Cd34幹細胞相關方法和組合物的製作方法

2023-05-30 12:11:36

專利名稱：：Cd34幹細胞相關方法和組合物的製作方法
技術領域：
：在整個本申請中，引用了各種出版物。這些出版物以及上面所述的臨時申請的公開內容，通過引用合併入本申請以更全面地描述本發明所屬領域的狀態。幹細胞介導再生和遺傳信息至後來細胞世代的傳遞。它們可自我更新和產生分化的後代。近年來，在我們對幹細胞與它們的組織微生態環境(tissueniche)之間的相互作用背後的分子機制的理解中已取得了進步。這已導致對在幹細胞中起作用的分子調控機制有了更好的理解。雖然基因療法仍然是試驗性方法，但該技術有希望對人健康產生重大影響。在過去數年中，基因療法的範圍和定義已發生了變化並且得到擴展。除了矯治遺傳的遺傳性障礙例如囊性纖維化、血友病和其他實體(entities)夕卜，基因治療法還已發展至抵抗獲得性疾病例如癌症、AIDS、慢性血管缺血(chronicvascularischemia)、骨關節炎、糖尿病、帕金森病和阿爾茨海默病。目前，種系基因療法由於其複雜技術性質和倫理考慮而未被涉及。然而，只對單個個體有益的(不能代代相傳的)體細胞基因療法是幹細胞研究的主要焦點。從至鼠類造血幹細胞內的成功基因轉移的最初描述至先天患有x-連鎖聯合免疫缺陷(SCID)和腺苷脫氨酶缺陷(ADA)-缺陷的患者中的第一例明確成功的臨床試驗花費了15年以上的時間(Aiuti等人，2002;Cavazzana-Calvo等人，2000;Gaspar等人，2004)。幹細胞療法的許多方面正在研究中。例如，逆轉錄病毒載體在許多情況下已被用於將基因轉移入幹細胞中以修復突變的或不完善的基因。此類情況包括嚴重聯合免疫缺陷、範可尼貧血(Fanconianemia)和其他血紅蛋白病(Herzog等人，2006)。幹細胞工程的中心議題是用於將治療性基因導入祖細胞的特殊方法學。因為逆轉錄病毒傾向於插入活性基因(據認為凝縮的染色質在這些區域是打開的)，有人提出，它們的使用還可能增加癌症的風險(Yo皿g等人，2006)，因為逆轉錄病毒載體插入參與細胞增殖的基因附近在理論上可產生前體癌幹細胞(precursorcancerstemcell)。然而，該類型事件的總體風險難以確定。現在有許多在慢性肉芽腫病(CGD)患者中取得完全成功的實例，其中NADra氧化酶的活性在輸注經遺傳改變的血液幹細胞後得到恢復(Barese等人，2004)。富有成效的基因療法的最低要求是在矯治生物學背景中治療性基因產物的持續產生，同時有害副作用最小。為了達到該目的，基因療法中幹細胞的應用將需要發展調節治療性基因表達的新策略以及用於將外源基因有效遞送至幹細胞的方法。通過在確定的組織環境中分化幹細胞來選擇性控制治療性基因的表達是幹細胞工程的重要目標。該方法可以7分化成特定的譜系、維持它們的未分化狀態以待日後移植、增殖，以及調控治療性基因例如自殺基因、細胞因子或生長因子在確定的組織環境中的表達。發明概述本發明提供了用於治療患有胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括將治療有效數量的CD34—幹細胞導入受試者的血流，其中(a)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，(b)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除(myeloablation)，和(c)胃腸障礙以胃腸內皮中需要細胞增殖為特徵。本發明還提供了用於治療糖尿病受試者或前驅糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的CD34—幹細胞，其中(a)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，和(b)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本發明還提供了用於治療患有肌營養不良(musculardystrophy)的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的非自體CD34—幹細胞，其中(a)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，和(b)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本發明還提供了用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷手術(surgery)的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的CD34—幹細胞，其中(a)在即將經歷手術之前、手術期間和/或手術後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞，