ω‑5‑醇溶蛋白特異的CD4+T細胞表位及其應用的製作方法

2023-05-30 20:29:27

本發明涉及ω-5-醇溶蛋白特異性cd4+t細胞表位及其小麥依賴運動誘發的嚴重過敏性反應(wdeia)特異性免疫治療。

背景技術：

食物依賴運動誘發嚴重過敏反應是致死性的嚴重過敏反應，在中國人群中，最常見的致敏食物為小麥。發病率呈逐年上升趨勢。由於其症狀嚴重，給患者的生活造成極大影響。ω-5醇溶蛋白是其發病的主要致敏蛋白。能被t細胞識別的肽段稱為t細胞表位，不同的t細胞表位激活特異性t細胞的能力不同。hla-drb1基因的高度多態性在一定程度上影響抗原提呈細胞提呈抗原肽種類以及激活特異性cd4+t細胞的能力，這可能是不同個體對同一蛋白組分產生不同免疫應答的原因。目前在花生、桃、芹菜、牛奶、榛子、牛肉等中，已相繼開展了cd4+t細胞免疫應答的研究，鑑定出了相關主要致敏蛋白的cd4+t細胞表位，並發現cd4+t細胞在疾病的發生發展過程中發揮著至關重要的作用。同時特異性cd4+t細胞表位的肽段已經用於特異性免疫治療，與傳統的皮下免疫治療相比，更安全，有效。

但迄今為止，仍沒有ω-5-醇溶蛋白特異的cd4+t細胞表位及其特異性細胞免疫應答的報導。

技術實現要素：

本發明的一個目的在於提供一種ω-5醇溶蛋白特異性cd4+t細胞表位的免疫原性肽，本發明的另一個目的在於提供所述免疫原性肽的用途。

本發明提供的一種ω-5-醇溶蛋白特異的cd4+t細胞表位的免疫原性肽，其肽序列為：lamamniasasrlls(seqidno.1)。

進一步，本發明所述的免疫原性肽可以與其他免疫原性肽組成能夠引起多特異性應答反應的多表位組合物，例如嵌合多肽。

進一步，本發明還提供編碼所述免疫原性肽或所述嵌合多肽的dna。這些dna能插入到合適的載體中，在寄主細胞或者生物體重表達所述的免疫原性肽或所述的嵌合多肽。

進一步，本發明還提供包含所述免疫原性肽或所述嵌合多肽或編碼所述肽的dna的組合物。這些組合物還可進一步包含其他免疫原性肽或者編碼所述其他免疫原性肽的dna。

進一步，本發明提一種供抗原提呈細胞，其提呈所述的免疫原性肽或所述的嵌合多肽或轉化了所述的dna。例如，抗原提呈細胞為樹突狀細胞。通過抗原提呈細胞的提呈，可以與免疫細胞建立起高效免疫應答。

進一步，本發明提供所述的免疫原性肽、所述的嵌合多肽、編碼所述肽的dna以及包含所述肽或編碼所述肽的dna的組合在製備藥物中的應用。尤其是，該藥物用於小麥依賴運動誘發的過敏性休克特異性免疫治療。或者該藥物用於小麥依賴運動誘發的過敏性休克病人診斷。

本發明ω-5-醇溶蛋白特異的cd4+t細胞表位肽，能誘導特異性cd4+t細胞增殖，為變應原特異性免疫治療提供了新的靶點。可以用於製備藥物，用於小麥依賴運動誘發的過敏性休克(wdeia)特異性免疫治療，為wdeia提供新的治療手段。

附圖說明

圖1為表位肽ω-510-24經hplc純化的結果。

圖2為合成多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30分別刺激wdeia患者pbmc分泌il-4/il-5elispot斑點圖。

圖3為合成多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30分別刺激wdeia患者pbmc後第五天cd4+t細胞亞群的擴增比例結果圖。

圖4為wdeia患者外周血pbmc分別經多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30刺激後cd4+t細胞的增殖動力學變化圖。

具體實施方式

以下通過實施例來進一步描述本發明，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，絕不限制本發明的範圍。

實施例1ω-5-醇溶蛋白特異的cd4+t細胞表位的免疫原性肽的獲得

利用生物信息學軟體netmhcⅱpan及netmhcii在線預測ω-5醇溶蛋白t細胞表位。將胺基酸序列導入在線預測軟體，輸入hla-drb1基因型，系統通過計算hla-drb1不同位點，具體是hla-drb1*1501，*0901，*1202，*0701，*0301，*0803與肽段親和力的高低預測潛在的t細胞表位。

