Mlcr探針、二步反應模式和懸浮晶片檢測用捕獲探針的製作方法

2023-05-31 06:25:41

專利名稱：Mlcr探針、二步反應模式和懸浮晶片檢測用捕獲探針的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因檢測，特別是涉及一種MLCR探針、二步反應模式和懸浮晶片檢測 用捕獲探針。
背景技術：
現有基因檢測方法一般以檢測DNA為主。針對DNA直接檢測的技術如Southern 雜交法、螢光納米、化學發光等均只能檢測到1 lOOfmol/L水平，檢測靈敏度低。普通聚 合酶鏈反應(polymerase chain reac tion，縮寫為PCR)檢測靈敏度高、特異性強且成本低 廉。實時螢光PCR法在常規PCR基礎上添加了一條螢光探針，可利用螢光信號積累實時監 測整個PCR進程，無需電泳等PCR後處理步驟，因而檢測快速，特異性和靈敏度極高，在基因 檢測中居核心地位。但是，普通、巢式和實時螢光PCR檢測的每管只進行一對引物的PCR反 應，一次只能分析少數樣品或基因位點，不能實現高通量的檢測；且PCR檢測所針對的目標 區較大，不適於高度降解DNA樣品的基因檢測。至於多重PCR檢測的單管雖可同時檢測多個 基因，但引物之間的相互幹擾和引物多聚體的形成很難確保所有擴增反應成功，易漏檢。基 因晶片固相和液相檢測法雖容量大、靈敏度較高，但只能分析現成樣品，作為一檢測平臺， 本身不能實現檢測信號大容量地擴增，其高效能的實現完全依賴於待分析樣品的製備。為實現大通量、超靈敏、高特異的基因檢測，首先必須能對多基因檢測目標進行信 號擴增。現有的連接酶鏈式反應(Ligase chain reaction，縮寫為LCR)是Backman於1997 年為檢出靶基因序列中的點突變而發明的，其原理是針對感興趣基因位點設計一探針對或 引物對，若探針於目標序列復性並留下一缺口，則耐熱連接酶即可封閉這一缺口，從而使這 一探針對轉變為下一輪探針對復性的模板，這樣經30次94°C變性和65°C復性連接，大量的 探針對就被連接成與被測基因序列相同的連接產物。該方法特異性強，可用於單基因點突 變的檢測，也可用於多基因檢測。J. Mano等應用此技術成功實現7基因位點的同時檢測， 並命名為Multiplex LCR(縮寫為MLCR)。然而，此法檢測靈敏度低，MLCR不能直接檢測基 因組DNA，只能檢測MPCR產物，被稱之為MPCR-MLCR基因檢測方法。此外，MLCR利用反應 片段長度大小定義各檢測基因，還限制了同時檢測檢驗的數目，使MLCR的高通量受到了限 制，因為，化學合成法合成探針長度有極限，難以合成太長的MLCR探針。(Multiplex ligation-dependent probe amplification，縮寫為MLPA)利用核酸雜交、連接反應和擴增反應，可以在同一試管內檢 測多達45個不同的核酸序列。該方法自荷蘭的Dr. Schouten JP於2002年發明以來，已廣 泛應用於染色體異常研究、基因點突變研究、基因缺失突變研究、基因甲基化研究、癌症研 究及mRNA表達研究等領域。其探針設計與LCR完全一樣，不同的是針對不同的感興趣基因 位點設計長度各不相同的探針對，探針對兩序列的一端具基因特異性，它們與各自目標基 因區域復性後僅留一缺口，於此同時探針對中與目的基因不雜交的一端都接有相同的通用 鹼基序列用於連接後擴增反應，這樣當探針對與目標區復性並在連接酶的作用下相連而本 身成為模板DNA，並由一對公用引物擴增而得以信號放大。由於針對不同的感興趣基因位點設計的探針對長度各不相同，經分離擴增產物大小，不須測序便可知道是否有目標基因的 存在並能進行相對量分析。