抑制sars病毒基因表達的小分子幹擾核糖核酸的製作方法

2023-05-31 05:44:36

專利名稱：抑制sars病毒基因表達的小分子幹擾核糖核酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及反義技術領域，具體的本發明涉及具有抑制SARS病毒複製和/或SARS病毒基因表達的小分子幹擾核糖核酸及其應用。
背景技術：
非典型肺炎即嚴重急性呼吸症候群(Severe Acute Respiratory SyndromeSARS)的病原體已經確認為一種冠狀病毒，該病毒是一種正鏈RNA病毒(GENEBANK登錄號NC_004718)，基因組為單鏈RNA，含有Poly(A)，總長接近30kb。病毒表面有約20nm左右棒狀結構，呈皇冠狀。該病原體具有很強的感染性和傳染性，病毒在患者體內經過早期複製過程後，在肺部引發大規模炎症反應，最終導致肺部組織損傷。
SARS病毒感染所引起的傳染性非典型肺炎嚴重危害了我國和世界多國人民的身體健康，也正在嚴重幹擾我國經濟的正常開展.它已成為當前我國一個嚴重的社會、政治、經濟問題。對SARS病毒，現無有效藥物抑制其生長。小分子核糖核酸(siRNA)是在RNAi(RNA幹擾)技術基礎上發展起來的。與它有關的技術被美國「Science」評為2001年度國際十大科技突破的第二條，2002年度國際十大科技突破的第一條，2003年被評為第四條。其作用原理主要是siRNA部分解鏈，與靶mRNA反向互補的片段與靶序列結合，體內的酶系將mRNA切斷。由此可抑制靶基因的表達。它是一個被認為是最有前途的核酸藥物技術。
RNA幹擾(RNA interference)是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默(gene silencing)。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA(mRNA)被降解，從而抑制了該基因的表達。RNA幹擾技術在探查基因功能和治療人類疾病方面有廣闊的應用前景。RNA幹擾的詳細機制尚不清楚。現有實驗資料提示，RNA幹擾過程主要有2個步驟(1)長雙鏈RNA被細胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶Dicer切成21～23個鹼基對的短雙鏈RNA，稱為小分子幹擾RNA(small interfering RNA，siRNA)；(2)小分子幹擾性RNA與細胞源性的某些酶和蛋白質形成複合體，稱為RNA誘導的沉默複合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，該複合體可識別與小分子幹擾性RNA有同源序列的mRNA，並在特異的位點將該mRNA切斷。小分子幹擾性RNA的發現不僅加深了人們對RNA幹擾機制的認識，同時突破了一個用長雙鏈RNA在哺乳類細胞中抑制基因表達時常常遇到的障礙，即非特異性作用。長於30個鹼基對的雙鏈RNA常常會激活蛋白激酶而誘發對蛋白質合成的非特異抑制。小分子幹擾RNA一般不會在哺乳類細胞中誘發這種非特異性抑制。用人工合成的小分子幹擾RNA可特異性地抑制哺乳類細胞中外源性或內源性基因的表達。實驗表明，長度為21-23個鹼基、3』末端有2個鹼基突出的小分子幹擾性RNA活性較高。小分子幹擾RNA誘發的基因抑制具有高度的序列特異性。RNA幹擾可以被看成是一種與免疫系統類似的防禦機制。那麼，通過RNA幹擾治療病毒感染性疾病在理論上完全可行。目前，已有很多研究表明通過RNA幹擾可以抑制病毒在細胞內複製，如人類免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰質炎病毒、人乳頭瘤病毒、B型肝炎病毒和C型肝炎病毒。但是，這些研究只是停留在實驗室體外培養細胞水平及初步的動物實驗水平，尚未有將小分子幹擾RNA用於人體試驗的結果。將RNA幹擾技術用於臨床治療人類疾病還有許多研究工作要做，如何將小分子幹擾性RNA安全、有效地導入靶組織或靶細胞就是一個必須解決的問題。儘管如此，大量的體外實驗研究資料已經顯現出該技術在基因功能研究中的應用前景和新藥開發中的巨大潛力。
SARS病毒RNA編碼多個蛋白質基因。其中，M蛋白、E蛋白、N蛋白均為SARS病毒所特有，人細胞中無替代其功能的其他蛋白質存在。如抑制這些蛋白質中的任何一個，SARS病毒的生長周期即不能完成，病毒生長即受到抑制。

發明內容
本發明的目的就是提供一組SARS病毒的小分子幹擾核糖核酸(siRNA)靶序列及其應用。
本發明的另一目的就是提供一組小分子幹擾核糖核酸、其載體、宿主細胞及其應用。
本發明的第一方面提供了一組SARS病毒的小分子幹擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其特徵在於，所述靶序列為SARS病毒M、N、E基因上的連續19-25個核酸。