預測出t細胞表位的胺基酸區域為1-35，67-86，148-167，334-351，365-384。具體詳見下表1。

表1.ω-5醇溶蛋白多肽基本信息

其中，已知ω-5醇溶蛋白[triticumaestivum，小麥]含有439個胺基酸，其胺基酸序列如seqidno.16所示。

合成如表1中的15條預測的t細胞表位胺基酸區域的多肽。所用試劑、儀器，具體步驟如下：

1.合成原料及相關試劑、儀器：

1.1合成原料：

樹脂：取代度為1.03mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin(天津市南開合成科技有限公司)；胺基酸：fmoc-gln(trt)-oh(成都誠諾，>99％)，fmoc-pro-oh(成都誠諾，>99％)，fmoc-phe-oh(成都誠諾，>99％)等。

1.2相關試劑：

合成試劑：dmf(原產地韓國)，dcm(原產地韓國)，meoh(原產地日本)，diea(新德化工，99％)，hbtu(昊帆生物科技，99％)；脫保護試劑：哌啶(國藥集團上海化學試劑公司，99％)；

檢測試劑：苯酚試劑(自配)，吡啶試劑(自配)，茚三酮試劑(自配)；裂解試劑：95％切割液：tfa(j.t.baker，99％)，tis(上海達瑞精細化工，98％)，edt(上海達瑞精細化工，98％)，無水乙醚(上海實驗，實測99.7％)；氮氣：(新聯氣體)

1.3儀器：

十二通道半自動多肽合成儀上海強耀生物科技有限公司自主設計並申請專利的半自動多肽合成儀，專利號為201020226529.2；shimadzu高效液相色譜儀(型號：製備型，分析型，軟體：class-vp.sevialsystem，廠商：shimadzu)；labconco凍幹機(型號：freezone.plus.6，廠商：labconco)；離心機(上海安亭科學儀器廠型號：tdl-40b)

2.多肽合成步驟如下：

合成順序：從序列c端到n端，步驟如下：

a.稱取n當量樹脂放入反應器，加入二氯甲烷(dcm)溶脹半小時，然後抽掉dcm，加入序列中第一個胺基酸2n當量，加2n當量的diea，適量的二甲基甲醯胺(dmf)，dcm(適量是指以可使樹脂充分鼓動起來為宜)，二異丙基乙胺(diea)、dmf、dcm，氮氣鼓泡反應60min。然後加入約5n當量甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用dmf、meoh洗淨；

b.往反應器中加入序列中第二個胺基酸(也為2n當量)，2n當量hbtu(1－羥基,苯並,三氯唑四甲基六氟磷酸鹽)及n,n-二異丙基乙胺(diea)，n2鼓泡反應半小時，洗掉液體，茚三酮檢測，然後用吡啶和乙酸酐封端。最後洗淨，加入適量的脫帽液去除fmoc(9-芴甲氧羰基)保護基，洗淨，茚三酮檢測；

c.依步驟b的方式依次加入序列中不同的胺基酸並進行各種修飾；

d.將樹脂用氮氣吹乾後從反應柱中取下，倒入燒瓶中，然後往燒瓶中加一定量(切割液和樹脂大約以10ml/g的比例)的切割液(組成是95％三氟乙酸(tfa)，2％乙二硫醇，2％三異丙基矽烷，1％水)，震蕩，濾掉樹脂；e.得到濾液，然後向濾液中加入大量乙醚，析出粗產物，然後離心，清洗即可得到序列的粗產物。

ω-5醇溶蛋白多肽合成和純化：根據預測的結果，選取與hla-drb1分子結合率高的肽段進行合成(肽段結合率＝結合某肽段的hla-drb1分子數量/hla-drb1分子總數)。合成的多肽在高壓液相色譜儀上進行純化，純化後的產品分別經反相色譜和質譜進行純化分析和質量鑑定。其中，表位肽ω-510-24經hplc純化，純度為96.37％，如圖1所示。

實施例2小麥ω-5醇溶蛋白t細胞表位多肽對外周血單個核細胞增殖活性的影響

一、外周血單個核細胞分離和凍存

1.主要材料及試劑：

人外周血淋巴細胞分離液(ficoll)、pbs(醫科院基礎所)

2.儀器設備：

水平離心機(thermofisher)