該技術具備經濟(不需昂貴設備)、特異性高(探針復性及連接 酶識別)及高通量(單管可測至少45個基因)的特點。此外，該法檢測所針對的基因目標 區可短至40 50bp，是所有轉基因檢測方法中最短的，特別適於DNA高度降解樣品的檢測。 然而，同MLCR —樣，此法檢測靈敏度低，因為MLPA連接反應只一次，連接後擴增反應的模板 數沒有增加，反而更低，因為MLPA連接反應效率不可能達100%。此外，MLPA以擴增片段長 度區分各檢測基因，如採用化學合成法合成探針長度有極限，限制了同時檢測檢驗的數目， 而採用生物法合成單鏈長片段探針，費時費力
發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是彌補上述現有技術檢測通量低的不足，提出一 種將檢測單位點的LCR轉變為檢測多位點的MLCR探針。本發明所要解決的另一個技術問題是彌補上述現有技術檢測靈敏度低的不足，提 出一種對上述探針轉變的連接產物進行再擴增的MLCR-PCR 二步反應模式。本發明所要解決的再一個技術問題是彌補上述現有MLPA技術採用生物法合成單 鏈長探針的不足，提出一種分析上述擴增產物的懸浮晶片檢測用捕獲探針。本發明的MLCR的探針，採用以下技術方案予以解決這種MLCR的探針，是一段與待檢目標位點核酸序列相同或互補的單鏈寡核苷酸 序列，其特點是所述一組MLCR的探針是針對每個待檢位點合成四個單鏈DNA探針，用於將檢測單 位點的LCR轉變為檢測多位點的MLCR ；其中兩個單鏈DNA探針與待檢位點一鏈序列一致，所有位於位點上遊的檢測位點 上遊探針5『的末端接通用序列GGGTTCCCTAAGGGTTGGA ；所有位於檢測位點相同鏈下遊的 檢測位點下遊探針3'的末端接通用序列TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC，且下遊探針5'末端 磷酸化；其它兩個單鏈DNA探針與互補鏈序列一致，各檢測位點互補鏈上遊探針5'和下 遊探針3'的末端不接通用序列，但下遊探針5'末端磷酸化；各位點相同鏈上遊探針和下遊探針相鄰，與待測位點雜交復性後僅留切刻；各位點不同鏈上遊探針和下遊探針互補，形成雙鏈平末端接頭結構。本發明的MLCR的探針，採用以下進一步的技術方案予以解決所述MLCR上遊探針5'所連通用序列與通用引物Primer-F相匹配，用於各位點 MLCR反應產物的均衡擴增，以顯著提高檢測靈敏度。所述MLCR下遊探針3'所連通用序列與通用引物Primer-R相匹配，用於各位點 MLCR反應產物的均衡擴增，以顯著提高檢測靈敏度。所述MLCR上遊探針採用化學法快速合成，其長度為19 25bp，檢測目標區短至 38 50bp，這是所有檢測技術中最短的，適於DNA降解樣品的檢測。所述MLCR下遊探針採用化學法快速合成，其長度為19 25bp，檢測目標區短至 38 50bp，這是所有檢測技術中最短的，適於DNA降解樣品的檢測。本發明的MLCR-PCR 二步反應模式，採用以下技術方案予以解決
這種MLCR-PCR 二步反應模式的特點是 所有針對各檢測位點的MLCR探針先進行MLCR反應轉變為連接產物，連接產物末 端均連有相同的通用序列，分別與通用引物Primer-F和Primer-R相匹配，後進行均衡擴增 連接產物的PCR反應；所述MLCR探針是針對每個待檢位點合成四個單鏈DNA探針。本發明的MLCR-PCR 二步反應模式，採用以下進一步的技術方案予以解決優選的，所述MLCR反應是15個循環的連接鏈式反應，其反應模板為基因組DNA。