調控基因在病原體侵染早期誘導表達的fgi1啟動子及其應用的製作方法

2023-05-31 01:45:26 2

專利名稱：調控基因在病原體侵染早期誘導表達的fgi1啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和植物學領域；更具體地，本發明涉及調控基因在病原體侵染早期誘導表達的ren啟動子及其應用。
背景技術：
植物啟動子在調控植物基因表達中起關鍵的作用，可控制植物在特定組織、發育階段及不同環境條件中表達。啟動子按其功能分可分為組成型啟動子、組織特異型啟動子與誘導特異型啟動子。在作物抗病方面，目前國際上主流觀點認為組成型啟動子表達任何抗病基因，都會導致植物處於抗病防禦狀態(mode)，使植物防禦系統優先獲得能量與資源分配從而影響植物產量等經濟性狀。而這也被認為是目前採用轉基因手段的抗病應用尚未成功的原因。解決這一問題的一個合理方法是採用誘導特異性啟動子，控制抗病基因只在病原菌侵入的時候表達(Gurr, S. J.，and Rushton，P.J. (2005). Engineering plants withincreased disease resistance :how are we going to express it Trends inBiotechnology 23，283_290)。腺苷酸轉移酶(adenine nucleotide translocase,ANT) 是線粒體上含量最豐富的一類蛋白複合體。這類蛋白複合體定位在線粒體內膜上，既是生物體內的產能和耗能的主要連接，也是組成線粒體膜通透性轉換孔複合物(mitochondrial permeability transition pore complex，mtPTPC)的關鍵組分，參與調節線粒體膜通透性轉換孔的開放，與細胞凋亡緊密相關(Shen，Q. F.，Qin, F. S.，Gao, Z. Y.，Cui, J.，Xiao, H. , Xu, Ζ. H. , and Yang, C. L. (2009). AdenineNucleotide Translocator Cooperates with Core Cell Death Machinery To PromoteApoptosis in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology 29,3881-3893) ANT 是由核基因編碼的 2 個 32kD
的同(Notario, B. ， Zamora, Μ. ， Vinas, 0. ， and Mampel, Τ. (2003). All-trans-retinoic acid bindsto and inhibits adenine nucleotide translocase and induces mitochondrialpermeability transition. Molecular Pharmacology 63, 2M-231)，通過其構象的變化，實現細胞質中ADP和線粒體內ATP間的跨膜交換。已在人中陸續發現4種異構體ANT1-4，ANTl與細胞凋亡相關，ANT2與細胞增殖相關(Barath， P. , Luciakova, K. , Hodny, Ζ. , Li, R. G. , and Nelson, B. D. (1999). Thegrowth-dependent expression of the adenine nucleotide translocase-2 (ANT2)geneis regulated at the level of transcription and is a marker of cell proliferation. Experimental Cell Research 248，583-588)。前人研究表明，玉米中的腺核苷酸轉移酶由相似度高達 98 %的ANT-Gl與ANT-G2兩個基因共同編碼，這兩個基因除了 N端有一段延伸外，與真菌和哺乳動物的 ANT 基因高度同源(BathgateB, Baker A, Leaver CJ. (1989)Tffo genes encode the adenine nucleotide translocatorof maize mitochondria. Isolation, characterisation and expression of the structuralgenes. Eur J Biochem. 1989Aug 1 ；183(2) :303-10 ；Winning, B. Μ. ， Day, C. D. ， Sarah, C. J. ， and Leaver, C. J. (1991).Nucleotide sequence oftwo cDNAs encodingthe adenine nucleotide translocator from Zea mays L. Plant Mol Biol 17，305-307)，但玉米中 ANT-G1 與 ANT-G2 的功能及啟動子構建在本領域中至今未見報導。

發明內容