較佳的，所述siRNA靶序列為與SEQ ID NO1-SEQ ID NO26中任意一條序列的連續18個核酸序列相同的序列。更佳的，所述的siRNA靶序列為SEQ IDNO1-SEQ ID NO26所示的任意一條序列。
本發明的第二方面提供了上述siRNA靶序列在篩選抗SARS病毒藥物中的應用。所述抗SARS病毒藥物為治療或預防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關疾病的藥物。
本發明的第三方面提供了一組小分子幹擾核糖核酸(siRNA)，其特徵在於，所述核糖核酸特異性地與與上述SARS病毒位點的mRNA相結合，且能抑制SARS病毒基因的表達和/或SARS病毒的複製。
較佳的，所述核糖核酸為具有19-25對鹼基的雙鏈RNA複合體，所述雙鏈中至少有18對鹼基互補。
在一優選例中，所述的核糖核酸包括一條正義鏈和一條反義鏈，所述反義鏈序列與上述siRNA靶序列有至少18個鹼基互補，正義鏈序列與所述反義鏈序列有至少18個鹼基互補。更佳的，所述正義鏈與反義鏈結合區域含19、20或21對鹼基互補。
在另一優選例中，所述反義鏈序列與SEQ ID NO1到SEQ ID NO29所示的任意一條序列有至少18個鹼基互補。較佳的，所述反義鏈序列為SEQ ID NO30到SEQ ID NO55所示的任意一條序列或與前述序列有連續18個鹼基相同的序列。
在另一優選例中，所述核糖核酸的雙鏈選自(1)反義鏈序列為SEQ ID NOX，正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29)，X為30-55中任一自然數；(2)反義鏈序列為SEQ ID NOX，正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29)，但與反義鏈5』端配對的正義鏈上相應位置的鹼基被替換為不配對的鹼基，X為30-55中任一自然數；(3)反義鏈序列為SEQ ID NO41，正義鏈序列為SEQ ID NO27；(4)反義鏈序列為SEQ ID NO54，正義鏈序列為SEQ ID NO28；(5)反義鏈序列為SEQ ID NO53，正義鏈序列為SEQ ID NO29。
較佳的，所述與反義鏈5』端配對的正義鏈上相應位置的鹼基的替換選自(1)C→U；(2)U→C；(3)A→G或I；(4)G→A或I。
在另一優選例中，上述核糖核酸的正義鏈和反義鏈的3』端連接有兩個以上脫氧寡核苷酸的末端。較佳的，所述末端為dTdT、dAdA、dCdC、dGdG或dIdI。更佳的，所述末端為dTdT。
本發明的第四方面提供了一種載體，其特徵在於，所述載體至少包含一條上述核糖核酸。較佳的，所述核糖核酸包括一個正義鏈區域和一個反義鏈區域，所述反義鏈區域包含與上述siRNA靶序列互補的序列，正義鏈區域序列與所述反義鏈區域序列互補。
在一優選例中，所述核糖核酸的雙鏈選自(1)反義鏈序列為SEQ ID NOX，正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29)，X為30-55中任一自然數；
(2)反義鏈序列為SEQ ID NOX，正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29)，但與反義鏈5』端配對的正義鏈上相應位置的鹼基被替換為不配對的鹼基，X為30-55中任一自然數；(3)反義鏈序列為SEQ ID NO41，正義鏈序列為SEQ ID NO27；(4)反義鏈序列為SEQ ID NO54，正義鏈序列為SEQ ID NO28；(5)反義鏈序列為SEQ ID NO53，正義鏈序列為SEQ ID NO29。
本發明的第五方面提供了一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞包含上述載體。較佳的，所述宿主細胞為哺乳動物細胞。更佳的，所述哺乳動物細胞為人類細胞。
本發明的第六方面提供了上述核糖核酸的應用，其特徵在於上述核糖核酸在製備治療和/或預防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關疾病的藥物中的應用。
本發明的第七方面提供了一種組合物，其特徵在於，它包括安全有效量的上述核糖核酸以及藥學上可接受的載體。較佳的，所述核糖核酸包含一條正義鏈和一條反義鏈，所述反義鏈為選自SEQ NO30到SEQ NO55所示的任意一條核苷酸序列，正義鏈區域序列與所述反義鏈區域序列互補。
本發明的第八方面提供了上述載體在製備治療和/或預防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關疾病的藥物中的應用。
本發明的第九方面提供了上述宿主細胞在製備治療和/或預防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關疾病的藥物中的應用。較佳的，所述宿主細胞為哺乳動物細胞。更佳的，所述哺乳動物細胞為人類細胞。