優選的，所述PCR反應是以連接產物為模板，以Primer-F和Primer-R為引物的35 個循環的擴增反應。這種MLCR-PCR 二步反應模式第一步是MLCR反應以樣品基因組DNA為模板將MLCR 探針轉變為連接產物，第二步是以連接產物為模板再進行PCR擴增，使檢測信號進一步放 大。MLCR探針本身經15個左右循環的MLCR反應，MLCR探針轉變為第二步PCR反應的模 板，模板量相較基因組DNA大大提高，這種由一組MLCR探針轉變而來的擴增反應模板即連 接產物的末端因均連有通用序列，可實現檢測位點信號均衡地擴增，從而大大提高檢測的 靈敏度。所述MLCR反應的反應體系的反應總體積是10 μ 1，其中樣品基因組DNA :1 μ 1 (20ng/ μ 1)；混合MLPA 探針:2 μ 1 (每探針 IOfmol/μ 1)；10 倍緩衝液1μ1;Ampligase 0.2Unites ；ddH20 :5· 9 μ 1。所述MLCR反應的反應條件是2 個循環:94°C, 1. 5min ；55°C，6min ；15 個循環:91°C,0. 5min ；55°C，6min。所述PCR反應設計的PCR引物是Primer-F GGGTTCCCTAAGGGTTGGA ；Primer-R :Bio-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA (5 『生物素標記)。所述PCR反應的反應體系的反應總體積是50 μ 1，其中有MLCR 連接產物2μ 1 ；高保真Taq 酶0· 4 μ 1 (2Unites)；25mM dNTP :4 μ 1 (終濃度 2mM)；50mM MgCl2 :2 μ 1 (終濃度 2mM)；10 倍緩衝液5μ1;lOpmol/μ 1 弓丨物各 2μ 1 ；ddH20 32. 6 μ 1。所述PCR反應的反應條件是95°C,0. 5min ；35個循環；95°C,0. 5min ；60°C,0. 5min ；72°C, Imin ；
72°C，20min;10°C，保存。本發明的懸浮晶片檢測用捕獲探針，採用以下技術方案予以解決。這種懸浮晶片檢測用捕獲探針，是一單寡核苷酸DNA鏈。這種懸浮晶片檢測用捕獲探針的特點是所述單寡核苷酸DNA鏈的一端與懸浮晶片色球偶聯，通過雜交捕獲MLCR-PCR反應產物中與之互補的DNA序列；所述單寡核苷酸DNA鏈橫跨待檢位點中被耐熱連接酶識別的切刻，在晶片檢測溫 度不與各位點4個單獨的MLCR探針中的任何一個雜交，但能同MLCR探針轉變的連接產物 即連接後的2個MLCR探針和第二步PCR擴增產物雜交；所述MLCR-PCR反應是所有針對各檢測位點的MLCR探針先進行MLCR反應轉變為 連接產物，連接產物末端均連有相同的通用序列，分別與通用引物Primer-F和Primer-R相 匹配，後進行均衡擴增連接產物的PCR反應。本發明的懸浮晶片檢測用捕獲探針，採用以下進一步的技術方案予以解決。所述單寡核苷酸DNA鏈只能同MLCR探針部分同源，長度為10 14bp ；所述晶片檢測溫度一般為52°C，高於所述捕獲探針與連接前MLCR探針同源序列 雜交的退火溫度10°C以上。本發明與現有技術對比的有益效果是本發明結合了 MLPA、LCR兩者的優點，將MLPA通用引物引進到LCR技術，使檢測單 位點的LCR轉變為檢測多位點的MLCR ；同時第一步MLCR反應連接產物作為第二步PCR擴 增反應的模板使各檢測位點的信號進一步放大，具有高通量、超靈敏、高特異的特點。克服 了常規LCR、MLPA檢測靈敏度低的缺點以及多重PCR多引物難以均衡信號擴增的缺點。