(b)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，和(c)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本發明還提供了用於改善將要經歷、正在經歷或已經歷身體創傷(physicaltrauma)的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的CD34—幹細胞，其中(a)在即將經歷身體創傷之前、身體創傷期間和/或身體創傷之後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞，(b)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，和(c)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本發明還提供了用於治療患有腫瘤的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼細胞毒性蛋白的區域(其與(ii)啟動子或啟動子/增強子組合有效連接)，由此當經遺傳修飾的CD34—幹細胞接近正在經歷血管生成的腫瘤組織和在其鄰近分化時，選擇性表達細胞毒性蛋白，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本發明提供了用於治療患胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除，和(c)胃腸障礙以胃腸內皮中需要細胞增殖為特徵。本發明還提供了用於治療糖尿病受試者或前驅糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，和(b)8在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本發明提供了用於治療患肌營養不良的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼在受試者的肌肉細胞中不存在的或表達不足的或其在受試者的肌肉細胞中過表達是期望的蛋白質的區域，該區域與(ii)肌肉特異性啟動子或肌肉特異性啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本發明還提供了用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷手術的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。最後，本發明還提供了用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷身體創傷的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。根據結合附圖考慮的下列詳細描述，本發明的其他目的和特徵將變得明顯。然而，應理解，附圖只用於舉例說明目的而不是對本發明的界限的界定，關於本發明的界限應當參考所附的權利要求。應當進一步理解，附圖不必按照比例繪製，並且除非另外指明，否則它們只用於概念性地說明本文中描述的結構和方法。附圖概述在附圖中Sl頂行在四氧嘧啶(ALX)處理之前(左)和之後(右)(胰島素幾乎完全耗盡)，胰島素在正常鼠的e-胰島中的表達。底行不同放大倍數(20x;40x)下的正常的產生胰島素的P-胰島的大小；用CD34-陰性幹細胞(SC)治療ALX處理後的胰島素耗盡的P-胰島完全恢復胰島素的產生，同時產生肥大的跡象(20x和40x)。圖2來自在ALX誘導糖尿病後並且通過SC恢復胰島素產生的鼠胰腺的分離細胞。用組成型表達的綠色螢光蛋白標記移植的CD34-陰性幹細胞，產生胰島素的細胞顯示紅色螢光。不存在兩種標記的共表達，這表明移植的幹細胞本身不表達胰島素而是促進內源性再生。圖3左圖在經過ALX處理後，無SC移植(上)、具有SC移植但未矯正血糖水平(中)的小鼠和在SC移植後具有正常化的血糖水平(下)的小鼠的血糖水平。右圖只有顯示在它們的胰腺(經勻漿用於FACS分析和綠色螢光的檢測)中存在幹細胞的小鼠(E3;紅圈)顯示正常化的血糖水平，這表明移植的細胞在矯正胰島素的產生中的中樞作用。圖4上皮惡性腫瘤從原位癌發展至侵襲性癌並連接至內源血管系統的示意圖。CD34-陰性幹細胞歸巢至此處顯示的新血管形成部位，從而可用作遞送細胞毒性劑或免疫調節劑的特洛伊木馬。圖5檢測乳腺腫瘤中的RFP-陽性細胞。Tie2-RFP轉染的幹細胞分化成內皮並且轉錄RFP。(A)用DAPI復染。(B)形成血管的RFP-陽性細胞。圖6在GCV處理下減少的腫瘤進展。(A)幹細胞-GCV應用方案。如所示分別施用細胞懸浮液(第0天)和GCV-溶液(第5-8天)。在小鼠的治療過程中體重的增加反映總的腫瘤負荷，因為所有乳腺都被涉及。在每一輪治療的第0和第5天以及解剖的當天測量體重。