除至少1cm高的綠芽，放入含B5鹽和維生素，1%蔗糖、羧苄青黴素(300mg/L)，硫酸卡那黴素(500mg/L)和0.6%w/vPhytagar的培養基中。2-4周後，從基底部切除保持綠色的綠芽，轉移到含根誘生培養基(B5鹽和維生素、1%蔗糖、2mg/L吲哚丁酸、50mg/L硫酸卡那黴素和0.6%Phytagar)的Magenta箱中。
擬南芥屬植物的轉化轉基因Arabidposis thaliana植物可以通過Valverkens等人描述的經土壤農桿菌介導的轉化(Proc.Nat.Acad.Sci.85∶5536-5540，1988)而獲得。用Holsters等人的方法(Mol.Gen.Genet.163∶181-187，1978)將構建體轉化到土壤農桿菌細胞，如EHA101株中(Hood et al.，J.Bacterial.168∶1291-1301，1986)。
上述結果顯示了獲得在脂肪族醇形成中有活性的增溶性種子植物脂醯還原酶蛋白質的能力。本發明提供了獲得醯基還原酶蛋白及其胺基酸序列的方法。此外，還提供了還原酶核苷酸序列。可以加工處理這些核苷酸序列使之在宿主細胞中轉錄和/或在宿主細胞中表達還原酶蛋白，該蛋白質具有廣泛的用途。
本說明書引證的所有出版物和專利申請都引入本文作參考文獻，就象每一出版物或專利申請被特別和逐一指明引為參考文獻一樣。
為了清楚和理解起見，儘管說明書用說明和例證對前述發明進行了詳細地描述，但根據本發明的教導在不違背所附權利要求精神或範圍的前提下對本發明進行某種改動和修飾是本領域技術人員顯而易見的。
權利要求
1.一種部分純化的種子植物脂醯還原酶，其中所說的還原酶在從脂醯基底物形成脂肪族醇的過程中具有活性。
2.根據權利要求1的還原酶，其對脂醯輔酶A底物有活性。
3.根據權利要求1的還原酶，其對具有通式C2X碳鏈的脂醯基底物有活性，其中的X選自8-12。
4.根據權利要求1的還原酶，其中的還原酶是NADPH依賴性的。
5.根據權利要求1的還原酶，可以從希蒙德木屬胚中獲得。
6.根據權利要求5的還原酶，它實質上含有分子量約55KD的所說還原酶。
7.一種含有編碼至少部分脂醯還原酶的核苷酸序列的重組構建體，其中所說的還原酶在從脂醯基底物形成脂肪族醇的過程中具有活性。
8.根據權利要求7的重組構建體，其中所說的還原酶對脂醯輔酶A底物有活性。
9.根據權利要求7的重組構建體，其中所說的還原酶對具有通式C2X碳鏈的脂醯基底物有活性，通式中的X選自8-12。
10.權利要求7的重組構建體，其中所說的還原酶是NADPH依賴性的。
11.權利要求7的重組構建體，其中所說的核苷酸序列可從種子植物中獲得。
12.權利要求7的重組構建體，其中所說的核苷酸序列可以從希蒙德木屬獲得。
13.權利要求7的重組構建體，它進一步還包括一段至少使所說還原酶編碼序列在宿主細胞中轉錄的5′非編碼序列。
14.權利要求7的重組構建體，它進一步還包括一段使所說還原酶編碼序列在宿主細胞中表達的5′非編碼序列。
15.權利要求13的重組構建體，其中所說的還原酶編碼序列位於所說的5′非編碼序列的反意義方向。
16.權利要求13、14或15任何一個權利要求的重組構建體，其中所說的宿主細胞是植物細胞。
17.一種含有權利要求7所說重組構建體的細胞。
18.一種含有權利要求7所說重組構建體的植物細胞。
19.一種含有權利要求7所說重組構建體的芸苔屬植物細胞。
20.一種含有種子植物脂醯輔酶A還原酶的原核細胞。
21.一種在宿主細胞中生產脂醯基底物的方法，它包括培養含有重組構建體的宿主細胞，所說的重組構建體含有編碼脂醯還原酶的核苷酸序列，其中的還原酶在從脂醯基底物形成脂肪族醇的過程中具有活性，其中所說的還原酶編碼序列是由在宿主細胞起作用的調節因子控制的，在允許所說還原酶序列表達的條件下培養。
22.權利要求21的方法，其中所說的宿主細胞是種子植物胚細胞。
23.權利要求21的方法，所說的宿主細胞是芸苔屬。
24.權利要求21的方法，所說的核苷酸序列可從種子植物獲得。
25.一種溶解的種子植物脂醯基還原酶，其中所說的還原酶在從脂醯基底物形成脂肪族醇的過程中具有活性。
26.權利要求25的還原酶對脂醯輔酶A底物具有活性。
27.權利要求25的還原酶，對含有通式C2X碳鏈的脂醯基底物有活性，其中的X選自8-12。
28.權利要求25的還原酶，其中所說還原酶是NADPH依賴性的。
29.權利要求25的還原酶，它可從希蒙德木屬胚中獲得。
30.權利要求29的還原酶，它實質上含有分子量約55KD的所說還原酶。
全文摘要
本發明提供了部分純化的種子植物脂醯還原酶蛋白質，所說的蛋白質在從脂醯基底物形成脂肪族醇的過程中具有活性。特別感興趣的是分子量約54KD和52KD的希蒙德木屬胚還原酶蛋白質及可從中獲得的序列。同樣值得考慮的是可從這類脂醯還原酶獲得的胺基酸和核苷酸序列。
文檔編號C12N9/10GK1064312SQ9210220
公開日1992年9月9日 申請日期1992年2月22日 優先權日1991年2月22日
發明者J·G·梅茨, M·R·波拉德 申請人:加利福尼亞基因公司