懸 浮晶片捕獲探針橫跨被耐熱連接酶識別的切刻，在晶片檢測溫度檢測時不同位點4個單獨 的MLCR探針雜交，而只能同連接後的2個MLCR探針和第二步PCR擴增產物雜交，提高了基 因檢測的特異性。懸浮晶片檢測也避免了常規MLPA因藉助擴增片段大小區分不同基因而 必須生物法製備不同長單鏈核酸片段的麻煩。該發明中針對所有被檢基因位點的四個MLCR 探針均採用化學法合成，各片段長度隨意，長度可相同，也可不同，不需長單鏈核酸片段，因 此省時省力。適於各種樣品特別是痕量、降解DNA複合樣品的基因檢測和單核苷酸多態性 分析技術體系，可以應用於如食品轉基因和疾病基因的診斷等領域。本發明超靈敏、高特異和高通量，具有以下特點其一，運用最新技術原理對影響基因檢測的最主要環節被檢目標基因拷貝和單 管被檢目標基因數進行研究，以達到運用LCR技術原理以特異提高被檢目標基因拷貝數， 以及運用MLPA技術原理以增加單管被檢目標基因種類和信號再擴增的目的，因此，檢測靈 敏度和檢測通量高。其二，利用探針的設計將兩種技術優點有機結合在一起，MLCR探針含MLPA技術的 通用序列，MLCR形成的連接產物可作為第二步PCR反應的直接模板。其三，MLCR-PCR擴增產物不依賴片段長度區分不同基因，而採用懸浮晶片色球技 術分析鑑別MLCR-PCR產物，進而提高檢測的通量。Bio-Plex懸浮晶片系統使用多至100種 不同色標編碼的微球組合，每種微球偶聯一種捕獲探針，可與相應不同位點MLCR-PCR產物雜交以區分被檢位點，該雜交不受MLCR-PCR擴增產物片段長度的影響，各位點MLCR探針長 度可短至19 25bp，且長度可一致，也可不一致，因而所有MLCR探針均可採用化學法快速 合成，避免了 MLPA技術中因採用擴增片段長度差異區分不同檢測位點而必須生物法合成 長度差異的MLPA探針的麻煩，降低了成本。其四，該法檢測針對的目標區可短至38bp，特別適於核酸高度降解樣品的檢測，因 為該法檢測所針對的基因目標區可短至38 50bp，是所有轉基因檢測方法中最短的。
其五，該檢測方法精準、特異性高，它源於兩個關鍵點DNA耐熱連接酶的識別作 用只能識別探針對與目標區完全匹配留下的切刻，以及色球偶聯探針與MLCR-PCR擴增產 物的特異性雜交，其效果類似於實時螢光PCR技術中Taqman探針的應用。


圖1是本發明具體實施方式
一的凝膠電泳分離結果示意圖；圖中M:50bp ladder ;1 轉基因RRS大豆/大米；2 轉基因RRS大豆/大米；3 轉基因RRS大豆；4 非轉基因RRS大豆；5 空白對照。圖2是本發明具體實施方式
二的普通瓊脂糖凝膠電泳分離結果示意圖；圖中M :50bp ladder ；1 空白對照；2 :nonBt63 米 /5% RRS 大豆 /5% Bt-167 玉 米；3 0. 01% Bt63 米/5% RRS 大豆/5% Bt-167 玉米；4 0. 5% Bt63 米/5% RRS 大豆 /5% Bt-167 玉米；5 5% Bt63 米 /5% RRS 大豆 /5% Bt-167 玉米。圖3是本發明具體實施方式
二的樣品實時螢光PCR檢測結果示意圖。圖中E1 基因 Lec ；E2 基因 Gos ；E3 基因 Nos ；E4 基因 RRS ；E5 基因 CaMV35S ； E6 基因 Bt63 ；E7 基因 PAT。
具體實施例方式下面將結合具體實施方式
並對照附圖對本發明作進一步說明。
具體實施方式