(B)小鼠的組，治療始於第22周，顯示標準差的平均數。將小鼠分選在一個治療組和兩個對照組中，第一對照組接受lxPBS而不接受幹細胞懸浮液並且無藥物注射(虛線)；第二對照組接受用Tie2-RFP轉染的幹細胞懸浮液但不接受GCV(點線)。治療組如圖A中所示接受幹細胞和GCV(實線)。(C)治療始於第18周的組，平均值和標準差。圖7解剖時的年齡。在第22周開始治療的小鼠的對照組對治療組。注意達到相似的腫瘤大小的時間的顯著差異(參見表l)和在用MSCTK-媒介物和GCV成功治療後小鼠的延長的壽命。圖8腫瘤再生長模型在第18周切除原發性乳腺腫瘤和在腫瘤的再生長期間起始MSC/tk治療。圖9表達綠色螢光蛋白(GFP)的MSC歸巢至正在生長的胰腺腫瘤。在平行實驗中，經工程改造表達處於Tie2啟動子/增強子的控制之下的紅色螢光蛋白(RFP)的MSC顯示在腫瘤血管系統中的定向表達。上行經工程改造表達處於CMV啟動子的控制之下的GFP的MSC在i.v.注射後歸巢至腫瘤。下行經工程改造表達處於Tie2的控制之下的RFP的MSC。圖10然後在注射C57Bl/6MSC(Tie2-tk)細胞後評估tk/GCV治療的效果。治療方案基本上與對於乳腺癌研究所述的一樣。在第一天注射500，000個細胞，在之後的3天，讓所述細胞募集至正在生長的腫瘤並且分化成表達內皮樣Tie2的細胞，從而表達TK自殺基因。然後用GVC治療小鼠，進行4天。在l天的休息後，在實驗的持續時間中重複循環。圖11圖顯示用治療性幹細胞和GCV—起治療原位胰腺腫瘤的效果的另外的實例。與未治療組相比較，觀察到腫瘤大小的顯著減小(50%)以及減少的腹膜癌病(peritonealcarcinosis)。目前優選的實施方案的詳述術語在本申請中，使用具有如下所示的意義的某些術語。如本文中所使用的，"急性傷口癒合"將包括，但不限於，在生物學和機械信號的控制下被激活以從受傷的時刻開始修復組織的細胞和分子過程。當貫穿臨時基質的負荷與修復的細胞的反饋之間達到動態平衡時，發生成功的急性傷口癒合。如本文中所使用的，細胞對於受試者來說是"同種異體的"，如果其或任何其前體細胞來自相同物種的另一個受試者的話。如本文中所使用的，細胞相對於所述受試者是"自體的"，如果其或其前體細胞來自該相同的受試者的話。如本文中所使用的，"CD34—幹細胞"表示在其表面上不存在CD34的幹細胞。例如，在LangeC.等人，Acceleratedandsafeexpansionofhumanmesenchymalstromalcellsinanimalser咖—freemedi咖fortransplantationandregenerativemedicine.J.CellPhysiol.2007，Apr.25[在印刷之前電子公開]中描述了CD34—幹細胞和用於分離其的方法。如本文中所使用的，"細胞增殖"應指細胞的分裂、大小上的生長和/或分化。如本文中所使用的，"細胞毒性蛋白"應表示當存在於細胞中、細胞上和/或與細胞鄰近時，直接和/或間接引起該細胞死亡的蛋白質。細胞毒性蛋白包括例如自殺蛋白(例如HSV-tk)和細胞凋亡誘導劑。細胞毒性基因包括用於基因抑制的零基因(nullgene)，siRNA或miRNA(例如CCR5-/-)。許多自殺基因系統已被鑑定，包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因、胞嘧啶脫氨酶基因、水痘_帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因、硝基還原酶基因、大腸桿菌(Escherichiacoli)gpt基因和大腸桿菌Deo基因。胞嘧啶脫氨酶；細胞色素P450;嘌呤核苷磷酸化酶；羧肽酶G2;硝基還原酶。如在YazawaK，FisherWE，BrunicardiFC:Currentprogressinsuicidegenether即yforcancer.WorldJSurg.2002Jul;26(7):783-9中所詳細描述的。細胞毒性因子包括下列因子(i)歸巢因子(homingfactor)例如趨化因子和粘蛋白趨化因子GPI融合物(趨化因子衍生的試劑(chemokinederivedagent)可用於促進經工程改造的幹細胞的定向募集，參見，例如，PCT國際申請號PCT/EP2006/011508，關於用GPI錨定的粘蛋白融合物)；(ii)作為細胞毒性蛋白的病毒抗原(麻疹，禽痘)；和(iii)可在經工程改造的幹細胞的表面上呈遞的Her2/neu抗原，然後施用her-2/neu抗體，和抗CD52表位的CamPath(阿侖珠單抗)。如本文中所使用的，"內皮細胞"應包括但不限於在稱為血管生成的過程期間或之後形成血管中的內膜的襯裡的細胞。控制該過程的因子稱為血管生成因子。內皮細胞還通過受體_配體相互作用與循環血細胞發生作用。如本文中所使用的，"內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合"分別是當在內皮細胞中或在內皮細胞鄰近時，引起有效連接的編碼區的表達(多於其在受試者的任何其他微環境中引起的表達)的啟動子或啟動子/增強子組合。