本發明的目的在於提供調控基因在病原誘導狀況下表達的ANT-G2基因(本申請中也稱為reii基因)啟動子及其應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的啟動子，所述的啟動子(a)分離自腺核苷酸轉移酶ANT-2編碼基因的上遊；(b)鹼基長度為500-900個；(c)具有引發轉錄的必要位點及轉錄起始點；且(d)具有響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達功能。在另一優選例中，所述的腺核苷酸轉移酶來源於玉米(Zea mays)。在另一優選例中，所述的啟動子含有TATA-盒和CAAT-盒結構。在另一優選例中，所述的啟動子的鹼基長度為600-800個。在另一優選例中，所述的啟動子是(I)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的啟動子；(2)核苷酸序列與SEQ ID NO 1有95%以上相同性且具有響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達功能的啟動子；(3)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(1)-( 任一限定的多核苷酸序列雜交且具有響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達功能的多核苷酸；或(4)核苷酸序列與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列完全互補的啟動子。在本發明的另一方面，提供一種載體，所述的載體含有前面任一所述的啟動子。在另一優選例中，所述的載體還含有與所述的啟動子可操作地連接的目的基因。在另一優選例中，所述的目的基因編碼具有特定功能的蛋白。在另一優選例中，所述的目的基因是外源基因。在另一優選例中，所述的目的基因是抗真菌蛋白基因、病程相關蛋白基因。在另一優選例中，所述的目的基因位於所述啟動子的下遊，且與所述啟動子區直接鄰近的編碼基因的序列。通常，所述啟動子與目的基因的間隔小於1000bp(優選的，小於 500bp ；更優選的，小於IOObp ；最優選的，小於50bp)。在本發明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的細胞含有前面任一所述的載體；或其基因組中整合有外源的前面任一所述的啟動子。在本發明的另一方面，提供一種製備能響應病原體侵染信號的植物方法，所述的方法包括將構建物轉化植物，所述的構建物含有前面任一所述的啟動子以及與所述的啟動子可操作地連接的目的基因，所述目的基因在病原體侵染狀態下表達。在另一優選例中，所述的方法包括(a)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述表達載體中含有構建物，所述的構建物含有所述的啟動子以及與所述的啟動子可操作地連接的目的基因；
(b)將植物細胞、組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使所述的構建物轉入植物細胞、組織或器官；(c)選擇出轉入了所述構建物的植物細胞、組織或器官；以及(d)將步驟(C)中的植物細胞、組織或器官再生成植物，所述植物中目的基因在病原體侵染狀態下表達。在另一優選例中，所述的植物是禾本科植物。在另一優選例中，所述的植物是水稻、玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥。在本發明的另一方面，提供前面任一所述的啟動子的用途，所述的啟動子用於響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達。在另一優選例中，所述的病原體是真菌。在另一優選例中，所述的病原體選自但不限於禾穀鐮孢(Fusariumgraminearum) 菌、禾S癌病菌(Magnaporthe oryzae)、尖抱鍵抱(Fusariumoxysporum)。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、pTG-19T-FGIl promoter載體圖譜。載體圖譜中啟動子標示為 Fgilpromoter0圖2、pCAM-FGIl promoter表達載體圖譜。載體圖譜中啟動子標示為 Fgilpromoter0圖3、轉reil ⑶S基因水稻葉片經禾穀鐮孢誘導後GUS活性檢測。A =TO代受侵染；B :T0代水對照；C :T1代受侵染；D :35S啟動子驅動GUS轉基因植株水對照；E 野生型受侵染；F 野生型水對照；G :35S啟動子驅動GUS轉基因植株代受禾穀鐮孢侵染。其中箭頭表示有GUS染色(藍色)處。圖4、更詳細的轉reii ⑶S基因水稻TO代葉片經禾穀鐮孢誘導後⑶S活性檢測。 包括轉基因株系reii-3、reii-4、reii-i5及野生型(中花ιι)陰性對照(對應於表4)。其中箭頭表示有GUS染色(藍色)處。圖5、更詳細的轉reii ⑶S基因水稻Tl代葉片經禾穀鐮孢誘導後⑶S活性檢測。 包括轉基因株系 FGI1-4、FGI1-8、FGI1-9、FGI1-11、FGI1-14、FGI 1-17(對應於表 4)。其中箭頭表示有GUS染色(藍色)處。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次分離到一個能夠響應病原體侵染信號，並調節目的基因特異性表達的啟動子。所述的啟動子對於在病原體侵染狀態下調節目的基因的表達以改變植物的抗病性是非常有用的。在此基礎上完成了本發明。術語如本文所用，所述的「植物(或作物、農作物)」包括任何種類的植物，只要該植物適合進行基因的轉化操作(轉基因操作)，如各種農作物、花卉植物、或林業植物等。