一三重基因檢測為直觀檢驗MLCR-PCR檢測技術的可靠性，先採用凝膠電泳分離方法直觀分析 MLCR-PCR反應產物。為此，化學法合成如下三位點探針，先進行三重基因檢測。1.合成的寡核苷酸序列MLCR探針序列 PCR反應引物Primer-F GGGTTCCCTAAGGGTTGGA ；Primer-R :GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA。2. MLCR 反應MLCR反應體系樣品基因組模板DNA 1 μ 1 (20ng/ μ 1)混合探針2 μ 1 (每探針IOfmol/ μ 1)
10倍緩衝液1μ1Ampligase 0.2UnitesddH20 5. 9μ 1_反應總體積10 μ 1MLCR反應條件2 個循環:94°C, 1. 5min ；55°C，6min ；15 個循環:91°C,0. 5min ；55°C，6min ；3. PCR 反應PCR反應體系MLCR反應連接產物2 μ 1高保真Taq 酶0·4μ l(2Unites)25mM dNTP :4 μ 1 (終濃度 2mM)50mM MgCl2 :2 μ 1 ((終濃度 2mM)10倍緩衝液5μ1lOpmol/μ 1 弓I物2+2ddH20 32. 6μ 1_反應總體積50 μ 1PCR反應條件95°C,0. 5min ；35個循環；95°C，0. 5min ；60°C，30sec ；72°C, Imin ；72°C，20min;10°C，保存。4.凝膠電泳分離結果PCR擴增反應產物檢測(凝膠電泳)結果如圖1所示，所有擴增產物均如預期。空白對照樣品既無探針帶，也無擴增產物帶(泳道5)；非轉基因RRS大豆樣品有探針帶，和大 豆內源基因Lectin擴增片段(IlObp)(泳道4)；轉基因RRS大豆樣品有探針帶、大豆內源 基因Lectin擴增片段(IlObp)和抗草甘膦基因CP4-EPSPS擴增片段(IlSbp)(泳道3) 』轉 基因RRS大豆/大米樣品有探針帶、大豆內源基因Lectin擴增片段(IlObp)、抗草甘膦基因 CP4-EPSPS擴增片段(IlSbp)和水稻內源基因gos9擴增片段(133bp)(泳道1和2)。實驗結果直觀證明該技術路線有效。
具體實施方式
二 七重基因檢測1.合成的寡核苷酸序列LCR探針序列 2. MLCR 反應MLCR反應體系樣品基因組模板DNA :1 μ 1 (20ng/ μ 1)混合探針2 μ 1 (每探針IOfmol/ μ 1)10倍緩衝液1μ1Ampligase 0. 2UnitesddH20 5. 9μ 1_反應總體積10 μ 1MLCR反應條件2 個循環:94°C, 1. 5min ；55°C，6min ；15 個循環:91°C,0. 5min ；55°C，6min。PCR 反應PCR反應體系MLCR反應連接產物2 μ 1高保真Taq 酶0·4μ l(2Unites)25mM dNTP :4 μ 1 (終濃度 2mM)50mM MgCl2 :2 μ 1 ((終濃度 2mM)10倍緩衝液5μ110pmol/ul 引物2+2ddH20 32. 6μ 1_反應總體積50 μ 1PCR反應條件95°C，0.5min;
35個循環；95°C，0. 5min ；60°C，0. 5min ；72°C, Imin ；72°C，20min;10°C，保存。PCR反應產物檢測(普通瓊脂糖凝膠電泳)結果如圖2所示，圖2中泳道1為空白對照，顯示沒有擴增產物；其它4個泳道MLCR-PCR擴增反應均有擴增產物，表明MLCR-PCR 反應獲得成功，但普通瓊脂糖凝膠電泳難以區分。3.懸浮晶片檢測1)微球捕獲探針偶聯，依次有以下子步驟1 · 1)蝸旋儀上以最高轉速懸浮微球；1 · 2)在超聲清洗儀上超聲微球30秒；1 · 3)取100 μ 1微球至Ij 1. 5ml離心管中，最高轉速離心1 2min ；1 · 4)棄上清，用45 μ 1 0. 