一種環亞胺水解酶基因及其表達蛋白的應用的製作方法
2023-05-30 22:48:41
專利名稱：一種環亞胺水解酶基因及其表達蛋白的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體屬於來源於假單胞桿菌的一種環亞胺水解酶的編碼基因，以及重組酶的表達和應用。
背景技術：
環亞胺水解酶(cyclic imide hydrolase，EC.3.5.2.16)是環醯胺酶類(EC.3.5.2)(包括海因酶、二氫嘧啶酶，二氫乳清酸酶、尿囊素酶等)中的一種，由於其在生物體內的代謝功能不明確，研究較少，但廣泛存在各類生物體。過去一般將環亞胺水解酶和海因酶，二氫脲嘧啶酶混為一談。隨著研究的深入，現在已經明確環亞胺水解酶和上述酶有著較明顯的不同(1)作用底物不同海因酶等作用底物為海因等環醯胺類，少量的海因酶也可作用於複雜的環亞胺，而環亞胺水解酶儘管也可以海因和二氫尿嘧啶作為底物，但它水解簡單的環亞胺底物諸如琥珀醯亞胺、馬來醯亞胺以及含巰基的環亞胺，卻是前者不具有的(見附圖1)。(2)分子量不同環亞胺水解酶和海因酶等環醯胺酶均屬金屬依賴性酶，但環亞胺水解酶分子量在30kD左右，天然蛋白為三聚體，而後者分子量均在50kD～60kD，一般為二聚體或四聚體。(3)保守活性位點不同海因酶一級結構序列同源性比較，酶活性的保守殘基均是和金屬結合的四個組氨酸，一個天冬氨酸；但環亞胺水解酶在一級結構序列和上述任一類環醯胺水解酶無任何同源性。(4)保守結構域不同海因酶等在保守結構域均屬醯胺酶(Amidase)，但已知蛋白質序列的環亞胺水解酶保守結構域卻不屬該結構域。(5)空間結構不同海因酶等的空間結構類似Triosephosphate isomerase的TIM桶，而後者預測空間結構在資料庫比對未發現類似結構。
Ogawa J等在1997年研究Blasterbacter sp.A17-4中首先發現和分離純化了環亞胺水解酶並對該酶的理化性質進行了研究。Soong等對232種細菌，250種酵母和118種黴菌的調查揭示在細菌中水解環醯胺和水解環亞胺的兩種活性不一定在同一個菌體存在；在細菌中假單胞桿菌對水解環亞胺和環醯脲均有較高活性，但在節桿菌屬、農桿菌屬、短桿菌屬有較高的水解環亞胺活性，而環醯脲的活性很低；酵母和黴菌中環亞胺水解酶的活性都很低。在微生物中，環亞胺水解酶和半醯胺酶(half-amidase)共同參與簡單環亞胺的代謝，其中環亞胺水解酶為第一個催化環亞胺水解形成半醯胺，後者再在半醯胺酶的作用下形成二羧酸，參與類似TCA的循環反應。由於大多的農藥和藥物中間體均是亞胺類化合物，環亞胺水解酶可能在藥物中間體的製備，異生物質的體內降解中發揮作用。
國內外有關海因酶的研究報導較多，但環亞胺水解酶研究很少，除Ogawa J等報導外，第二例來自王宇等2002年從真氧產鹼桿菌112R4中克隆到一種環亞胺水解酶基因(王宇等，微生物學報，2002，42.153～162)。但該酶在胺基酸序列同源性，作用底物範圍，催化效率上均與本發明的環亞胺水解酶有明顯差異，後續重組酶的研究未見報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種環亞胺水解酶及其編碼基因，獲得作用底物廣泛、活力較高的重組酶，並且這種重組環亞胺水解酶可在製備單一構型N-氨甲醯-胺基酸或醯胺酸中應用。
本發明提供的環亞胺水解酶，來源於假單胞桿菌，是序列表中SEQ ID NO1的胺基酸殘基序列或將SEQ ID NO1的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的替代或添加且具有與SEQ ID NO1相同活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白質。
序列表中SEQ ID NO1的胺基酸殘基序列是由293個胺基酸殘基組成的蛋白質。
