一種提純柑橘果肉有色體的方法
2023-05-31 02:08:51 2
專利名稱：一種提純柑橘果肉有色體的方法
技術領域：
本發明屬於植物生物化學技術領域，具體涉及一種應用密度梯度離心技術提純柑 橘果肉有色體的方法。
背景技術：
質體是僅存在於植物和藻類細胞中的主要細胞器。質體參與光合作用，貯藏各種 各樣的產物，以及合成植物細胞基本構架及功能所需的關鍵分子。和線粒體一樣，質體由一 對同心膜組成的被膜包被。質體在半自主性上也與線粒體類似，具有合成一些自身蛋白所 需的遺傳機制。質體具有顯著的分化、去分化及再分化的能力。質體包括前質體，葉綠體， 白色體，有色體，造粉體。質體是植物特有的細胞器，在生物合成及代謝功能中起著重要作 用，其中包括光合作用的C固定、胺基酸、脂酸、澱粉以及次生代謝物的合成。有色體是一種 特殊的質體，因為它是來自於果實成熟或花粉發育中的葉綠體。有色體的主要功能是類胡 蘿蔔素合成和貯藏，使果實和花粉呈現各種色彩。葉綠體向有色體的轉變總是伴隨著葉綠 體的類囊體膜的降解。有色體類胡蘿蔔素的生化特性在不同植物中有相當大的區別雖然質 體有著重要生物學意義，但我們對質體的了解卻是相當有限。因此，為了更好的研究柑橘有 色體，第一要務是分離提純有色體。梯度離心是質體提純主要，有效，且節省的方法。一個理想的梯液要具備化學穩 定性好；高溶合度；低滲透性；在溶劑中穩定性；較低的光吸收特性；價廉等。如蔗糖是比 較合適的梯度材料。儘管它在高密度(>30% W/N)時粘性每數較大，但綜合比較表明它可 以廣泛應用。但由於蔗糖在各種密度時(即使是低密度時也如此)也有較高的滲透性，分 離一些對滲透性敏感的生物體組分時需要選擇其他梯度材料，如由Pharmacia公司開發的 Ficoll等等。對細胞，亞細胞結構或其他生物大分子的等密度離心分離各有不同要求。常 用於等密度離心梯度材料見表1所示表1常用於等密度離心梯度材料匯總
權利要求
一種提純柑橘果肉有色體的方法，其特徵在於，用海碘醇配成的溶液為梯度液，進行三次密度梯度離心，得到提純的有色體；其步驟包括(1)取甜橙果實，剝皮並去掉種子，將果肉切成塊狀，稱重80克樣品，加入300ml緩衝液A，用榨汁機榨汁8 10秒，將得到的果肉混合樣品通過兩層米拉濾布過濾，得到濾液；將濾液倒入離心管中，用離心機以400g離心5min，去沉渣後，得到上清液；將上清液用離心機的水平轉頭以6000g，離心10min，得到沉澱；將富集的沉澱加入12ml緩衝液A稀釋，得到待用的樣品Ⅰ，待用；(2)取10ml的離心管，用滅菌過的牛血清將內壁塗勻；用緩衝液A將重量體積比為30％的緩衝液B分別稀釋成重量/體積為24％，20％，15％的梯度稀釋液，體積分別為1.5ml、2.0ml、2.2ml、2.0ml配製成不連續密度梯度，取步驟(1)待用的樣品2ml加到密度梯度上面；用離心機在水平轉頭下以6750g，離心45min；吸取第一層即重量體積比為15％的有色體層，並將沉澱稀釋10倍，用離心機角轉頭以6000g離心7min得到沉澱，並將沉澱用2ml緩衝液A稀釋，得到待用樣品Ⅱ，待用；(3)取10ml的離心管，用滅菌過的牛血清將內壁塗勻；用緩衝液A將重量體積比為30％的緩衝液B分別稀釋成重量/體積為12.5％，10％，7.5％，5％的梯度稀釋液，體積分別為1.3ml，1.7ml，2.5ml，2.0ml配製成不連續密度梯度；取第(2)步待用的樣品Ⅱ2ml輕輕加到梯度上面，用離心機水平轉頭，以離心速度為6750g，離心45min，富集第二層即重量體積比為7.5％的有色體層，將富集的有色體層稀釋10倍，用離心機以離心速度6000g離心7min，去上清取並將沉澱稀釋5倍，以600g，離心15min，得到待用的樣品Ⅲ，待用；(4)將第(3)步富集得到待用的樣品Ⅲ為樣品，重複第(3)步驟；將富集得到的重量體積比為7.5％的有色體沉澱，稀釋10倍，離心6000g，7min以去掉多餘的海碘醇，沉澱稀釋10倍，再以離心速度為2000g，離心10min，得到最終的有色體；其中緩衝液A、B的配方組成如下緩衝液A1mM 焦磷酸四鈉；50mM 羥乙基哌嗪乙磺酸；pH＝6.8；330mM山梨醇；2mM 乙二胺四乙酸；1mM MgCl2；2mM MnCl2；2mM 二巰基蘇糖醇；緩衝液B按照重量/體積計的配方如下30％(W/V) 碘海醇；1mM 焦磷酸四鈉；50mM 羥乙基哌嗪乙磺酸；pH＝6.8；330mM 山梨醇；2mM 乙二胺四乙酸；1mM MgCl2；2mM 二巰基蘇糖醇。
全文摘要
本發明屬於植物生化領域。具體涉及應用密度梯度離心提純柑橘果肉有色體的方法。步驟是1)將甜橙果實加緩衝液A榨汁，過濾；濾液離心，取上清，離心，得沉澱；用緩衝液A稀釋，得樣品；2)取離心管，用滅菌牛血清塗勻內壁；用緩衝液A將30％的緩衝液B稀釋為梯度液，取樣品Ⅰ加到密度梯度上面，離心；富集重量體積比為15％有色體層，將沉澱稀釋，離心得沉澱，沉澱用緩衝液A稀釋，得樣品Ⅱ；3)取離心管，用滅菌牛血清塗勻內壁；用緩衝液A將30％的緩衝液B稀釋成梯度稀釋液；取樣品Ⅱ加到梯度上面，離心，富集7.5％的有色體層，稀釋，離心，去上清並將沉澱稀釋，離心，得樣品Ⅲ；4)取樣品Ⅲ，重複3)；將7.5％有色體沉澱，稀釋，離心，得柑橘果肉有色體。
文檔編號C12N5/04GK101948796SQ20101026037
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者徐強, 曾雲流, 潘志勇, 鄧秀新 申請人:華中農業大學