刺參糖胺聚糖在細胞水平抗B肝病毒上的應用的製作方法

2023-05-30 19:59:56 2

專利名稱：刺參糖胺聚糖在細胞水平抗B肝病毒上的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種刺參糖胺聚糖的新用途，具體的說是將刺參糖胺聚糖用於在細胞水平抗B肝病毒。屬於生物天然活性物質的應用領域。

背景技術：
慢性B型肝炎是全球面臨的一個嚴峻的健康問題，中國、東南亞及非洲是HBV感染的高發區，同時這些地區HBV相關性肝病如原發性肝癌的發生率也顯著高於美洲中部和南部等HBV感染的低發區。慢性B型肝炎治療主要包括抗病毒、免疫調節、抗炎保肝、抗纖維化以及對症治療，其中進行有效抗病毒治療，持久抑制HBV DNA於PCR可檢測範圍以下是治療的關鍵。硫酸多糖無論在體內還是在體外，都顯示了不同程度的抗病毒、抗腫瘤和對免疫系統的調節作用。研究表明，硫酸多糖和其他聚陰離子物質可幹擾反轉錄病毒及其他病毒的吸附和侵入，有些表現出對各種反轉錄病毒的逆轉錄酶的抑制活性。硫酸多糖的抗病毒活性首先源於其聚陰離子特性，聚陰離子特性則主要源於其分子中的硫酸基。
刺參(stichopus japonicus selenka)又稱仿刺參，屬棘皮動物門海參綱楯手目刺參科仿刺參屬，具有較高的食用價值和養生保健作用，近年來，刺參的藥用價值日益受到重視。刺參糖胺聚糖是從刺參體壁中提取的一種硫酸化多糖，是多糖大分子鏈中單糖分子上的某羥基被硫酸根所取代而形成的一類多功能生理活性物質。是一種由D-N-乙醯氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-巖藻糖組成的分支雜多糖，其分子上含有豐富的硫酸酯基，屬於酸性粘多糖；氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖、硫酸酯基的分子比約為1∶1∶1∶4。對刺參糖胺聚糖活性的研究集中在抗腫瘤和抗血栓活性方面，對其抗病毒活性研究甚少。
目前慢性B型肝炎尚缺乏理想的治療手段，幹擾素(interferon，IFN)是治療慢性B型肝炎的首選藥物，但須每周皮下注射，副作用大，復發率高，且價格相對昂貴，限制了臨床廣泛應用。核苷(酸)類似物如拉米夫定(lamivudine)、阿德福韋(Adefovir)、恩替卡韋(Entecavir)、替比夫定(telbivudine)等療程長，隨著用藥時間的延長患者發生病毒耐藥變異的比例增高，且存在交叉耐藥。


發明內容
針對現有技術存在的不足，本發明所要解決的技術問題是，提供一種刺參糖胺聚糖的用途，將刺參糖胺聚糖用於在細胞水平抗B肝病毒，以便提供一種新的抗B肝病毒活性物質。
為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案是，將刺參糖胺聚糖用於在細胞水平抗B肝病毒。
其具體方式為將刺參糖胺聚糖用於對HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg表達以及HBV DNA複製的抑制；其包括下列內容 1、培養HepG2.2.15細胞作為體外HBV慢性感染模型。HepG2.2.15細胞系是由含兩個頭尾相連的adw型HBV全基因質粒轉染人肝腫瘤細胞系(HepG2)構建而成，體外培養能轉錄、翻譯HBV基因，持續較高水平表達HBsAg、HBeAg以及有生物活性的完整的Dane顆粒，其具有穩定性及類似於體內HBV複製過程等優點。
2、用不同濃度的刺參糖胺聚糖作用於HepG2.2.15細胞，用線粒體MTT轉化法檢測刺參糖胺聚糖的細胞毒性，繪製生長曲線。其為連續10天檢測細胞生長狀態，並以時間(天)為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，繪製生長曲線。該方法比較客觀，操作簡便，可間接反映活細胞的數量。藥物對細胞的毒性越大，存活的細胞數就會越少，MTT被代謝旺盛的活細胞線粒體脫氫酶還原成的藍紫色甲臢結晶就越少，甲臢被溶解後所測得的光密度值就越小，說明細胞存活率低。
3、根據細胞生長曲線，用線粒體MTT轉化法檢測刺參糖胺聚糖的細胞毒性，確定最大無毒濃度為1.0mg/ml，刺參糖胺聚糖在4mg/ml濃度以下，對HepG2.2.15細胞毒性較低，濃度為8mg/ml時對HepG2.2.15細胞的毒性較強。