本發明所提供的環亞胺水解酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列，由879個鹼基組成；(2)編碼序列表中SEQ ID NO1蛋白質序列的多核苷酸序列。
含本發明基因的表達載體及細胞體系均屬於本發明的保護範圍。
本發明重組環亞胺水解酶蛋白可以通過以下方法獲得培養含有環亞胺水解酶表達載體的宿主菌pEI/E.coli BL21，在所規定的蛋白質表達條件下，獲得表達產物環亞胺水解酶，然後從宿主細胞中提取並純化該酶。
本發明的環亞胺水解酶及其編碼基因可在製備單一構型N-氨甲醯-胺基酸以及製備醯胺酸中應用。
所述的單一構型N-氨甲醯-胺基酸，可以是海因酸；所述的醯胺酸可以是琥珀醯胺酸或馬來醯胺酸。
本發明從一株假單胞桿菌中成功地克隆到一新的環亞胺水解酶基因並進行了表達，重組酶的製備和底物轉化等研究，本發明涉及的環亞胺水解酶胺基酸序列和海因酶等環醯胺酶的同源性低於10％。從文獻報導和網上資源搜索，環亞胺水解酶的蛋白和基因研究共報導2例，完整序列只有來自真氧產鹼桿菌一例，本發明的醯亞胺水解酶和真氧產鹼桿菌112R4來源的序列比對同源性為78％(見附圖2)，作用底物較前者更廣泛，而且活力較高。
圖1二氫嘧啶(A)、海因類化合物(B)和環亞胺(C)三類底物的酶法水解反應。其中1.二氫脲嘧啶酶；2.β-脲基丙酸酶；3.海因酶；4.N-氨甲醯胺基酸水解酶；5.環亞胺酶；6.半醯胺酶。
圖2環亞胺水解酶與資料庫中已知序列環亞胺水解酶(AF373287)的比對。
圖3環亞胺水解酶純化結果圖。其中泳道1為含空質粒的E.coliBL21全菌體蛋白；泳道2為含重組子pEI/E.coliBL21全菌體蛋白；泳道3超聲後的上清；泳道4經鎳親和柱洗脫的目的蛋白；泳道5經Sephacryl S-200柱洗脫的目的蛋白。
圖4所得產物在不同反應條件下HPLC分析。反應條件12μg酶，底物琥珀醯亞胺濃度為20mmol/L，反應體系為200uL，37℃反應。
具體實施例方式
實施例1環亞胺水解酶的克隆及一級結構特徵本發明人從假單胞桿菌YZ-26(石亞偉等，Chemical Research of Chinese University，2005)中用CTAB法提取基因組DNA，然後用EcoRI酶切基因組DNA，用膠回收試劑盒從0.8％的agarose膠上分部回收2-9kb的EcoRI酶切片段，將回收的酶切片段連接在經相同酶切處理的pUC18載體上(大連寶生物公司)，轉入E.coilJM109中，在塗有X-gal和IPTG的平板上進行藍白初篩。
將含有插入片段的重組白色單菌落，分別挑入每孔含50μl YCG培養基(0.5％酵母粉，0.5％蛋白腖，0.5％甘油，0.2％磷酸氫二鉀和0.1％海因pH7.0)，37℃過夜培養後，加入50μl的50mmol/L二氫脲嘧啶作為底物，37℃振蕩30min，分別加入50μl 5％的對二甲氨基苯甲醛，進行顯色反應。
通過微孔板復篩較高活性的重組子，並抽提質粒，然後進行DNA序列測定，結果顯示陽性重組子pUS804中含有插入片段為2787bp，在其中只有位於1301～2118bp間有一個完整的讀框，為879bp(SEQ ID NO2).G+C含量為60.66％，編碼293aa，其計算分子量為33.711kD.將該DNA序列在BlastX程序進行對比和保守結構域搜索，和已知水解海因的酶諸如海因酶，尿囊素酶，二氫嘧啶酶等(含有環醯胺酶結構域)是完全不同的，目前只和真氧產鹼桿菌(Alcaligenes eutrophus 112R4)醯亞氨酶有78％的同源性(王宇等，微生物學報，2002，42.153～162)，與芽生桿菌(Blastobacter sp.)A17-P-4醯亞氨酶(只報導N末端的20胺基酸)氨基端20個胺基酸有80％的同源性(Ogawa J et al Eur JBiochem 1997，243(1-2)322～327)，因此，本發明的環亞胺水解酶基因序列不同於現有文獻報導的類似酶的序列，它是一個新基因。