所述的植物比如可以是雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。例如但不限於禾本科的水稻、小CN 102533754 A麥、大麥、高粱、玉米、黑麥；十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥屬植物；此外還包括菸草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更具體地，所述的植物包括(但不限於)小麥、大麥、 黑麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、櫻桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、檸檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆筍、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿蔔、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、菸葉、堅果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、天然橡膠樹和觀賞植物等。作為本發明的優選方式，所述的植物是禾本科植物，包括但不限於水稻、小麥、大麥、高粱、玉米、黑麥。如本文所用，除非另外說明，所述的「病原體」是指侵染植物的微生物，通常是對植物有害的微生物，導致植物發生病害。所述的病原體例如是病原真菌、病原細菌、植物病毒、 疫黴、線蟲。更具體的，所述的病原體選自病原真菌禾穀鐮孢(Fusarium graminearum) 菌(本文中也簡稱為禾穀鐮孢，又被稱為玉蜀黍赤黴GitDberella zeae)、稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)、尖抱鍵抱(Fusarium oxysporum)等。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的「可操作地連接」是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置於相對於目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被「可操作地連接」到該核酸序列上。如本文所用，所述的「啟動子」或「啟動子區(域)」是指一種核酸序列，其通常存在於目的基因編碼序列的上遊(5』端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。如本文所用，術語「特異性表達」是指目的基因在特定的時間和/或特定的組織和 /或特定的狀態表達。所述的「在病原體誘導狀況下表達的啟動子」是指在這類啟動子調控下，目的基因在病原體侵染的進程(包括病原體起始侵染的時候)中特異性表達，而在沒有病原體侵染的狀態下不表達。通常，如果在特定狀態(本文中該特定狀態一般指病原體侵染的狀態)下mRNA以比在其它狀態(如沒有病原體侵染的狀態)下高至少5倍，優選至少10倍，更優選至少高 100倍，更優選至少高1000倍水平被表達，則該啟動子被認為是在特定的時間和/或特定狀態下特異性驅動目的基因表達的。如本文所用，「外源的」或「異源的」是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關係。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對於該目的基因來說是外源的。特定序列對於其所插入的細胞或生物體來說是「外源的」。如本文所用，「順式調控元件」是指對基因的轉錄起始和轉錄效率起調節作用的保守性鹼基序列。如本文所用，「目的基因」是指可由本發明的啟動子啟動或指導表達的基因。合適的目的基因包括但不限於改良植物抗病性、性狀或代謝相關的基因。合適的目的基因包括但不限於抗真菌蛋白編碼基因、病程相關蛋白基因(pathogenesis-related genes， PR1—PR17)。白勺；) 禾呈才目PR—l (cysteine—rich secretary protein 富含半胱氨酸分泌蛋白)、PR-2 β -1,3-glucanase葡聚糖酶、PR-3Chitinase幾丁質酶、 PR-4Chitinas 幾丁質酶、PR-5Thaumatin_like 甜蛋白類似、PR-6Proteinase-inhibitor I 蛋白酶抑制劑、PR-7Endoproteinase 蛋白內切酶、PR_8chitinase type III 幾丁質酶、PR-91ignin-formingperoxidase 過氧化物酶、PR-IORibonuclease-Iike 核糖核酸酶類似蛋白、PR-IlChitinase 幾丁質酶、PR_12Defensin 防禦素、PR_13Thionin 硫素、PR-14Lipid-transfer protein 轉月旨蛋白、PR_150xalate oxidase 草酸氧化酶、 PR-160x0LP Oxalate-oxidase-like 草酸氧化酶類似蛋白等，參見 van Loon, L. C.， Μ. Rep, et al. (2006). 「 Significance of inducible defense-related proteins in infectedplants. 