如本發明所用，術語「小分子幹擾核糖核酸」是指包含SEQ ID NO1-SEQID NO55所示序列的siRNA和其類似物，也指一系列化學物質，這些化學物質具有一系列核苷酸鹼基序列，能通過與SARS病毒的核苷酸鹼基氫鍵相互作用識別SARS病毒序列或其部分序列。
這些RNA類似物包括但不限於2』-O-烷基糖修飾、甲基磷酸脂、硫代磷酸酯、二磷酸酯、甲縮醛(formacetal)、3』-硫代甲縮醛(3』-thioformacetal)、碸、氨基磺酸酯和硝基骨架修飾、氨基化合物和其中鹼基部分已被修飾的類似物。而且，分子的類似物可以為多聚物，其中的核糖部分已被其它合適的部分修飾或替換，產生的多聚物包括但不限於嗎琳代類似物和肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)及其它類似物。這些類似物包括上述修飾的不同組合，包含連接基團和/或糖或鹼基的結構修飾來改進RNaseH介導的SARS病毒RNA的破壞、結合親和力、核酸酶抗性和/或其特異性。
在本發明中，術語「小分子核糖核酸」、「小分子幹擾核糖核酸」或「siRNA」「本發明核糖核酸」可互換使用，它們都指具有抑制SARS病毒表達的核糖核酸序列，包括正義鏈區域(SEQ ID NO1到SEQ ID NO29中任一條序列)和反義鏈區域(SEQ ID NO30到SEQ ID NO55中任一條序列)的核糖核酸(RNA)。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明的RNA序列。然後可將該RNA序列引入本領域中已知的各種現有的RNA分子(或如載體)和細胞中。
本發明也涉及包含本發明的核糖核酸的載體和用本發明的載體經基因工程產生的宿主細胞。所述載體可以是質粒、病毒顆粒及其他載體形式。表達載體中的核糖核酸序列可以可操作地和表達控制序列連接，還包含用於翻譯起始和轉錄終止的核糖體結合位點，優選的包含一個或多個選擇性標記。所述宿主細胞可以是細菌如大腸桿菌，真菌如酵母，昆蟲細胞如Sf9，動物細胞(尤其是哺乳動物細胞)如CHO、COS或人類的細胞等。通過本文的闡述，適當的載體、宿主細胞的選擇都在本領域技術人員的知識範圍內。
在治療應用中，本發明的核糖核酸能夠根據不同給藥方式配成製劑，包括口服、局部或局部化給藥。技術和配方通常在最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa中可以找到。活性組分為siRNA，其通常結合著一種載體如稀釋的賦形劑，包括裝填物、補充劑、接合劑、潤溼劑、分解質、表面活性劑、可降解的多聚物或潤滑劑、依賴於給藥模式的性質和配藥形式。典型的配藥形式包括藥片、藥粉，藥粒和膠囊，液體製劑包括懸浮液、乳化液和溶液。
本發明的核糖核酸特別適合於口服給藥，這在常規的藥物傳送條件下需要在將藥暴露於胃酸條件下長達4小時，當以持續釋放的形式呈遞時，能夠長達12小時。將這些siRNA配成以持續釋放形式的製劑對於治療非典型肺炎和由SARS病毒引起的疾病非常有利。
還可以通過跨黏膜或經皮方法獲得siRNA系統給藥，或口服複合物。對於跨黏膜或經皮給藥，適合於穿透屏障的滲透劑可以被用於製劑中。這些滲透劑在本領域中通常是已知的，包括，例如用於跨黏膜給藥的膽酸鹽和梭鏈孢酸衍生物。此外，去垢劑可以被用來協助透過。跨黏膜給藥，例如可以是通過用鼻腔噴霧，以及適合於吸入或栓劑給藥的製劑。鼻腔噴霧製劑可用於治療和/或預防非典型肺炎和由SARS病毒引起的疾病。
本發明的核糖核酸也能夠與適於被試者施用的可藥用載體結合。合適的藥物載體的例子為各種陽離子脂質體，包括但不限於N-(1-2，3-二油基氧)丙基-n，n，n-三甲基銨氯(N-(1-2，3-dioleyloxy)ProPyl)-n，n，n-trimethylammonium chloride)(DOTMA)和二油醯基磷脂酸基乙醇胺(dioleoylphophotidyl ethanolamine)(DOPE)。脂質體也是本發明的siRNA的合適載體。其它合適的載體為包含所要求的siRNA的緩釋凝膠或聚合體。
本發明的核糖核酸可以通過任何有效途徑施用給病人，包括肌肉注射、靜脈內注射、胸內注射、鼻內注射、腹膜注射、皮下注射、和口服給藥。口服給藥需要腸衣以保護所要求的反義分子和其類似物在胃腸道中不被降解。siRNA可以與一定量的生理上可接受的載體和稀釋劑混合，例如鹽溶液或其它合適的液體。
任何所施用的特定siRNA的實際用量依賴於很多因素，如疾病或感染的類型和階段、siRNA對體內其它細胞的毒性、其被細胞吸收的速率、施用反義分子的病人的年齡和體重。通過常規方法例如逐漸增加siRNA的劑量使其從對抑制細胞增殖無效到有效，可以確定病人的有效量。呈遞給疾病細胞的濃度範圍從5nM到約5μM都能夠有效抑制基因表達並表現出可檢測的表型。較佳的，濃度範圍從10nM到約100nM，如15號siRNA的較佳濃度為13nM。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。