實施2.環亞胺水解酶基因重組子構建根據測序結果，按該蛋白質編碼基因的兩末端序列設計正向引物，CGGAA TTCATGGCCAAGGAAATC和反向引物CCG AAG CCT TCA CTT CTT GCG CGG，以pUS804重組子為DNA模板，按如下PCR程序進行擴增.94℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸1min，擴增反應進行25個循環。PCR擴增產物經EcoRI/HindIII雙酶切連接到經相同酶切後的載體pET32a(Novagen公司)構建含硫氧還蛋白表達載體pETI。然後利用載體上的硫氧還蛋白編碼區兩側的NdeI酶的位點，將硫氧還蛋白讀框從融合蛋白中切除，構建成pEI重組子。每一步獲得的重組子經PCR檢測，質粒抽提和酶切分析，最終再經DNA序列分析確定。
實施例3重組環亞胺水解酶的表達與製備將實施例2中獲得重組子pEI(環亞胺水解酶的基因的N末端融合了一段六個組氨酸的親合臂利於蛋白質的純化)，轉化經Cacl2法致敏的Ecoli.BL21(DE3)的感受態細胞獲得pEI/Ecoli.BL21(DE3)工程菌。
從LB平板上挑取單菌落接於5ml(含100μg/ml Amp)液體培養基中，37℃培養10～12hr，取上述預培養菌以1％接種量轉接於新鮮的Amp(100μg/ml)的LB培養基，37℃培養至OD達到0.600左右，加終濃度0.3mmol/L IPTG，37℃再誘導培養4hr後，4℃，5000rpm離心，收集菌體。菌體用50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0緩衝液懸浮，在冰浴中用超聲波破碎細胞，然後15000rpm，4℃離心30min去除細胞碎片等不溶物質。將離心上清上樣於Ni2+-NTA親和柱，經含50mmol/L咪唑的相同緩衝液洗去大部分雜蛋白，最後用20ml含100mmol/L EDTA洗脫目的蛋白。將洗脫的目的蛋白用Amico超濾器PM30膜濃縮至5ml。上樣於Sephacryl S-200凝膠層析柱(LKB層析系統)。經洗脫的活性峰合併，獲得SDS-PAGE電泳純的環亞胺水解酶(見附圖3)，比活力為35.8U/mg(海因作底物)。
實施例4重組環亞胺水解酶的應用1.N-氨甲醯胺基酸的製備N-氨甲醯胺基酸是單一構型胺基酸，特別在D-型或L型胺基酸生產中的關鍵中間產物，它的生產一般通過化學法或酶法，目前多採用酶法生產，常用的酶主要是海因酶，本發明提到的環亞胺酶也可水解海因等底物，活力可達35.8U/mg(海因作底物)。整個反應通過水解海因等底物的醯胺鍵，開環生成N-氨甲醯胺基酸。
酶反應體系組成底物2％海因或二氫尿嘧啶反應溫度37℃緩衝液50mmol/L Tris.HCl pH8.0緩衝液酶液或菌體適量反應液總體積為1.5ml，經30min保溫後，加入0.25ml的三氯乙酸終止反應，0.25ml，10％對二甲氨基苯甲醛(DMBA)溶液顯色，然後加入1.0ml H2O補足3.0ml體積，在430nm下進行比色。用已知濃度的N-氨甲醯丙氨酸為標準產物，在相同體系情況下，繪製標準曲線，求出K值，根據公式，計算酶活性。
酶的轉化率1％海因(20μmole)，酶量為300ug，37℃反應1hr，在上述條件下，底物轉化率約85％。
2.醯胺酸的製備醯亞胺是生物體代謝中重要的中間物，特別是嘧啶類的代謝，環亞胺水解酶可以催化水解環亞胺生成醯胺酸(單亞胺二羧酸)，在有機酸和藥物中間體的生產中有很好的前景。
酶反應體系組成底物20mmol/L琥珀醯亞胺或馬來醯亞胺反應溫度37℃緩衝液50mmol/L Tris.HCl pH8.0緩衝液酶液適量將反應混合液在沸水中加熱5min，13000rpm離心5min後，上清液進行HPLC測定，層析柱SymmetryC18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相為磷酸緩衝液(20mmol/L pH6.5)甲醇(95∶5)，馬來醯胺酸在255nm下檢測；琥珀醯胺酸在210nm下檢測。