「 Annu Rev Phytopathol 44:135-62。所述的目的基因還可以是 H. Wongand Τ.B.Ng, Gymnin, a potent defensin-like antifungal peptide from the Yunnanbean Gymnocladus chinensis Baill, Peptides 24 (2003), pp.963-968. 2 ； BenhamouN, Broglie K, Broglie R, Chet I.Antifungal effect of bean endochitinase onRhizoctonia solani ultrastruetural changes and cytochemical aspect of chitinbreakdown. Can J Microbiol 1993 ；39 :318-28. 3 ；Broekaert WF, Van Parijs J, LeynsF, Joos H, Peumans WJ. A chitin—binding lectin from stinging nettle rhizomes withantifungal properties. Science 1989 ；245 :1100-2 中 艮導的那些。如本文所用，所述的「含有」，「具有」或「包括」包括了「包含」、「主要由......構
成」、「基本上由......構成」、和「由......構成」；「主要由......構成」、「基本上
由......構成」和「由......構成」屬於「含有」、「具有」或「包括」的下位概念。如本文所用，所述的「rei 1 」、"FGI-1 」可互換使用。啟動子本發明提供了一種在病原體侵染狀態下特異性表達的啟動子，所述的啟動子具有以下特點(a)分離自腺核苷酸轉移酶(本文中簡稱為ANT-G2或TOI1)編碼基因的上遊； (b)鹼基長度為500-900個；(c)具有引發轉錄的必要位點及轉錄起始點；且(d)具有響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達功能。作為本發明的一種實施方式，所述的啟動子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的啟動子。多核苷酸的雜交是本領域技術人員熟知的技術，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發明還涉及與前述指定的核苷酸序列(如SEQ ID NO 1) 雜交且兩個序列之間具有至少50 %，較佳地至少70 %，更佳地至少80 % (例如85 %、90 %、 95^^96^^97%,98%、或99% )相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述的多核苷酸(如SEQ ID NO 1)可雜交的多核苷酸。「嚴格條件」(或「嚴緊條件」)是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲醯胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優選60% 以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優選是95%以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸也具有響應病原體侵染信號的功能。
本發明還包括與本發明的任一種啟動子序列具有50%或以上(優選60%以上， 70%以上，80%以上，更優選90%以上，最優選95%以上，如98%、99% )相同性的核酸，所述核酸也具有響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達功能。「相同性」是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。應理解，儘管本發明的實例中提供了來源於玉米的該啟動子及其功能，然而，來源於其它類似的植物的與該啟動子具有一定相同性(保守性)的啟動子也包括在本發明的範圍內，只要本領域技術人員在閱讀了本申請後根據本申請提供的信息可以方便地從其它植物中分離得到該啟動子。在本發明的具體實施例中，以玉米基因組DNA為模板，運用PCR的方法克隆了本發明的啟動子序列，將其構建至帶有融合基因GUS的植物表達載體pCAMBIA1300上，通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化，獲得reilpromoter: :GUS轉基因植株，對TOIl啟動子進行了啟動活性及病原菌誘導性分析。在轉基因水稻愈傷組織中能夠檢測到GUS活性，表明該啟動子具有啟動活性。在幼苗生長時期，其根與葉均未檢測到GUS活性，表明在一般生長條件下， reil啟動子不驅動下遊基因表達；而在禾穀鐮孢(Fusarium graminearum)菌侵染後，TOIl 啟動子驅動的⑶s活性有上調表達。因此認為rei 1啟動子具有驅動⑶S基因在受到病原體侵染早期誘導表達的啟動活性。啟動目的基因表達本發明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對於啟動子而言可以是外源(異源)的。