圖1.RT-PCR循環圈數的確定。
圖2.RT-PCR循環數與DNA產量的關係曲線。
圖3.針對E基因的siRNA的篩選。
圖4.針對M基因的siRNA的篩選。
圖5.針對N基因的siRNA的篩選。
圖6.No.90號siRNA對SARS病毒E基因表達的抑制效果與其劑量的關係。
圖7.No.15號siRNA對SARS病毒M基因表達的抑制效果與其劑量的關係。
圖8.No.58號siRNA對SARS病毒N基因表達的抑制效果與其劑量的關係。
圖9.No.90號siRNA對GFP-E融合蛋白表達的抑制。
圖10.No.15號siRNA對GFP-M融合蛋白表達的抑制。
圖11.No.58號siRNA對GFP-N融合蛋白表達的抑制。
圖12.反義鏈5』端不配對的siRNA在Vero E6細胞中對SARS基因表達的抑制作用。
圖13.針對E基因的siRNA靶位點mRNA的二級結構模擬14.針對M基因的siRNA靶位點mRNA的二級結構模擬15.針對N基因的siRNA靶位點mRNA的二級結構模擬圖具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例一siRNA靶位點的設計對SARS病毒RNA進行二級結構計算機模擬。在M、N、E蛋白編碼區內和在負鏈RNA中選取下列位點

表1(二級結構模擬圖見附圖13、14、15)表1所示靶位點序列與相同編號的siRNA的正義鏈序列相同，其序列表中的序列號見最右側一例。本表格所示序列僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例二.siRNA的合成1.用Bechman Oligo 1000M合成儀(Bechman)合成siRNA的正義鏈和反義鏈(序列見表2，表3)。
2.退火形成siRNA1)將合成的siRNA正義反義鏈溶於焦磷酸二乙脂(DEPC)處理過的水中。
2)製備退火緩衝液(2x)200mM乙酸鉀，4mM乙酸鎂，60mM Hepes-KOH(pH7.4)。
3)製備20uM的siRNA貯存液2x退火緩衝液 100ulsiRNA正義鏈 Xul(使得終濃度為20uM)siRNA反義鏈 Yul(使得終濃度為20uM)水(DEPC處理) (100-X-Y)ul上述成分混勻，於90℃放置1分鐘，然後於37℃放置1小時。貯存於-20℃。
實施例三.siRNA在vero-E6細胞中抑制M、N、E蛋白表達的鑑定1.方法(1)細胞轉染用24孔細胞培養板進行細胞轉染實驗。
a.轉染前一天於24孔細胞培養板上每孔接種0.5×105個Vero-E6細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)，5％CO2培養箱37℃培養過夜。至轉染時細胞鋪滿孔面積的30-50％。
b.M、N、E蛋白表達載體的轉染用陽離子脂質體Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染試劑，按其操作說明進行轉染實驗。具體用量為每孔細胞加靶基因載體50ng，siRNA用量為0.75ug，Lipofectamine 2000 2ul。
c.6小時後補加胎牛血清至終濃度為10％。於5％CO2、37℃繼續培養至48小時後檢測。
(2)RT-PCR檢測a.轉染後48小時，除去培養基，用無菌PBS緩衝液清洗細胞三次。
b.用Trizol Reagent(GIBCO)抽提細胞總RNA溶於30ul水(RNase free)中。用無RNA酶(RNase free)的DNA酶(DNase)於37℃消化30分鐘，然後於60℃處理10分鐘將DNase熱滅活。
c.用One step RNA PCR kit(TaKaRa)對抽提的總RNA，取5ul為模板進行RT-PCR檢測，以確定siRNA的抑制效果並進行篩選。RT-PCR條件如下
50℃，30min；94℃，2min； 72℃，10min反應總體積為50ul。
d.RT-PCR循環數的確定以M基因為樣本，於24孔板中轉入50ng M基因的表達載體。24小時後抽總RNA溶於30ul水(RNase free)中。取5ul為模板，如上條件做RT-PCR。分別於20、25、26、27、28、29、32、34個循環處取樣20ul進行1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。實驗結果見圖1、圖2。由圖2可得，取28個循環做RT-PCR能較真實的反應模板量。
(3)siRNA對基因表達抑制率的計算 其中A為加藥組靶mRNA RT-PCR條帶的灰度；A』為加藥組作為RT-PCR對照的β-actine mRNA RT-PCR條帶的灰度；B為對照組靶mRNA RT-PCR條帶的灰度；B』為對照組作為RT-PCR對照的β-actine mRNA RT-PCR條帶的灰度。