4、用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測刺參糖胺聚糖對HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用，確定刺參糖胺聚糖對HBsA g、HBeAg的分泌有明顯的抑制作用的濃度為2mg/ml，並隨時間和濃度增強呈現量效和時效反應關係。
5、用螢光定量PCR(FQ-PCR)法檢測刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞HBV DNA複製的抑制作用，確定在病毒複製水平抑制了HBVDNA的合成，且呈現量效和時效反應關係。
發明人用不同濃度的刺參糖胺聚糖作用於HepG2.2.15細胞進行動態研究，刺參糖胺聚糖在4mg/ml濃度以下，對HepG2.2.15細胞毒性較低；濃度為8mg/ml時對HepG2.2.15細胞的毒性較強；2mg/ml時對HBsAg、HBeAg的分泌已有明顯的抑制作用，並隨時間和濃度增強，呈現一個明顯的量效和時效反應關係；治療指數TI＞2表明刺參糖胺聚糖可有效低毒的抗HBV。發明人採用實時螢光定量PCR法檢測刺參糖胺聚糖在作用HepG2.2.15細胞72h和144h後上清液中HBV DNA的含量，結果表明，刺參糖胺聚糖對HBV DNA具有顯著的抑制作用，即在病毒複製水平抑制了HBV的合成，且呈現一個明顯的量效和時效反應關係。由於在最大無毒濃度下刺參糖胺聚糖可顯著降低培養上清中的HBV DNA水平，說明藥物的細胞毒性對細胞外HBV DNA水平的影響很小，治療指數TI＞2，表明刺參糖胺聚糖在體外具有明顯地抗HBV作用，為有效低毒的抗HBV藥物。
本發明提供了刺參糖胺聚糖的一種新用途，將刺參糖胺聚糖用於在細胞水平抗B肝病毒，為人們提供了一種新的抗B肝病毒活性物質。
本發明所涉及的材料中DMEM培養基為美國Gibco公司產品；胎牛血清為杭州四季青公司產品；青黴素、鏈黴素為華北製藥廠產品；G418(genticin)為美國Gibco公司產品；胰蛋白酶，MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]，二甲基亞碸(DMSO)均為北京中昊時代生物技術中心產品。
本發明所涉及的儀器中，HBsAg和HBeAg酶聯免疫檢測試劑盒為上海科華生物技術有限公司產品；B型肝炎病毒核酸擴增螢光定量檢測試劑盒為中山大學安達基因股份有限公司產品。



下面結合附圖及其具體的實施例對本發明進一步洋細說明。
圖1是本發明實施例的HepG2.2.15細胞生長曲線。

具體實施例方式 下面是將刺參糖胺聚糖用於在細胞水平抗B肝病毒的實施例。
實施例1 培養HepG2.2.15細胞作為體外HBV慢性感染模型。
用青島大學醫學院微生物學教研室提供的HepG2.2.15細胞系，採用含10％胎牛血清、青黴素100IU/ml及鏈黴素100μg/ml、G418380μg/ml的DMEM培養基，37℃、5％CO2條件下培養。
實施例2 繪製HepG2.2.15細胞生長曲線。
由培養的HepG2.2.15細胞製備1×104個/ml單細胞懸液，接種於96孔板，每孔150μl，37℃、5％CO2、95％溼度連續培養10天，每日定時用MTT法測3個孔的吸光度值。方法為每孔加入MTT 20μl，用鋁箔包裹96孔板，37℃繼續培養4h，吸去上清，每孔加DMSO 150μl裂解細胞，充分混勻後分別將待測孔溶液轉移至另一96孔新板中，用酶標儀測定A值，檢測波長570nm，參考波長630nm。以時間為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，繪製圖1所示生長曲線。
如圖1所示，細胞接種後1-3天處於傳代後的生長潛伏期，其活力尚未恢復，不適於進行藥物幹預。3-9天細胞處於對數生長期，活力恢復，是進行藥物幹預的最佳時間段。因此，本實施例選擇細胞接種後3天和6天分別進行一次藥物幹預。9-10天細胞生長進入平臺期，鏡下觀察細胞貼壁面積約佔孔底面積的95％。
實施例3 檢測刺參糖胺聚糖的細胞毒性。