1Μ，ρΗ4. 5的MES重懸微球，徹底蝸旋，使微球分散；1 · 5)力口入 2μ 1 探針；1 · 6)製備新鮮的濃度為10mg/ml的EDC溶液，加入2. 5 μ IEDC至微球中，徹底混 勻；1 · 7)室溫黑暗推薦下孵育30min ；1 · 8)重複 1.6);1 · 9)重複 1 · 7)；1 · 10)加入 Iml 0. 02% Tween-20，稍微蝸旋混勻；1 · 11)最高轉速離心1 2min ；1 · 12)棄上清，用0. 1 % SDS重懸沉澱40秒；1 · 13)重複 1 · 11)；1 · 14)去上清，用IOOul pH8. OTE緩衝液重懸沉澱；1 · 15)蝸旋儀上最高速蝸旋30秒，4°C黑暗條件下儲存。2)微球偶聯效率驗證，依次有以下子步驟2 · 1)在蝸旋儀上混合工作微球30秒，製備微球混合物，使每種微球不低於5000 個/33μ 1 ；2 · 2)在標準PCR管中，加入33 μ 1微球的混合物；2 · 3)在每個管中分別加入不同比例混合驗證探針和TE至總體積50 μ 1，反覆吸 打每個管，充分混勻；2·4)蓋上蓋子防止蒸發，在PCR儀上95 100°C下加熱5min，再在比所計算的退 火溫度低5 10°C ( 一般為52°C )下雜交15min ；2 ·5)取25 μ 1，10 μ g/ml新鮮製備的SA-PE液加到上述50 μ 1反應液中，混勻，在 52 °C下繼續孵育5min ；2 · 6)將上述75 μ 1反應液全部加入螢光測定板，按Bio-Plex懸浮晶片系統使用 說明測定螢光值。驗證結果如下(數值為螢光值) 如表結果顯示，該混合微球偶聯效率高，靈敏度高，低至0.5fmol的驗證探針均能 檢測到，且螢光值與驗證探針的濃度正相關。3)樣品檢測樣品檢測方法同微球偶聯效率驗證方法，只是將混和驗證探針和TE改為17 iU的 MLCR-PCR反應產物。4)樣品檢測結果(數值為螢光值) 上述樣品均為標準樣品等量混合而成，如表所示，除基因N0S外，其餘6個基因檢 測均呈陽性。大豆和大米內源基因Lectin和Gos螢光信號強，而外源基因螢光信號相對較 弱，這是因為轉基因樣品比例只佔5 %或更低的緣故。N0S基因和0. 01 %轉基因大米Bt63 基因螢光信號低於對照，表明未檢出該兩基因，這可能超出了 Bio-Plex晶片檢測靈敏度， 這一點可用實時螢光PCR檢測結果證實。實時螢光PCR是常見高靈敏的基因檢測方法。樣品(0. 5% Bt63米RRS大豆 /5%Bt-167玉米)實時螢光PCR檢測結果如圖3所示，7個基因均呈陽性。基因Lectin和 Gos CT值小(E1和E2)，分別為27. 519和28. 258，表明它們含量高，這與晶片檢測螢光信號 強的結果一致。基因Pat和RRS CT值為28. 258和29. 842 (E7和E4)，懸浮晶片同樣也能檢 出。基因 N0S、CaMV35S 和 Bt63CT 值很大(E3、E5 和 E6)，分別為 37. 702,34. 418 和，35. 333， 說明它們的濃度很低；CaMV35S和Bt63基因Bio-Plex懸浮晶片檢測也有信號，說明懸浮芯 片檢測靈敏度已很高；Nos基因實時螢光PCR檢測CT值顯示其濃度比CaMV35S和Bt63濃 度更低，N0S基因晶片檢測無螢光信號，說明已超Bio-Plex檢出極限。另外，Bio-Plex晶片 不能檢出0. 01%的轉基因大米，但能檢出0. 17% (0. 5% /3)轉基因大米，這遠遠超出了歐 洲聯盟0.9%的要求，表明該發明檢測方法靈敏度遠遠高於實際要求，實際應用潛力巨大。以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應當 視為屬於本發明的保護範圍。1010004ST-MLCR探針、二步反應模式和懸浮晶片檢測用捕獲探針-序列表.SEQ序列表深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心MLCR探針、二步反應模式和懸浮晶片檢測用捕獲探針<130)1010004 ST4PatentIn version 3. 3119DNA人工序列 1