(4)在蛋白水平檢測siRNA對SARS病毒基因表達的抑制作用由於目前尚未有針對SARS病毒結構及功能蛋白的抗體，因此，構建SARS病毒E，M及N蛋白基因與報告基因-綠色螢光蛋白(GFP)融合的哺乳動物細胞表達載體pEGFP/E，pEGFP/M，及pEGFP/N(GFP表達載體pEGFP-N3購自Clontech)。將siRNA與此GFP融合蛋白表達載體共轉染Vero E6細胞。48小時後，通過螢光顯微鏡(Olympus BX-50)檢測螢光的強度來判定蛋白的表達水平。
(5)針對E、M、N基因的siRNA的篩選方法。
將siRNA與E、M或N基因表達載體(pCDNA3.1/E，pCDNA3.1/M或pCDNA3.1/N)共轉染Vero E6細胞，48小時後抽提總RNA做RT-PCR檢測，將RT-PCR產物跑2％的Agarose凝膠電泳。A，B為兩次獨立實驗的電泳結果。C.兩次結果的凝膠圖象掃描測出條帶密度數據，以只轉pCDNA3.1/X(X即E、M或N)載體的結果做參照(抑制效果定為0％)計算出各種siRNA的抑制強度，取兩次結果的平均值作圖。實驗結果分別見圖3、4、5。具體結果見表2、表3。
2.結果1).siRNA的篩選I.篩選結果抑制效率＜30％的siRNA

表2抑制效率＞30％的siRNA

11的上表面所成的角度(以下稱作頭的打開角度)，θ2是上述凸部12a對上述切線的傾斜角度，θ3是上述壓紙輥1與上述發熱元件3的切線、和供記錄的介質7、8之中成為位於熱敏頭2的設置側的介質7、8(在本實施方式的情況下是墨帶8)的傳送路徑所成的角度，θ』是頭返回角度。這裡所謂的頭返回角度θ』是指上述凸部12a的傾斜角度θ2與角度θ1之差，θ1是上述壓紙輥1與上述發熱元件3的切線和上述基板11的表面所成的角度(參照式3)。
在這裡，有關θ』，如式3所示，示出了成為設定為3±1(°)的穩妥性的根據的實驗結果。
在本實驗中，使用上述L尺寸設定為1.4mm、密封部件14的頂點距離上述基板11的上表面的高度尺寸H設定為0.3mm、保溫層12的凸部12a的傾斜角度θ2設定為7°的熱敏頭2，來觀察調整了頭的打開角度θ1時的記錄狀態。其結果如下表所示，能得到良好記錄結果的是頭的打開角度θ1為3°的情況和5°的情況。根據上述結果，證明了上述式3所示的θ』＝3±1(°)成立。
表1


實驗結果○好△一般×差實施例六 No.58號siRNA對SARS病毒N基因表達的抑制效果與其劑量的關係。
方法同實施例四。圖8顯示13nM的No.58號siRNA就可達到50％的抑制效率。
實施例七 No.90號siRNA對GFP-E融合蛋白表達的抑制。
用30nM No.90號siRNA與SARS病毒E蛋白與綠色螢光蛋白的融合蛋白的表達載體(pEGFP/E)共轉染Vero E6細胞，48小時後用螢光顯微鏡觀察綠色螢光的強度。
A.只轉pEGFP/E載體(none)；B.pEGFP/E與非特異的對照siRNA共轉染(control)；C，pEGFP/E與No.90號siRNA共轉染。A，B，C為螢光檢測結果；D，E，F分別為同一視野下用明場觀察的細胞情況。G.分別計數每組實驗的四個視野中發綠色螢光的細胞的數目及總細胞數，換算成每500個總細胞中帶螢光的細胞的數目，取平均值。將control siRNA的抑制效率設定為0％時，可算得30nM的90號siRNA抑制效率為88.0％(見圖9)。
實施例八 No.15號siRNA對GFP-M融合蛋白表達的抑制。
用30nM No.15號siRNA與SARS病毒M蛋白與綠色螢光蛋白的融合蛋白的表達載體(pEGFP/M)共轉染Vero E6細胞，48小時後用螢光顯微鏡觀察綠色螢光的強度。
A，只轉pEGFP/M載體(none)；B，pEGFP/M與非特異的對照siRNA共轉染(control)；C，pEGFP/M與No.15號siRNA共轉染。A，B，C為螢光檢測結果；D，E，F分別為同一視野下用明場觀察的細胞情況。G.分別計數每組實驗的四個視野中發綠色螢光的細胞的數目及總細胞數，換算成每500個總細胞中帶螢光的細胞的數目，取平均值。將control siRNA的抑制效率設定為0％時，可算得30nM的15號siRNA抑制效率為89.4％(見圖10)。
實施例九.No.58號siRNA對GFP-N融合蛋白表達的抑制。
用30nM No.58號siRNA與SARS病毒N蛋白與綠色螢光蛋白的融合蛋白的表達載體(pEGFP/N)共轉染Vero E6細胞，48小時後用螢光顯微鏡觀察綠色螢光的強度。
A，只轉pEGFP/N載體(none)；B，pEGFP/N與非特異的對照siRNA共轉染(control)；C，pEGFP/M與No.58號siRNA共轉染。A，B，C為螢光檢測結果；D，E，F分別為同一視野下用明場觀察的細胞情況。G.分別計數每組實驗的四個視野中發綠色螢光的細胞的數目及總細胞數，換算成每500個總細胞中帶螢光的細胞的數目，取平均值。將control siRNA的抑制效率設定為0％時，可算得30nM的58號siRNA抑制效率為88.8％(見圖11)。