對所述目的基因的核酸序列沒有特別的限制(如一種功能性或結構性核酸序列)，所述的目的基因優選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些具有抗病原體功能的蛋白。本發明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進的目的基因序列上，該目的基因相對於啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進來產生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進來增加必需胺基酸的含量，提高胺基酸序列的翻譯，改變翻譯後的修飾(如磷酸化位點)，將翻譯產物轉運到細胞外，改善蛋白的穩定性，插入或刪除細胞信5寸。此外，啟動子和目的基因可以設計成下調特定基因。這一般是通過將啟動子連接到目的基因序列上來實現，該序列以反義反向被引導。本領域的普通技術人員熟悉這種反義技術。任何核酸序列可以以這種方式被調節。任何一種前述的啟動子和/或目的基因序列可被包含在重組載體中。作為一種方式，所述的重組載體包括本發明的啟動子，在所述啟動子的下遊包含多克隆位點或至少一個酶切位點。當需要表達目的基因時，將目的基因連接入適合的多克隆位點或酶切位點內，從而將目的基因與啟動子可操作地連接。作為另一種方式，所述的重組載體包括(從5』到3』方向)啟動子，和目的基因。 如果需要，所述的重組載體還可以包括3』轉錄終止子，3』多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉運和靶向核酸序列、抗性選擇標記、增強子或操作子。用於製備重組載體的方法是本領域熟知的。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。當用於植物時，其也可以是一種真核表達載體。總之，只要其能夠在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都是可以被採用的。一些載體的選擇是本領域技術人員可以獲知的。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含有本發明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。 表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新黴素抗性、潮黴素抗性以及綠色螢光蛋白 (GFP)等。重組載體中除了含有本發明的啟動子，還可含有一種或多種其它啟動子。所述的其它啟動子例如是組織特異性的、組成型的或誘導型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花葉病毒 19S 和!35S(CaMV19S CaMV35S)、增強的 CaMV、菸草 RB7 等。包含上述適當的啟動子和目的基因的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞；酵母；植物細胞等。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgC12。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法、花芽浸泡法等。對於轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得轉基因的植物。作為一種方式，製備轉基因植物的方法是將攜帶啟動子和目的基因(兩者可操作地連接)的載體轉入農桿菌，農桿菌再將含啟動子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉基因受體植物例如是水稻、小麥、玉米、擬南芥、菸草、果樹等等。在本發明的實例中，所述的重組載體是pCAMBIA載體，其自帶β -葡萄糖苷酶 (GUS)基因，將本發明的啟動子構建到該載體中GUS基因的上遊，轉化植株，啟動子將激活 GUS基因的表達，所述啟動受到啟動子區各順式作用元件的調控，模擬了基因在體內被激活轉錄的狀況。葡萄糖苷酶(GUQ能催化裂解一系列的葡萄糖苷，產生具有發色團或螢光的物質，可用分光光度計、螢光計或組織化學等方法對GUS活性進行定量和空間定位分析。在本技術領域中，GUS基因已被廣泛地用作轉基因植物、細菌和真菌的報告基因， 特別是其可被用於研究外源基因表達的具體細胞和組織部位。通常本領域已經達成如下共識若是一種啟動子能夠驅動GUS基因表達，則其也能夠驅動GUS基因以外的其它目的基因的表達。應用根據本發明的實施例，基於由雷射顯微切割技術獲得的受禾穀鐮孢侵染早期的玉米細胞的實時定量PCR結果，線粒體腺核苷酸轉移酶基因(ANT-G》明顯上調表達，且具有特異性。根據本發明的實施例，本發明的啟動子驅動GUS報告基因的轉基因水稻的葉片在未受侵染時經⑶S染色未見⑶S基因表達，受侵染時經⑶S染色顯示可見表達。以35S啟動子驅動GUS報告基因的轉基因水稻，未受侵染時經GUS染色顯示可見表達。本發明的啟動子在理論研究和農藝改良中具有重要的應用價值。本發明可廣泛應用於植物基因工程啟動子作為植物基因工程中一個重要工具可與目標基因融合，通過轉基因載體，轉化植物並獲得轉基因植株。在植物受到病原體侵害 (侵染)時，該啟動子便會啟動下遊目標基因(可以是感興趣的任何可以改變農藝性狀的功能基因，特別是抗病原體侵害的基因)的表達，從而達到在病原體侵害狀態下控制某一功能基因表達的目的。