酶的轉化率在上述酶反應的條件下，酶量為12μg(5U/mg)，底物琥珀醯亞胺濃度為20mmol/L，反應體系為200uL，37℃反應30min後，轉化率98％(見附圖4)。底物為馬來醯亞胺時，在上述條件下，轉化率95％。
序列表110山西大學120一種環亞胺水解酶基因及其表達蛋白的應用140申請號為1412005-4-1816022101211293212PRT213惡臭假單胞桿菌YZ-26(Pseudomonas putida YZ-26)220
222(1)..(293)4001Met Ala Lys Glu Ile Leu Cys Ser Phe Gly Ile Asp Val Asp Ala1 5 10 15Val Ala Gly Trp Leu Gly Ser Tyr Gly Gly Glu Asp Ser Pro Asp20 25 30Asp Ile Ser Arg Gly Leu Phe Ala Gly Glu Val Gly Ser Pro Arg35 40 45Leu Leu Lys Leu Phe Glu Arg Phe Gly Ile Lys Thr Thr Trp Phe50 55 60Ile Pro Gly His Ser Ile Glu Thr Phe Pro Glu Gln Met Gln Ala65 70 75Val Ala Asp Ala Gly His Glu Ile Gly Ile His Gly Tyr Thr His80 85 90Glu Asn Pro Ile Ala Met Thr Arg Glu Gln Glu Thr Ala Val Leu95 100 105Asp Lys Cys Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Ser Gly Lys Arg Pro110 115 120Thr Gly Tyr Val Ala Pro Trp Trp Glu Phe Ser Asn Val Thr Asn125 130 135Glu Leu Leu Leu Glu Arg Gly Ile Lys Tyr Asp His Ser Leu Met140 145 150His Asn Asp Phe Thr Pro Tyr Tyr Val Arg Val Gly Asp Lys Trp155 160 165
Thr Lys Ile Asp Tyr Ser Lys Lys Pro Ser Asp Trp Met Val Pro170 175 180Leu Thr Arg Gly Lys Glu Thr Asp Leu Ile Glu Ile Pro Ala Ser185 190 195Trp Tyr Leu Asp Asp Leu Pro Pro Met Met phe Ile Lys Lys Ser200 205 210Pro Asn Ser His Gly Phe Val Asn Pro His Asp Ile Glu Gln Ile215 220 225Trp Arg Asp Gln Phe Asp Trp Val Tyr Arg Glu Met Asp Tyr Ala230 235 240Val Phe Pro Ile Thr Ile His Pro Asp Val Ala Gly Arg Pro Gln245 250 255Val Leu Met Met Leu Glu Arg Leu Tyr Ala His Met Ile Lys His260 265 270Pro Gly Val Lys Phe Val Thr Met Asn Glu Ile Ala Asp Asp Phe275 280 285Ala Lys Arg Phe Pro Arg Lys Lys2902102211882212DNA213惡臭假單胞桿菌YZ-26(Pseudomonas putida YZ-26)220