3.方法步驟

3.1抽取肝素抗凝靜脈血4ml，加入4mlpbs溶液混勻；

3.2取淋巴細胞分離液置於離心管中，將4ml稀釋血液距分離液面上約1cm，沿管壁輕輕疊加於3ml淋巴細胞分離液上，保持淋巴細胞分離液與血樣品之間的界限清晰；

3.3置於水平離心機中，20℃，400g/min，離心35min。

3.4離心後，從離心管的底部到液面分成4層，依次為紅細胞和粒細胞層、分離液層、單個核細胞層、血漿層(含血小板和破碎細胞)

3.5用吸管直接吸出單個核細胞層，置於另一離心管中。

3.6加入6mlpbs溶液，充分混勻，每次100g/min，離心10min。離心後棄去上清液，用pbs清洗2次。

3.7沉澱的細胞用lml含10％dmso的胎牛血清配成單細胞懸液。

3.8程序性降溫：用凍存液凍存後，先在4℃保存60分鐘，然後-20℃保存30min，-80℃過夜，最後移入液氮保存。

二、外周血單個核細胞復甦

1.主要材料及試劑

人外周血淋巴細胞分離液(ficoll)、臺盼藍(北京雷根生物技術有限公司)、血細胞計數板、載玻片、pbs(醫科院基礎所)、完全培養基(rpmi1640180ml；胎牛血清(fbs)20ml(2支)，fbs-20℃保存；穀氨醯胺，1支

(1ml)，-20℃保存；β-巰基乙醇，1000×200μl，1支，4℃保存；丙酮酸鈉，(4ml)，1支，-20℃保存；hepes，調節酸鹼，1.5ml)

2.儀器設備

水浴鍋、倒置顯微鏡(optec公司)

3.方法步驟

3.1提前準備好37℃水浴鍋，超淨臺裡準備好15ml離心管，加入9ml培養基後管蓋擰緊，水浴鍋內37℃預熱。

3.2將液氮中凍存管拿出，立即放入37℃水浴鍋中不停地搖晃，注意水浴鍋水面不要高於管蓋口以免水滲入。

3.3約2min後，拿起看凍存管中固體全部化為液體，立馬拿進超淨臺，加入到剛才預熱的9ml裡面，這樣相當於稀釋10倍，以免dmso損傷細胞。

3.4置於水平離心機中，1000rpm/min，5min。離心後，棄上清，用含10％胎牛血清的rpmi1640培養基重懸細胞。原則就是：操作一定要快，避免汙染，稀釋。

3.5細胞濃度的調節：取10μl單細胞懸液加入40μl0.4％臺盼藍中混勻，取10μl加入細胞計數板中進行活細胞計數，根據計數結果，用37℃調節細胞濃度至1×106個/ml，待用。

三、表位肽誘導cd4+t細胞系產生

本實驗中，採用cck-8法替代以往的mtt法進行淋巴細胞增殖試驗。cck-8試劑可用於簡便而準確的細胞增殖和毒性分析，其基本原理為：該試劑中含有wst-8[化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-methoxypms)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臢產物(formazandye)。生成的甲臢物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖檢測。此方法比起原有的mtt法具有操作簡便、重複性好、靈敏度高等優點。

所用材料及試劑、設備、具體方法如下：

1.主要材料及試劑

rpmi1640培養基(醫科院基礎所)、胎牛血清(醫科院基礎所)、穀氨醯胺(醫科院基礎所)、β-巰基乙醇(醫科院基礎所)、hepes(醫科院基礎所)、植物血凝素pha(挧聖生物)、cellcountingkit-8試劑盒(日本同仁化學)、96孔培養板(corning3599)、人工合成候選表位肽(上海強耀生物科技有限公司)2.儀器設備

co2培養箱、酶標儀(thermofisher)3.方法步驟

3.1將分離的外周血單個核細胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培養基調整細胞數為1×106/ml

3.2將上述細胞懸液加入96孔細胞培養板中，每孔100μl，每組設三個復孔。

將不同刺激劑按表位肽段(20μg/ml)、pha(陽性對照，20μg/ml)和培養基(陰性對照)的順序依次加入96孔板中，將96孔板周邊的孔設為空白孔，加入無細胞懸液的rpmi-1640完全培養基，以預防誤差。37℃，5％c02培養72h。