本發明得到的啟動子可以用於轉基因農作物(如水稻、玉米等)中驅動特定的其它基因(如抗病原體基因)，使該基因在轉基因植株受病原體侵染早期表達，從而達到在有病原體威脅時發揮抗病蟲害保產的作用，而在無病害威脅時保持關閉有利於能量和營養的分配向高產傾斜。用本發明的啟動驅動植物抗病原體基因，可在受到病原體侵染時，迅速作出反應，防禦病原體的侵染，從而更有效的在發病早期及時阻止發病，同時又區別於組成型表達啟動子，可在抗病原體的同時而又不影響農作物的產量。本發明的主要優點在於(1)本發明的啟動子屬於特異型啟動子。它在植物受到病原體侵染的狀態下，響應侵染信號，才啟動下遊基因表達，而在植物未受到病原體侵染的狀態下表達量很低或不表達，其既能使外源基因在植物體內有效發揮作用，同時又減少該表達對植物的不利影響。(2)目前在作物抗病方面多採用的是一些組成型表達的啟動子，如花椰菜花葉病毒O^MV)35S啟動子、玉米ubiquitin啟動子，本發明得到的啟動子比這些組成型表達啟動子更特異。該啟動子只在作物受到侵染時表達，而在作物正常時期不表達。(2)本發明的啟動子具有響應迅速的特性。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory ft~ess，第三版，2002)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。材料與方法材料i (Zea mays) ηππ 禾中 Β73 ^ 自 The Maize Genetics Cooperation Stock Center (美國 University of Illinois)或參見 Schnable, P. S. , D.Ware, et al. (2009). " TheB73maize genome-complexity, diversity, and dynamics. " Science 326(5956) :1112-5 ；水稻品種「中花 11」 (Oryza sativa japomca Zhonghua 11)參見中國專利 2005101106 . 9、禾穀鐮孢(Fusarium graminearum)菌株 PH-1 購自 FungaWenetics Stock Center (http ://www. fgsc. net/)參見Cuomo, C. A.，U. Guldener，etal. (2007). " The Fusarium graminearum genome reveals a link between localizedpolymorphism andpathogen specialization. " Science 317(5843) :1400_2、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105 參見 Hood, Ε· Ε·等，1993, NewAgrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgen. Res. 2 :208-218 ；pCAMBIA1300 質粒購自 CAMBIA 公司；pTG-19T質粒購自TaRaKa公司。試驗用抗生素濃度為卡那黴素(Kan) 50 μ g/ml、氨苄青黴素(Amp) 100 μ g/ml。限制性內切酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶等為TaRaKa公司產品；5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)購自前程生物科技公司；氨苄青黴素(Amp)、 卡那黴素(Kan)購自鼎國生物科技公司。ANT-G2基因表達檢測設計兩對RT-PCR引物檢測基因上表達情況Fgi-IprimerFl :CGAGGCCTGTATTTCGGACTTTACG(SEQ ID NO 4)；Fgi-IprimerRl :GCACCGTTGGTGATCAGCCA(SEQ ID NO 5)；Fgi-lprimerF2 TGATGATGACTTCTGGTGAGGGTGT(SEQ ID NO 6)；Fgi-lprimerR2 TTAGCACCAGCACCCTTGAACAG(SEQ ID NO 7)。FGIl啟動子的克隆與序列分析根據Rill基因序列，設計了分別含有EcoRI和BamHI酶切位點的TOIl基因啟動子的上下遊引物FGIlF :5，-GAATTCTCCGTTTCTCCATAGGTG-3，(SEQ ID NO 8)；FGIlR :5，-GGATCCCCTCAAAACTGTTGGCTG-3，(SEQ ID NO :9)。參照《分子克隆實驗室指南》上CTAB法提取玉米葉片總DNA。以玉米總DNA為模板，以前述上下遊引物PCR擴增reil啟動子序列，連接至PTG-19T質粒，轉化E. coli DH5 α 感受態細胞，藍白斑篩選獲得重組質粒。送至博尚測序公司進行序列測定。測序結果至 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ 與 http://www. maizesequence. org/ 進行比對。FGI lpromoter :GUS表達載體的構建和轉化將克隆的Rill啟動子片段用EcoRI和BamHI酶切，回收後與pCAMBIA1300 的EcoRI和BamHI酶切載體進行連接，得到TOIl啟動子與⑶S基因融合的表達載體 FGIlpromoter:⑶S ；通過凍融法將表達載體轉入根癌農桿菌EHA105菌株中。