按實施例2的方法接種HepG2.2.15細胞，根據圖1所示細胞生長曲線，分別於接種後3天和6天用刺參糖胺聚糖進行一次藥物幹預。藥物濃度分別為0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml和8.0mg/ml，每濃度3個復孔，以等量的完全培養液為空白對照。每3天換新鮮含藥培養液，共2次，並觀察細胞形態，原細胞培養上清液分裝於0.5ml EP管中，保存於-20℃，用於藥物對HBsAg、HBeAg分泌抑制的檢測。第9天換不含藥物的培養液，用MTT法測各孔的吸光度值，定期觀察細胞狀態。檢測結果以細胞抑制百分率表示，使濃度-效應關係標準化，用於計算刺參糖胺聚糖的半數有毒濃度CC50。其中 細胞抑制百分率＝[(細胞對照A值-藥物作用組A值)/細胞對照A值]×100％； CC50＝Antilog[B+(50-＜50％抑制百分率)÷(＞50％抑制百分率-＜50％抑制百分率)×C]， 式中C＝A-B，A＝log(＞50％藥物濃度)，B＝log(＜50％藥物濃度)； 一般用治療指數TI評價藥物的臨床應用前景， 治療指數TI＝半數有毒濃度CC50/半數抑制濃度IC50， IC50為藥物對HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg分泌的半數抑制濃度； TI＞2為有效低毒，1＜TI＜2為低效低毒，TI＜1為毒性作用。
刺參糖胺聚糖的細胞毒性實驗結果見表1。如表1所示，不同濃度的刺參糖胺聚糖對HepG 2.2.15細胞均有毒性作用，隨著藥物濃度增高及作用時間延長，毒性作用逐漸增強，呈現明顯的量效和時效反應關係。刺參糖胺聚糖作用6天後對HepG2.2.15細胞的CC50為4.97mg/ml。1.0mg/ml組與對照組A值無統計學差異，確定1.0mg/ml為最大無毒濃度。
表1刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞的細胞毒性(n＝3)
其中與細胞對照組比較，aP＜0.01，bP＞0.05。
實施例4 刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞HBsAg和HBeAg表達的影響。
採用酶聯免疫吸附法(ELI SA)檢測刺參糖胺聚糖細胞毒性試驗中所收集樣本中的HBsAg和HBeAg。同時設HBsAg、HBeAg陽性、陰性對照組和空白對照。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測波長450nm，參考波長490nm。檢測結果以吸光度值表示，並計算藥物對HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeA分泌的半數抑制濃度IC50，方法同CC50。結果見表2和表3。
表2刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg的抑制效果(n＝3)
其中與細胞對照組比較，aP＜0.01。
從表2和3可見，刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞HBsAg和HBeAg的表達分泌均有抑制作用，並且隨著藥物濃度增加，抑制率逐漸增高；隨著藥物作用時間的延長，抑制率也逐漸增高。作用6天時IC50分別為1.69、1.85mg/ml，治療指數分別為2.94、2.69。
表3刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞分泌HBeAg的抑制效果(n＝3)
其中與細胞對照組比較，aP＜0.01。
實施例5 刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞HBV DNA複製的抑制作用。
用螢光定量PCR(FQ-PCR)法檢測HBV DNA。將2×104/ml的單細胞懸液加入24孔細胞培養板，每孔1ml，37℃、5％CO2條件下置CO2培養箱中培養72h後，吸除全部培養液。根據細胞毒性試驗結果，將刺參糖胺聚糖溶液2倍系列稀釋成2.0、1.0、0.5、0.25和0.125mg/ml5個終濃度，每個濃度設3個復孔，以等量的完全培養液作為空白對照。連續培養72h後，分別吸出上清液於1.5ml滅菌EP管中，-20℃保存。再次加入上述含不同濃度藥物的培養液繼續培養72h後，分別吸出上清液於1.5ml滅菌EP管中，-20℃保存。