3.3檢測淋巴細胞增殖情況：

向各孔中加入20μl的cck-8溶液。37℃、5％co2孵育5小時。測定450nm處的od值。結果以三個復孔的平均值表示。通過od450值大小來反應表位多肽對人pbmc增殖活性的影響。增殖水平以刺激指數(stimulationindex，si)表示：si＝變應原刺激後od450值/陰性對照od450值。si≥2被認為陽性結果。

通過多肽篩選的方法對小麥依賴運動誘發嚴重過敏反應中ω-5醇溶蛋白的主要t細胞表位進行初步鑑定，發現可能參與嚴重過敏反應發生的主要t細胞表位。採用間接法進行cd4+t細胞表位的篩選。選擇外周血單個核細胞作為效應細胞，將合成的15條肽段(20μg/ml)作為刺激物，同時加入(聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，pha))pha為陽性對照和不加任何刺激物的陰性對照，依次加入96孔板中，37℃，5％co2培養。72h後檢測淋巴細胞增殖情況：向各孔中加入20μl的cck-8溶液。37℃、5％co2孵育5小時。測定450nm處的od值。結果以三個復孔的平均值表示。通過od450值大小來反應表位多肽對人外周血單個核細胞(pbmc)增殖活性的影響。增殖水平以刺激指數(stimulationindex，si)表示：si＝變應原刺激後od450值/陰性對照od450值。si≥2被認為陽性結果。觀察pbmc在候選表位肽胺基酸序激活下的增殖反應情況。通過比較wdeia患者和正常對照pbmc增殖後的活化指數(si)，分析不同肽段的變應原性。對ω-5醇溶蛋白的主要t細胞表位進行初步研究。wdeia患者pbmc對15條肽段表現出不同的增殖能力：其中，5條表位肽(ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30)對wdeia患者pbmc的活化程度最高，30例wdeia患者28例(93.33％)對這5條肽段增殖指數為陽性；其中ω-510-24對wdeia患者的活化率最高，為90％。餘下各肽段的增殖陽性率為10％-20％。而健康對照組外周血pbmc在各肽段刺激下的活化率為0-20％。

實施例3elispot法篩選可刺激分泌il-4和il-5的多肽

斑點酶聯免疫檢測(enzyme-linkedimmunospotassay，elispot)是利用elisa技術的基本原理從單細胞水平檢測分泌細胞因子的細胞的一種免疫學檢測技術，可從單細胞水平評價機體的細胞免疫功能。其技術原理為：用抗體捕獲培養中細胞所分泌的細胞因子，並以斑點酶聯顯色方式將其表現出來。

此技術操作在96孔培養板上進行，直接以培養板的塑料板底pvdf膜為基質，包被上特異性單克隆抗體，以捕獲細胞分泌的細胞因子。然後在培養板孔內加入細胞培養基、待檢測的細胞及抗原刺激物進行培養。在特異性抗原或非特異性有絲分裂原的刺激下，數小時之內，t細胞就開始分泌各種細胞因子。細胞因子當即就被位於細胞下方膜上的單克隆抗體所捕獲。洗去細胞後，被捕獲的細胞因子可以與生物素標記的第二抗體結合，然後用酶標親和素與生物素結合，進行化學酶聯顯色，可以在膜的局部形成圓形斑點。每個斑點代表一個分泌細胞因子的細胞，這些細胞被稱為斑點形成細胞(spotsformingcells，sfcs)，通過elispot斑點酶聯分析系統對斑點進行分析即可計算出陽性細胞的頻率。

所用的材料及試劑、儀器設備、具體步驟如下所示：

1.主要材料及試劑

il-4elispot試劑盒(bd)、il-5elispot試劑盒(bd)、96孔pvdf濾膜板(maipn45)(millipore公司)、含10％胎牛血清的rpmi1640培養基。2.儀器設備

elispot讀數儀(chamspottmii型酶聯免疫斑點圖像分析系統)

3.方法步驟

3.1復甦凍存的患者pbmc，用10％胎牛血清的rpmi1640培養基培養20-24h。

3.1包被將捕獲性抗體(15μg/ml鼠抗人il-4/il-5mab50μl)預先包被96孔pvdf濾膜板，4℃孵育過夜。

3.2洗板將板用pbs洗6遍

3.3封閉用含10％胎牛血清的rpmi1640培養基封閉，室溫下封閉1h。(胎牛血清可以封閉所包被抗體的胎牛血清受體以降低非特異性反應。有一種特殊的96孔板底面介質是pvdf膜，利用膜的多孔結構可以讓單個細胞坐到其中，然後分泌細胞因子或特定抗體，這樣使最後的檢測單個細胞靈敏度成為可能。同時，pvdf膜的不透光性也是elispot與elisa的不同之處。)