gggttcccta agggttgga19
2
23
DNA
人工序列
2
tctagattgg atcttgctgg cgc23
3
19
DNA
人工序列
3
gggttcccta agggttgga19
4
23
DNA
人工序列
4
gcgccagcaa gatccaatct aga23
CN 10
25
26
[0207 [0208 [0209 [0210 [0211 [0212 [0213 [0214 [0215 [0216 [0217 [0218 [0219 [0220 [0221 [0222 [0223 [0224 [0225 [0226 [0
丨22權利要求
一種MLCR的探針，是一段與待檢目標位點核酸序列相同或互補的單鏈寡核苷酸序列，其特徵在於所述一組MLCR的探針是針對每個待檢位點合成四個單鏈DNA探針，用於將檢測單位點的LCR轉變為檢測多位點的MLCR；其中兩個單鏈DNA探針與待檢位點一鏈序列一致，所有位於位點上遊的檢測位點上遊探針5′的末端接通用序列GGGTTCCCTAAGGGTTGGA；所有位於檢測位點相同鏈下遊的檢測位點下遊探針3′的末端接通用序列TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC，且下遊探針5′末端磷酸化；其它兩個單鏈DNA探針與互補鏈序列一致，各檢測位點互補鏈上遊探針5′和下遊探針3′的末端不接通用序列，但下遊探針5′末端磷酸化；各位點相同鏈上遊探針和下遊探針相鄰，與待測位點雜交復性後僅留切刻；各位點不同鏈上遊探針和下遊探針互補，形成雙鏈平末端接頭結構。
2.如權利要求1所述的MLCR的探針，其特徵在於所述MLCR上遊探針5'所連通用序列與通用引物Primer-F相匹配，用於各位點MLCR 反應產物的均衡擴增；所述MLCR下遊探針3'所連通用序列與通用引物Primer-R相匹配，用於各位點MLCR 反應產物的均衡擴增。
3.如權利要求1或2所述的MLCR的探針，其特徵在於所述MLCR上遊探針採用化學法快速合成，其長度為19 25bp，檢測目標區短至38 50bp ；所述MLCR下遊探針採用化學法快速合成，其長度為19 25bp，檢測目標區短至38 50bp。
4.一種MLCR-PCR 二步反應模式，其特徵在於所有針對各檢測位點的MLCR探針先進行MLCR反應轉變為連接產物，連接產物末端均 連有相同的通用序列，分別與通用引物Primer-F和Primer-R相匹配，後進行均衡擴增連接 產物的PCR反應；所述MLCR探針是針對每個待檢位點合成的四個單鏈DNA探針。
5.如權利要求4所述的MLCR-PCR二步反應模式，其特徵在於所述MLCR反應是15個循環的連接鏈式反應，其反應模板為基因組DNA ； 所述PCR反應是以連接產物為模板，以Primer-F和Primer-R為引物的35個循環的擴 增反應。