如本文中所使用的，核酸對於細胞來說是"外源的"，如果其已被人工導入該細胞或任何該細胞的前體細胞的話。如本文中所使用的，"胃腸障礙"應表示胃、小腸和/或大腸的任何障礙。如本文中所使用的，幹細胞是"經遺傳修飾的"，如果其或任何其前體細胞已具有11人工導入其的核酸的話。用於產生經遺傳修飾的幹細胞的方法包括病毒或非病毒基因轉移(例如，質粒轉移、噬菌體整合酶、轉座子、AdV、AAV和慢病毒)的使用。如本文中所使用的，"在即將經歷事件之前"包括例如在所述事件之前5、10或30分鐘之內或在所述事件之前1、2、6、12或24小時之內。"在事件之後立即"包括例如在所述事件之後5、10或30分鐘之內或在所述事件之後1、2、6、12或24小時之內。如本文中所使用的，核酸至細胞內的"整合"可以是瞬時的或穩定的。如本文中所使用的，將CD34—幹細胞"導入受試者的血流"應包括但不限於通過注射將此類細胞導入受試者的靜脈或動脈之一。這樣的施用還可進行例如一次或多次，和/或持續一個或多個延長的時期。單次注射是優選的，但在一段時間內(例如，每季、每半年或每年)的重複注射在一些情況下可能是必需的。還優選使用CD34—幹細胞和藥學上可接受的載體的混合物來進行這樣的施用。藥學上可接受的載體對於本領域內技術人員來說是熟知的，包括但不限於0.01-0.1M和優選0.05M的磷酸鹽緩衝液或0.8%的生理鹽溶液。此外，此類藥學上可接受的載體可以是水性的或非水性的溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和可注射的有機酯類例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳劑和懸浮液，包括生理鹽溶液和經緩衝的介質。胃腸外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鹽林格氏溶液和不揮發性油。靜脈內媒介物包括流體和營養補充劑、電解質補充劑例如林格氏葡萄糖、基於林格氏葡萄糖的補充劑等。常用於i.v.施用的流體見於例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，第808頁，LippincottWilliams&Wilkins(2000)中。還可存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。如本文中所使用的，"微循環"應包括但不限於從微動脈至毛細血管或竇狀隙(sinusoid)至小靜脈的血液流動。在某些情況下，術語微循環也用於淋巴管。如本文中所使用的，"骨髓清除"應表示因例如高劑量的化療或放射治療的施用而引起的骨髓細胞的嚴重或完全耗盡。骨髓清除是標準方法，且描述於例如DeegHJ，Klingema皿HG，PhilipsGL，AGuidetoBoneMarrowTransplantation.Springer—VerlagBerlinHeidelberg1992中。如本文中所使用的，幹細胞是"未被遺傳修飾的"，如果其和任何其前體細胞都不具有人工導入其的核酸的話。如本文中所使用的，"核酸"應表示任何核酸分子，包括但不限於DNA、RNA和其雜交體(hybrid)。形成核酸分子的核酸鹼基可以是鹼基A、C、G、T和U以及其衍生物。此類鹼基的衍生物在本領域內是熟知的，並且在PCRSystems,ReagentsandConsumables(PerkinElmerCatalogue1996-1997，RocheMolecularSystems,Inc.,Branchburg，N.J.，USA)中進行了舉例說明。如本文中所使用的，編碼細胞毒性蛋白的核酸區域"有效連接"至啟動子或啟動子/增強子組合，如果這樣的啟動子或啟動子/增強子組合引起所述細胞毒性蛋白的表達的話。如本文中所使用的，"多肽"表示胺基酸殘基的聚合物。"肽"通常指較短的多肽(例如，10個胺基酸殘基)，"蛋白質"通常指較長的多肽(例如，200個胺基酸殘基)。胺基酸殘基可以是天然存在的或其化學類似物。多肽還可包括修飾例如糖基化、脂質附著、硫酸12化、羥基化和ADP-核糖基化。如本文中所使用的，"前驅糖尿病"受試者包括但不限於具有標誌其將可能發生胰島素依賴型糖尿病的症候群的受試者。前驅糖尿病受試者具有比正常胰島素水平更高的胰島素水平。如本文中所使用的，"啟動子"包括但不限於內皮素-1啟動子、前內皮素原-1(pre-proendothelin-l)啟動子、myoD啟動子、NeuroD啟動子、CD20啟動子、胰島素啟動子、Pdx-l啟動子、VEGF啟動子、VEGF-R啟動子、SCL啟動子、Scal啟動子、BDNF(-R)啟動子、NGF(-R)啟動子和EGF-R啟動子。如本文中所使用的，"啟動子/增強子"包括但不限於Tie2啟動子增強子以及Flkl啟動子禾口內含增強子(int皿icenhancer)。