3.4調整細胞數外周血單核細胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培養基稀釋至2×106～4×106個/孔。

3.5刺激和培養將上述細胞懸液加入elispot板孔中，每孔100μl，每組設三個復孔。依次加入表位肽(20μg/ml)、pha(陽性對照)和培養基(陰性對照)的順序依次加入96孔板中，37℃，5％c02培養24－48h。

3.6洗滌用含體積比0.01％tween-20的pbs洗6次，以棄去細胞

3.7孵育加入50μl(1μg/ml)生物素化抗細胞因子的檢測抗體，孵育3h。洗6次後，加入50μlalp-鏈黴親和素，室溫孵育1－2h。

3.8顯色用pbs－tween－20再洗5次，加入100μlbcip/nbt顯色液於室溫下(25℃)避光顯色1h，觀察斑點形成。顯色完畢後，用去離子水洗板3次終止反應，將板放置於室溫避光陰涼處乾燥後用elispot讀板儀測定斑點數，計算il-4、il-5斑點形成細胞數。每孔斑點數≥5，即可判為陽性。t細胞頻率以分泌il-4(或il-5)的細胞數/106pbmc表示。為了進一步驗證淋巴細胞增殖實驗的結果，使用斑點酶聯免疫分析技術(elispot法)檢測經多肽刺激的外周血單個核細胞分泌il-4和il-5的情況。此步驟是對候選表位肽進行初篩。elispot板通過顯色反應，在細胞分泌il-4和il-5的相應位置顯現清晰可辨的斑點，通過elispot分析系統對斑點進行計數。elispot結果中的每一個斑點代表一個分泌il-4或il-5的t細胞，稱為斑點形成細胞(spotformingcell,sfc)，最後結果以sfc/106pbmc表示，反映機體細胞免疫的水平。

應用經淋巴細胞增殖法初步篩選到的多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30刺激外周血單個核細胞，檢測小麥ω-5醇溶蛋白t細胞表位多肽誘導相關hla-drb等位基因陽性個體cd4+t細胞分泌il-4，il-5等細胞因子的情況。結果如圖2所示，其中，圖2中為分別採用ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30誘導分泌的il-4，il-5結果圖，結果說明表位肽ω-510-24誘導產生的分泌il-4和il-5的細胞數量都顯著高於其他各表位肽(p＜0.05)，達到了389±62個/106pbmc和393±75個/106pbmc，進而鑑定出ω-5醇溶蛋白特異的t細胞表位為ω-510-24。

實施例4cfse標記技術檢測表位肽誘導的特異性cd4+t細胞增殖

流式細胞法篩選可刺激t細胞反應的多肽，比較各候選表位肽特異性cd4+t細胞增殖率

為了進一步驗證elispot篩選法的結果，選取另外10例wdeia患者，使用流式細胞法檢測表位肽對cd4+t細胞刺激增殖的情況。由於cd3是t細胞的特有標記，因此以cd3設門，採用流式細胞術檢測cd3+cd4+t細胞佔pbmc百分比。ω-5醇溶蛋白主要t細胞表位刺激wdeia患者外周血pbmc後，會顯著誘導t細胞活化增殖、分化，cd3+cd4+t細胞百分比將顯著升高。

所用的試劑盒儀器、具體實驗步驟如下：

1.主要試劑和儀器

螢光抗體抗cd4；螢光抗體抗cd3；bdfacscantotmii流式細胞儀

2.方法步驟

2.1調整細胞數用rpmi-1640完全培養基調整細胞數為1×107個/ml的細胞懸液。洗滌離心及後續操作過程中注意避光。

2.2t細胞的激活、擴增；

2.2.1加入96(24)孔細胞培養板，100μl/孔(1ml)，同時加入稀釋好的多肽，終濃度為20μg/mi。

2.2.237℃，5％c02培養細胞培養

2.3流式細胞術檢測和分析t淋巴細胞亞群的增殖

2.3.1收集細胞收集表位肽刺激培養第5天的細胞(每管加入100μl細胞懸液)

2.3.2用抗cd4-pe、抗cd3-biotin作細胞表面分子染色加入fitcantimousecd3、peanti-mousecd4螢光抗體各2μl，冰上避光孵育20min