按照B型肝炎病毒HBV核酸擴增PCR螢光定量檢測試劑盒使用說明書提取培養上清液中的HBV DNA，將各反應管放入螢光定量PCR儀，按以下條件進行擴增93℃預變性2min；93℃變性5s；57℃退火、延伸45s，共反應40個循環。擴增過程及螢光信號檢查、數據的儲存和分析均由儀器及自帶的軟體自動完成。結果見表4。
如表4所示，HepG2.2.15細胞經不同濃度刺參糖胺聚糖作用72h和144h後，用實時螢光定量PCR法檢測培養上清液中HBV DNA的含量。與空白對照組相比較，刺參糖胺聚糖在0.125mg/ml至最大無毒濃度1.0mg/ml作用72h和144h後，對HepG2.2.15細胞HBV DNA具有顯著的抑制作用，均可使HepG2.2.15細胞上清液中HBV DNA的拷貝數降低，且隨著藥物濃度和作用時間的增加，其抑制作用逐漸增強，呈現一個明顯的量效和時效反應關係。刺參糖胺聚糖在最大無毒濃度1.0mg/ml時抑制率分別為59.34％，63.64％。按作用144h後的抑制率計算刺參糖胺聚糖的半數有效濃度EC50為0.32mg/ml，治療指數為15.53。
表4刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞上清液中HBV DNA的抑制作用(x±s×105，n＝3)
其中與空白對照組比較aP＜0.05，bP＜0.01。
由以上各實施例的結果可知，用不同濃度的刺參糖胺聚糖作用於HepG2.2.15細胞，刺參糖胺聚糖在4mg/ml濃度以下，對HepG2.2.15細胞毒性較低；濃度為8mg/ml時對HepG2.2.15細胞的毒性較強；2mg/ml時對HBsAg、HBeAg的分泌已有明顯的抑制作用，並隨時間和濃度增強，呈現一個明顯的量效和時效反應關係；治療指數TI＞2，提示刺參糖胺聚糖可作為一種有效低毒的抗HBV新藥。用實時螢光定量PCR法檢測刺參糖胺聚糖在作用HepG2.2.15細胞72h和144後上清液中HBV DNA的含量，結果表明，刺參糖胺聚糖對HBV DNA具有顯著的抑制作用，即在病毒複製水平抑制了HBV的合成，且呈現一個明顯的量效和時效反應關係。由於在最大無毒濃度下刺參糖胺聚糖可顯著降低培養上清中的HBV DNA水平，說明藥物的細胞毒性對細胞外HBV DNA水平的影響很小，治療指數TI＞2，提示刺參糖胺聚糖在體外具有明顯地抗HBV作用，為有效低毒的抗HBV藥物。
權利要求
1.刺參糖胺聚糖在細胞水平抗B肝病毒上的應用。
2.刺參糖胺聚糖用於在病毒複製水平抑制HBVDNA的合成。
3.刺參糖胺聚糖在細胞水平抗B肝病毒上的應用的具體方式為將刺參糖胺聚糖用於對HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg表達以及HBV DNA複製的抑制；其包括下列內容
a、培養HepG2.2.15細胞作為體外HBV慢性感染模型；
b、用不同濃度的刺參糖胺聚糖作用於HepG2.2.15細胞，用線粒體MTT轉化法檢測刺參糖胺聚糖的細胞毒性，繪製細胞生長曲線；
c、根據細胞生長曲線，用線粒體MTT轉化法檢測刺參糖胺聚糖的細胞毒性，確定最大無毒濃度為1.0mg/ml，刺參糖胺聚糖在4mg/ml濃度以下，對HepG2.2.15細胞毒性較低，濃度為8mg/ml時對HepG2.2.15細胞的毒性較強；
d、用酶聯免疫吸附法檢測刺參糖胺聚糖對HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用，確定刺參糖胺聚糖對HBsAg、HBeAg的分泌有明顯的抑制作用的濃度為2mg/ml，並隨時間和濃度增強呈現量效和時效反應關係；
e、用螢光定量PCR法檢測刺參糖胺聚糖對HepG2.2.15細胞HBV DNA複製的抑制作用，確定在病毒複製水平抑制HBVDNA的合成，且呈現量效和時效反應關係。
全文摘要
本發明公開了刺參糖胺聚糖在細胞水平抗B肝病毒上的應用，應用的具體方式為將刺參糖胺聚糖用於對HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg表達以及HBV DNA複製的抑制。本發明提供了刺參糖胺聚糖的一種新用途，將刺參糖胺聚糖用於在細胞水平抗B肝病毒，為人們提供了一種新的抗B肝病毒活性物質。
文檔編號G01N33/576GK101816676SQ20101011284
公開日2010年9月1日 申請日期2010年2月12日 優先權日2010年2月12日
發明者宣世英, 辛永寧, 戰淑慧 申請人:青島市市立醫院