取授粉後 12-15天的水稻未成熟種子用70% (ν/ν)酒精消毒lmin，再用2% (ν/ν)次氯酸鈉溶液消毒 90min以上，無菌水衝洗4-5次；取幼胚在誘導培養基上^TC暗培養7天左右誘導得到愈傷組織備用。參照 Hiei 等的方法(Hiei，Y. ,Ohta, S. ,Komari,Τ.，and Kumashiro,T. (1994). EfficientTransformation of Rice (Oryza-Sativa L)Mediated by Agrobacterium andSequence-Analysis of the Boundaries of the T-DNA. Plant Journal 6,271-282), 進行農桿菌介導的遺傳轉化、轉化子篩選和轉基因植株再生。病原菌誘導處理將reilpromoter:⑶S轉基因植株的TO代及Tl代進行啟動子的功能驗證，取生長約8周的轉基因水稻葉片，使用尖頭鑷子劃傷葉片背部，從葉脈剪開，一半進行禾穀鐮孢 (Fusarium. graminearum)菌株PH-1 (菌懸浮濃度為1 X 108cfu/ml)接種處理，另一半水處理對照。4 後，對處理後的水稻葉片進行⑶S活性檢測，設置3次重複實驗。⑶S活性檢測參照 Jefferson 的方法(Jefferson, R. Α. (1987). Assaying chimeric genesinplants :the GUS gene fusion system.Plant Molecular Biology Reporter 5， 387-405)，對水稻組織進行染色和⑶S活性檢測。在37°C下染色8h，用95%乙醇脫色處理至陰性對照材料呈白色。顯微鏡下觀察拍照保存。實施例實施例i、reii基因表達檢測結果本發明人檢測了內源的reii基因在被禾穀鐮孢侵入或未侵入情況下的表達情況，結果見表1。表權利要求
1.一種分離的啟動子，其特徵在於，所述的啟動子(a)分離自腺核苷酸轉移酶ANT-2編碼基因的上遊；(b)鹼基長度為500-900個；(c)具有引發轉錄的必要位點及轉錄起始點；且(d)具有響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達功能。
2.如權利要求1所述的啟動子，其特徵在於，所述的啟動子是(1)SEQID NO 1所示的核苷酸序列的啟動子；(2)核苷酸序列與SEQID NO :1有95%以上相同性且具有響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達功能的啟動子；(3)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(1)-( 任一限定的多核苷酸序列雜交且具有響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達功能的多核苷酸；或(4)核苷酸序列與SEQID NO :1所示的核苷酸序列完全互補的啟動子。
3.一種載體，其特徵在於，所述的載體含有權利要求1-2任一所述的啟動子。
4.如權利要求3所述的載體，其特徵在於，所述的載體還含有與所述的啟動子可操作地連接的目的基因。
5.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，所述的細胞含有權利要求3-4任一所述的載體；或其基因組中整合有外源的權利要求1-2任一所述的啟動子。
6.一種製備能響應病原體侵染信號的植物方法，其特徵在於，所述的方法包括將構建物轉化植物，所述的構建物含有權利要求1-2任一所述的啟動子以及與所述的啟動子可操作地連接的目的基因，所述目的基因在病原體侵染狀態下表達。
7.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的方法包括(a)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述表達載體中含有構建物，所述的構建物含有權利要求1所述的啟動子以及與所述的啟動子可操作地連接的目的基因；(b)將植物細胞、組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使所述的構建物轉入植物細胞、組織或器官；(c)選擇出轉入了所述構建物的植物細胞、組織或器官；以及(d)將步驟(c)中的植物細胞、組織或器官再生成植物，所述植物中目的基因在病原體侵染狀態下表達。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，所述的植物是禾本科植物。
9.權利要求1-2任一所述的啟動子的用途，其特徵在於，所述的啟動子用於響應病原體侵染信號並啟動目的基因特異性表達。
10.如權利要求9所述的用途，其特徵在於，所述的病原體是真菌。
全文摘要
本發明涉及調控基因在病原體侵染早期誘導表達的FGI1啟動子及其應用。本發明首次分離到一個能夠響應病原體侵染信號，並調節目的基因特異性表達的啟動子。所述的啟動子對於在病原體侵染狀態下調節目的基因的表達以改變植物的抗病性是非常有用的。
文檔編號C12N15/82GK102533754SQ20101060235
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者唐威華, 張棟, 蔡秀玲, 許麗娜, 馬騰飛 申請人:中國科學院上海生命科學研究院