2.3.3洗滌離心洗滌細胞2次，去除殘留的螢光抗體；

2.3.4上機檢測以0.5ml細胞染色緩衝液重懸細胞，轉移至流式管中；在流式細胞儀上檢測。

cfse標記技術檢測表位肽誘導的特異性cd4+t細胞增殖

cfse(羥基螢光素二醋酸鹽琥珀醯亞胺脂)是一種活細胞染料，進入細胞後與胞內蛋白形成穩定的大分子螢光結合物。當細胞分裂時,螢光結合物平均分配到兩個子細胞中,而螢光強度為親代細胞的一半。用流式細胞術檢測cfse標記細胞的螢光強度,同時檢測細胞表面標誌分子(如：cd3/cd4)就可以分析淋巴細胞亞群的增殖動力學。

表位肽與患者t細胞親和力高，就可以完全地激活t細胞，誘導t細胞增殖、分化。t細胞增殖分裂過程中，cfse被平均分配至各代細胞中而使細胞的平均螢光強度減弱，通過modfit軟體分析獲得每代細胞數目和增殖指數。所用設計和儀器、具體步驟如下：

1.主要試劑和儀器

cfse(molecularprobes公司)；bdfacscantotmii流式細胞儀

2.方法步驟

2.1cfse標記外周血單個核細胞(pbmc)

2.1.1cfse溶於二甲基亞碸(dmso)配製成儲存液(2mmol/l)分裝後-20℃保存。

2.1.2調整細胞數用rpmi-1640完全培養基調整細胞數為1×107個/ml的細胞懸液。每毫升細胞懸液加入0.5μlcfse貯存液，終濃度為1μmol/l；

2.1.3孵育置37℃孵育10min

2.1.4洗滌加入10mlrpmi-1640完全培養基，1000r/min離心10min，洗滌細胞2次

2.1.5調整細胞數用rpmi-1640完全培養基將染色後pbmc製成細胞懸液，調整細胞數為1×107個/ml。洗滌離心及後續操作過程中注意避光。

2.2t細胞的激活、擴增；

2.2.1調整細胞數用rpmi-1640完全培養基將染色後pbmc製成細胞懸液，調整細胞數為1×107個/mi

2.2.2加入96(24)孔細胞培養板，100μl/孔(1ml)，同時加入稀釋好的多肽，終濃度為20μg/ml。

2.2.337℃，5％c02培養細胞培養

2.3流式細胞術檢測和分析t淋巴細胞亞群的增殖

2.3.1收集細胞用表位肽刺激培養5天收集細胞(每管加入100μl細胞懸液)

2.3.2上機檢測以0.5ml細胞染色緩衝液重懸細胞，轉移至流式管中；在流式細胞儀上檢測。

2.3.3用cellquest軟體獲取數據，然後用modfit軟體分析不同t細胞亞群的增殖動力模型。

應用流式細胞法驗證可刺激t細胞反應的多肽，比較各候選表位肽特異性cd4+t細胞增殖率。外周血單個核細胞經表位肽激活後增殖5天，用螢光抗體染色後在流式細胞儀上測定獲得數據，如圖3所示，其中，圖3中分別為多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30測定的流式細胞結果圖，結果表明ω-510-24刺激增殖的cd3+cd4+t細胞百分比均顯著高於陰性對照組(p＜0.05)。而其他四種表位肽激增殖的cd3+cd4+t細胞與陰性對照組相比無顯著差異(p>0.05)。說明表位肽ω-510-24誘導產生以cd3+cd4+t細胞增殖為主的th型免疫應答，為ω-5醇溶蛋白的潛在表位，這一結果與先前elispot的結果相符。再用modfit軟體中的增殖分析模塊進行分析，得到cd4+t細胞的增殖動力模型，即可計算出增殖指數(proliferationindex，pi，)。-

wdeia患者外周血pbmc經ω-510-24刺激後cd4+t細胞的增殖動力學變化，如圖4所示，其中，圖4中分別為表位肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30刺激的pbmc均發生了增殖反應，但ω-510-24刺激的pbmc則發生了顯著的增殖，經ω-510-24刺激後cd4+t細胞子代增殖總百分比為99.34％，增殖指數為41.82。可見經ω-510-24刺激後wdeia患者cd4+t細胞發生了特異性增殖。

本發明提供的ω-5醇溶蛋白hla-dr限制性t細胞表位鑑定為變應原特異性免疫治療提供了新的靶點。

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中國醫學科學院北京協和醫院

ω-5-醇溶蛋白特異的cd4+t細胞表位及其應用

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