222(1)..(882)4002atggccaagg aaatcctctg cagcttcggc atcgacgtcg atgcggtcgc cggctggctc 60ggatcctatg ggggcgagga ttcgcctgac gatatctcgc gcggcctttt cgccggcgag 120gtcggcagcc cgcgcctcct gaagctgttc gaacgcttcg gaatcaagac cacctggttc 180attcccggcc actcgatcga gaccttcccg gaacagatgc aggcggttgc cgatgccggc 240cacgagatcg gcattcacgg ctacacccat gaaaacccga tcgccatgac gcgcgagcag 300gagaccgcgg tcctcgacaa gtgcatcgac ctcgtcacca agctctcggg caagcgcccg 360accggctatg tcgcgccgtg gtgggagttt tccaacgtca ccaacgagct gctgctggaa 420cgcggcatca agtacgacca ctccctgatg cacaacgact tcacgcccta ttatgtgcgc 480gtcggcgaca agtggaccaa gatcgactac tccaagaagc cgtccgactg gatggtgccg 540ctcacgcgcg gcaaggaaac cgatctcatc gaaatcccgg cctcctggta cctcgacgac 600ctgccgccga tgatgttcat caagaagtcg ccaaacagcc acggcttcgt caatccgcat 660gacatcgagc agatctggcg cgaccagttc gattgggtct accgcgagat ggactatgcg 720gtgtttccga ttaccatcca tcccgatgtt gccgggcgcc cgcaggtgct gatgatgctg 780gagcggctct atgcccacat gatcaagcat cccggcgtga agttcgtgac gatgaacgag 840atcgccgacg actttgccaa gcgcttcccg cgcaagaagt ga
權利要求
1.一種環亞胺水解酶，特徵在於，它具有序列表中SEQ ID NO 1胺基酸殘基序列。
2.一種環亞胺水解酶的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO 2；2)編碼序列表中的SEQ ID NO 1蛋白質序列的多核苷酸序列。
3.據權利要求2所述基因，其特徵在於，所述環亞胺水解酶的編碼基因是序列表的SEQID NO 2。
4.含有權利要求3所述基因的表達載體。
5.含有權利要求3所述基因的細胞體系。
6.權利要求5所述的細胞體系為原核細胞系統。
7.權利要求1所述的重組環亞胺水解酶在製備單一構型N-氨甲醯-胺基酸或醯胺酸中的應用。
8.權利要求7所述的單一構型N-氨甲醯-胺基酸是海因酸。
9.權利要求7所述的醯胺酸是馬來醯胺酸或琥珀醯胺酸。
全文摘要
本發明公開了一種環亞胺水解酶基因序列及其表達蛋白的製備與應用。本發明所提供的來源於假單胞桿菌的環亞胺水解酶是序列表中SEQ ID NO1的胺基酸殘基序列或將SEQ ID NO1的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的替代，缺失或添加具有與SEQ ID NO1相同活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白質。本發明將來源於假單胞桿菌環亞胺水解酶基因克隆並表達製備重組酶，可用於生物法生產N－氨甲醯－胺基酸以及醯胺酸等。
文檔編號C12P13/00GK1715404SQ20051001255
公開日2006年1月4日 申請日期2005年5月25日 優先權日2005年5月25日
發明者石亞偉, 袁靜明, 崔麗芳, 鈕利喜 申請人:山西大學