6.如權利要求4或5所述的MLCR-PCR二步反應模式，其特徵在 所述MLCR反應的反應體系的反應總體積是10μ 1，其中樣品基因組 DNA :1 μ 1 (20ng/y 1)；混合MLPA探針2 μ 1 (每探針IOfmol/ μ 1)；10倍緩衝液= μ 1 ；Ampligase 0. 2Unites；ddH20 5. 9μ 1 ；所述MLCR反應的反應條件是·2 個循環-MV，1. 5min ；55°C，6min ； 15 個循環:91°C,0. 5min ；55°C，6min。
7.如權利要求4或5所述的MLCR-PCR二步反應模式，其特徵在於 所述PCR反應設計的PCR引物是Primer-F :GGGTTCCCTAAGGGTTGGA ；Primer-R :GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA (5 『生物素標記)。所述PCR反應的反應體系的反應總體積是50μ 1，其中有MLCR反應連接產物2μ 1 ；高保真 Taq 酶0· 4 μ 1 (2Unites)；·25mM dNTP :4 μ 1 (終濃度 2mM)；·50mM MgCl2 :2 μ 1 (終濃度 2mM)；·10倍緩衝液:5μ 1 ；·IOpmol/μ 1 引物各 2μ 1ddH20 32. 6μ 1 ；所述PCR反應的反應條件是·95°C,0. 5min ；·35個循環；·950C，0. 5min ；60°C，0. 5min ；72°C, Imin ；·72°C，20min，·10°C，保存。
8.—種懸浮晶片檢測用捕獲探針，是一單寡核苷酸DNA鏈，其特徵在於所述單寡核苷酸DNA鏈的一端與懸浮晶片色球偶聯，通過DNA雜交捕獲MLCR-PCR反應 產物中與之互補的DNA序列；所述單寡核苷酸DNA鏈橫跨待檢位點中被耐熱連接酶識別的切刻，在晶片檢測溫度不 與各位點4個單獨的MLCR探針中的任何一個雜交，但能同MLCR探針轉變的連接產物即連 接後的2個MLCR探針和第二步PCR擴增產物雜交；所述MLCR-PCR反應是所有針對各檢測位點的MLCR探針先進行MLCR反應轉變為連接 產物，連接產物末端均連有相同的通用序列，分別與通用引物Primer-F和Primer-R相匹 配，後進行均衡擴增連接產物的PCR反應。
9.如權利要求8所述的懸浮晶片檢測用捕獲探針，其特徵在於所述單寡核苷酸DNA鏈只能同MLCR探針部分同源，長度為10 14bp。
10.如權利要求8或9所述的懸浮晶片檢測用捕獲探針，其特徵在於所述晶片檢測溫度一般為52°C，高於所述捕獲探針與連接前MLCR探針同源序列雜交 的退火溫度10°C以上。
全文摘要
一種MLCR探針、二步反應模式和懸浮晶片檢測用捕獲探針。MLCR探針是一組針對每個待檢位點各合成的四個單鏈DNA探針，末端連通用序列，用於將LCR轉變為MLCR；二步反應模式是MLCR探針先進行MLCR反應轉變為連接產物，連接產物末端的通用序列分別與通用引物相匹配，後進行均衡擴增連接產物的PCR反應；捕獲探針橫跨待檢位點中被耐熱連接酶識別的切刻，在晶片檢測溫度能同第二步PCR擴增產物雜交。本發明結合了LCR、MLPA的優點，克服了LCR、MLPA檢測靈敏度低、多重PCR難以均衡擴增的缺點，具有高通量、超靈敏、高特異的特點，適於各種樣品特別是痕量、降解DNA樣品的基因檢測和單核苷酸多態性分析。
文檔編號C12Q1/68GK101864482SQ20101012426
公開日2010年10月20日 申請日期2010年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者仲健忠, 凌杏園, 向才玉, 康林, 章桂明, 陳枝楠, 陳洪俊, 黃新 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心