實施例十 反義鏈5』端不配對的siRNA在Vero E6細胞中對SARS基因表達的抑制作用1.依據根據Dianne S.Schwarz等人最新研究發現，siRNA雙鏈兩端配對的穩定性決定了哪一端更容易先解鏈，從而使該端為5』端的那條鏈更多的進入RISC複合體(一種siRNA與蛋白質的複合體，能特異性的降解靶基因mRNA)。(Cell，Vol 115，199-208，17 October 2003)選出三個siRNANo.8、No.51、及No.65，將正義鏈3』端最後一個核苷酸(21位)突變如下No.8*(正義鏈序列號為SEQ ID NO27)5』CGU CGC AGC GUG UAG GCA CUA dTdT 3』||| ||| ||| ||| ||| ||| ||о3』dTdT GCA GCG UCG CAC AUC CGU GAC 5』No.51*(正義鏈序列號為SEQ ID NO28)5』AAC GGU UUA CGU CUA CUC GCA dTdT 3』||| ||| ||| ||| ||| ||| ||о3』dTdT UUG CCA AAU GCA GAU GAG CGC 5』No.65*(正義鏈序列號為SEQ ID NO29)5』AAC GUA CUG CCA CAA AAC AGC dTdT 3』||| ||| ||| ||| ||| ||| ||о3』dTdT UUG CAU GAC GGU GUU UUG UCA 5』(注突變位點以帶下劃線的粗斜體標出，*表示帶突變的siRNA，下同。)用pCDNA3.1/E與No.51 siRNA或No.51*siRNA、pCDNA3.1/M與No.8 siRNA或No.8*siRNA、pCDNA3.1/N與No.65 siRNA或No.65*siRNA分別共轉染VeroE6細胞，以及單轉SARS病毒基因表達載體(none)或其與非特異組siRNA(control)共轉染Vero E6細胞，48小時後RT-PCR檢測SARS病毒基因表達水平。2％agarose電泳，EB染色(A)。灰度掃描條帶深淺，將control組抑制率設為0％，算出各組siRNA的抑制百分率(B)。
與反義鏈5』端第一個鹼基不配對的siRNA抑制SARS病毒基因表達的效果是正常組siRNA的1.5倍，可以按照這種方法將篩選過程中得到的抑制效果不佳的siRNA重新設計，應能使之能更有效的抑制SARS病毒基因的表達(見圖12)。
較佳的，與反義鏈5』端第一個鹼基不配對的siRNA的正義鏈3』端鹼基可按如下原則替換，嘧啶(包括C、U)與嘧啶替換，嘌呤(包括G、A)與嘌呤(包括G、A、I(次黃嘌呤))替換。如C與U互換，G替換為A或工。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國科學院上海生命科學研究院120抑制SARS病毒基因表達的小分子幹擾核糖核酸130XQ041027N16055170PatentIn version 3.1210121121212RNA213SARS冠狀病毒4001aaacuauaaa uuaaauacag a 21210221121212RNA213SARS冠狀病毒4002ugcugcuguc uacagaauua a 21210321121212RNA213SARS冠狀病毒4003uugcgaaugg ccggacacuc c 21210421121212RNA213SARS冠狀病毒
4004aacaaagaag gcaucguaug g 21210521121212RNA213SARS冠狀病毒4005ugaggcaucu aaaaagccuc g21210621121212RNA213SARS冠狀病毒4006aagagcuacc cgacgaguuc g 21210721121212RNA213SARS冠狀病毒4007aaggccaaaa cagcgccgac c 21210821121212RNA213SARS冠狀病毒4008uuucguggua uucuugcuag u 21210921121212RNA213SARS冠狀病毒4009uucgauugug ugcguacugc u 2121010
21121212RNA213SARS冠狀病毒40010uuaauaguua auagcguacu u 212101121121212RNA213SARS冠狀病毒40011ccagaccgcu cauggaaagu g 212101221121212RNA213SARS冠狀病毒40012cgucgcagcg uguaggcacu g 212101321121212RNA213SARS冠狀病毒40013agcuuaaaca acuccuggaa c 212101421121212RNA213SARS冠狀病毒40014uagcuacuuc guugcuuccu u 212101521121212RNA213SARS冠狀病毒