如本文中所使用的，與組織"鄰近"包括例如在組織的lmm內，在組織的0.5mm內以及在組織的O.25mm內。如本文中所使用的，當編碼毒性蛋白的經遺傳修飾的CD34—幹細胞鄰近正在進行血管生成的腫瘤組織，以及在其鄰近分化時，如果所述細胞毒性蛋白在該微環境中的表達超過其在該受試者中的任何其他微環境中的表達，那麼所述細胞毒性蛋白被"選擇性表達"。優選，細胞毒性蛋白在該微環境中的表達比其在受試者的任何其他微環境中的表達多至少10倍。如本文中所使用的，"受試者"應表示任何動物，例如人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。如本文中所使用的，"治療有效數量的CD34—幹細胞"包括但不限於下列量和量的範圍(i)大約lx102至大約lx108個細胞/kg體重；(ii)大約lx103至大約lx107個細胞/kg體重；(iii)大約lxl(^至大約lxl6個細胞/kg體重；(iv)大約lxl(^至大約lxl5個細胞/kg體重；(v)大約lx105至大約lx106個細胞/kg體重；(vi)大約5xl04至大約0.5xl05個細胞/kg體重；(Vii)大約lx103個細胞/kg體重；(Viii)大約lx104個細胞/kg體重；(ix)大約5xl04個細胞/kg體重；(x)大約lx105個細胞/kg體重；(xi)大約5xl05個細胞/kg體重；(xii)大約lxl6個細胞/kg體重；和(xiii)大約lxl7個細胞/kg體重。設想的人體重包括但不限於大約50kg、大約60kg、大約70kg、大約80kg、大約90kg和大約100kg。這些數目基於臨床前動物實驗和CD34+造血幹細胞移植的標準方案。單核細胞(包括0034+細胞)通常包含l:23，000至1:300,000的CD34—細胞。如本文中所使用的，"治療"患有障礙的受試者表示減慢、終止或逆轉障礙的進程。在優選實施方案中，治療患有障礙的受試者表示逆轉障礙的進程，理想地達到消除障礙本身的點。如本文中所使用的，改善障礙和治療障礙是等同的。如本文中所使用的，"腫瘤"應包括但不限於形成血管的腫瘤例如前列腺腫瘤、胰腺腫瘤、鱗狀細胞癌、乳腺腫瘤、黑色素瘤、基底細胞癌、肝細胞癌、睪丸癌、神經母細胞瘤、神經膠質瘤或惡性星形細胞腫瘤例如多形性膠質母細胞瘤(glioblastmamultiforme)、結腸直腸腫瘤、子宮內膜癌、肺癌、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤(cervicaltumor)、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤/PNET和惡性淋巴瘤。此類腫瘤包括原發性腫瘤以及轉移性疾病。如本文中所使用的，細胞相對於受試者是"異種的"，如果其或任何其前體細胞來13自不同物種的另一個受試者的話。輛,輔錄本發明提供了用於治療某些狀況的新型的基於幹細胞的方法。此類方法使用CD34—幹細胞(與更晚期幹細胞相反)並且具有眾多有利方面，因為它們對於待治療的受試者不需要進行骨髓清除。用於本方法的CD34—幹細胞可被遺傳修飾或可不被遺傳修飾，取決於治療的障礙。下面詳細描述本方法，從使用未經遺傳修飾的CD34—幹細胞的方法開始，然後是使用經遺傳修飾的CD34—幹細胞的方法。具體地，本發明提供了用於治療患胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的CD34—幹細胞，其中(a)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，(b)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除，和(c)胃腸障礙以胃腸內皮中需要細胞增殖為特徵。在本方法中，胃腸障礙包括但不限於結腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸障礙、克羅恩病、由於急性和慢性腸缺血引起的結腸炎、乳糜瀉(celiacdisease)、惠普爾病(Whippledisease)或幹細胞移植後的移植物抗宿主病。本發明還提供了用於治療糖尿病受試者或前驅糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的CD34—幹細胞，其中(a)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，和(b)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。在本方法的一個實施方案中，受試者是I型糖尿病或II型糖尿病的前驅糖尿病患者。在另一個實施方案中，受試者是遭受I型糖尿病或II型糖尿病的糖尿病患者。本發明還提供了治療患肌營養不良的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的非自體CD34—幹細胞，其中(a)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，和(b)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。