40015agagaucacu guggcuacau c 212101621121212RNA213SARS冠狀病毒40016uauuguaggc uugauguggc u 212101721121212RNA213SARS冠狀病毒40017uugcugcaua caaccgcuac c 212101821121212RNA213SARS冠狀病毒40018aauacaccca aagaccacau u 212101921121212RNA213SARS冠狀病毒40019aauccuaaua acaaugcugc c 212102021121212RNA213SARS冠狀病毒40020gauaauggac cccaaucaaa c 2121021
21121212RNA213SARS冠狀病毒40021aaggaggaac uuagauuccc u 212102221121212RNA213SARS冠狀病毒40022aauaauacug cgucuugguu c 212102321121212RNA213SARS冠狀病毒40023ucaaggaaca acauugccaa a 212102421121212RNA213SARS冠狀病毒40024aacguacugc cacaaaacag u 212102521121212RNA213SARS冠狀病毒40025aacgguuuac gucuacucgc g 212102621121212RNA213SARS冠狀病毒
40026ugaaggaguu ccugaucuuc u 212102721121212RNA213SARS冠狀病毒40027cgucgcagcg uguaggcacu a 212102821121212RNA213SARS冠狀病毒40028aacgguuuac gucuacucgc a 212102921121212RNA213SARS冠狀病毒40029aacguacugc cacaaaacag c 212103021121212RNA213SARS冠狀病毒40030ucuguauuua auuuauaguu u 212103121121212RNA213SARS冠狀病毒40031uuaauucugu agacagcagc a 2121032
21121212RNA213SARS冠狀病毒40032ggaguguccg gccauucgca a 212103321121212RNA213SARS冠狀病毒40033ccauacgaug ccuucuuugu u 212103421121212RNA213SARS冠狀病毒40034cgaggcuuuu uagaugccuc a 212103521121212RNA213SARS冠狀病毒40035cgaacucguc ggguagcucu u 212103621121212RNA213SARS冠狀病毒40036ggucggcgcu guuuuggccu u 212103721121212RNA213SARS冠狀病毒
40037acuagcaaga auaccacgaa a 212103821121212RNA213SARS冠狀病毒40038agcaguacgc acacaaucga a 212103921121212RNA213SARS冠狀病毒40039aaguacgcua uuaacuauua a 212104021121212RNA213SARS冠狀病毒40040cacuuuccau gagcggucug g 212104121121212RNA213SARS冠狀病毒40041cagugccuac acgcugcgac g 212104221121212RNA213SARS冠狀病毒40042guuccaggag uuguuuaagc u 2121043
21121212RNA213SARS冠狀病毒40043aaggaagcaa cgaaguagcu a 212104421121212RNA213SARS冠狀病毒40044gauguagcca cagugaucuc u 212104521121212RNA213SARS冠狀病毒40045agccacauca agccuacaau a 212104621121212RNA213SARS冠狀病毒40046gguagcgguu guaugcagca a 212104721121212RNA213SARS冠狀病毒40047aauguggucu uuggguguau u 212104821121212RNA213SARS冠狀病毒
40048ggcagcauug uuauuaggau u 212104921121212RNA213SARS冠狀病毒40049guuugauugg gguccauuau c 212105021121212RNA213SARS冠狀病毒40050agggaaucua aguuccuccu u 212105121121212RNA213SARS冠狀病毒40051gaaccaagac gcaguauuau u 212105221121212RNA213SARS冠狀病毒40052uuuggcaaug uuguuccuug a 212105321121212RNA213SARS冠狀病毒40053acuguuuugu ggcaguacgu u 2121054
21121212RNA213SARS冠狀病毒40054cgcgaguaga cguaaaccgu u 212105521121212RNA213SARS冠狀病毒40055agaagaucag gaacuccuuc a 2權利要求
1.一組SARS病毒的小分子幹擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其特徵在於，所述靶序列為SARS病毒M、N、E基因上的連續19-25個核酸。
2.如權利要求1所述的siRNA靶序列，其特徵在於，所述靶序列為SEQ ID NO1-SEQID NO26中任意一條序列。
3.權利要求1或2所述的siRNA靶序列在篩選抗SARS病毒藥物中的應用。
4.一組小分子幹擾核糖核酸(siRNA)，其特徵在於，所述核糖核酸特異性地與權利要求1所述的SARS病毒位點的mRNA相結合，且能抑制SARS病毒基因的表達和/或SARS病毒的複製。
5.如權利要求4所述的核糖核酸，其特徵在於，所述核糖核酸為具有19-25對鹼基的雙鏈RNA複合體，所述雙鏈中至少有18個鹼基互補配對。
6.如權利要求4或5所述的核糖核酸，其特徵在於，所述核糖核酸包括一條正義鏈和一條反義鏈，所述反義鏈序列與權利要求2所述siRNA靶序列有至少18個鹼基互補，正義鏈序列與所述反義鏈序列有至少18個鹼基互補。
7.如權利要求6所述的核糖核酸，其特徵在於，所述正義鏈與反義鏈結合區域含19、20或21對互補鹼基。
8.如權利要求6所述的核糖核酸，其特徵在於，所述反義鏈序列與SEQ ID NO1到SEQ ID NO29所示的任意一條序列有至少18個鹼基互補。
9.如權利要求4或5所述的核糖核酸，其特徵在於，所述核糖核酸的雙鏈選自(1)反義鏈序列為SEQ ID NOX，正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29)，X為30-55中任一自然數；(2)反義鏈序列為SEQ ID NOX，正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29)，但與反義鏈5』端配對的正義鏈上相應位置的鹼基被替換為不配對的鹼基，X為30-55中任一自然數；(3)反義鏈序列為SEQ ID No41，正義鏈序列為SEQ ID NO27；(4)反義鏈序列為SEQ ID NO54，正義鏈序列為SEQ ID NO28；(5)反義鏈序列為SEQ ID NO53，正義鏈序列為SEQ ID NO29。
10.如權利要求9所述的核糖核酸，其特徵在於，所述與反義鏈5』端配對的正義鏈上相應位置的鹼基的替換選自(1)C→U；(2)U→C；(3)A→G或I；(4)G→A或I。
11.如權利要求5所述的核糖核酸，其特徵在於，所述正義鏈和反義鏈的3』端連接有兩個以上脫氧寡核苷酸的末端。
12.如權利要求6所述的核糖核酸，其特徵在於，所述正義鏈和反義鏈的3』端連接有兩個以上脫氧寡核苷酸的末端。
13.一種載體，其特徵在於，所述載體至少包含一條權利要求4所述的核糖核酸。
14.一種哺乳動物細胞，其特徵在於，所述哺乳動物細胞包含權利要求10所述的載體。
15.如權利要求14所述的哺乳動物細胞，其特徵在於，所述哺乳動物細胞為人類細胞。
16.如權利要求4所述的核糖核酸的應用，其特徵在於所述核糖核酸在製備治療和/或預防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關疾病的藥物中的應用。
17.一種組合物，其特徵在於，它包括安全有效量的權利要求4或5所述的核糖核酸以及藥學上可接受的載體。
18.如權利要求17所述的組合物，其特徵在於所述的核糖核酸包含一條正義鏈和一條反義鏈，所述反義鏈為選自SEQ NO30到SEQ NO55所示的任意一條核苷酸序列，正義鏈區域序列與所述反義鏈區域序列互補。
全文摘要
本發明公開了一組能夠有效抑制SARS病毒RNA和蛋白表達的靶序列和小分子幹擾核糖核酸(siRNA)、其載體、哺乳動物細胞及其應用，所述siRNA可以用於製備治療和/或預防SARS病毒所引起的非典型肺炎及相關疾病的藥物。
文檔編號A61P31/14GK1648249SQ20041001600
公開日2005年8月3日 申請日期2004年1月19日 優先權日2004年1月19日
發明者金由辛, 史毅, 羅海峰, 李林, 陸長德 申請人:中國科學院上海生命科學研究院