在本方法的優選實施方案中，受試者患有杜興肌營養不良(Duchennemusculardystrophy)或貝克肌營養不良(Becker'smusculardystrophy)，並且CD34—幹細胞對於受試者是同種異體的。本發明還提供了用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷手術的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的CD34—幹細胞，其中(a)在即將經歷手術之前、手術期間和/或手術後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞，(b)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，和(c)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本方法適合用於任何類型的手術，包括但不限於腹部手術、胸部手術(thoracicsurgery)、神經夕卜禾鬥手術(neurosurgery)、整型手術或倉寸傷手術(traumasurgery)。此夕卜，手術可以是腹腔鏡手術或開放手術(opensurgery)。本發明還提供了用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷身體創傷的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的CD34—幹細胞，其中(a)在即將經歷身體創傷之前、身體創傷期間和/或身體創傷後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞，(b)CD34—幹細胞未被遺傳修飾，和(c)在導入CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本方法適合於任何類型的身體創傷。特別預期的是(i)分娩，其中在即將經歷該事件之前、該事件期間或該事件之後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞，(ii)由劇烈動作引起的皮肉傷，其中在身體創傷後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞，和(iii)燒傷，其中在身體創傷後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞。在使用未經遺傳修飾的CD34—幹細胞的上述方法中，治療的受試者可以是任何受試者。在優選實施方案中，受試者是人。此外，在使用未經遺傳修飾的CD34—幹細胞的方法中，除非另外說明或指出，否則CD34—幹細胞對於受試者來說可以是同種異體的、自體的或異種的。本發明提供了用於治療患有腫瘤的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼細胞毒性蛋白的區域(其與(ii)啟動子或啟動子/增強子組合有效連接)，由此當經遺傳修飾的CD34—幹細胞接近正在經歷血管生成的腫瘤組織和在其鄰近分化時，選擇性表達細胞毒性蛋白，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。預期該方法可用於所有腫瘤類型，包括例如前列腺腫瘤、胰腺腫瘤、鱗狀細胞癌、乳腺腫瘤、黑色素瘤、基底細胞癌、肝細胞癌、睪丸癌、神經母細胞瘤、神經膠質瘤或惡性星形細胞腫瘤例如多形性膠質母細胞瘤、結腸直腸腫瘤、子宮內膜癌、肺癌、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤/PNET和惡性淋巴瘤。還預期許多啟動子/增強子組合和細胞毒性蛋白可用於該方法。在一個實施方案中，啟動子/增強組合是Tie2啟動子/增強子，細胞毒性蛋白是單純皰疹病毒胸苷激酶，並且以允許單純皰疹病毒胸苷激酶呈遞更昔洛韋⑧(ganciclovir)細胞毒性的方式用更昔洛韋@治療受試者。更昔洛韋③和其使用方法在本領域內是熟知的。本發明還提供了用於治療患有胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除，和(c)胃腸障礙以胃腸內皮中需要細胞增殖為特徵。在該方法中，胃腸障礙優選是結腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸障礙或克羅恩病。預期許多啟動子/增強子組合和增進內皮細胞生長的蛋白可用於該方法。在一個實施方案中，啟動子/增強子組合是Tie2啟動子/增強子，增進內皮細胞生長的蛋白是血管內皮生長因子(VEGF)。除了VEGF外，還預期其他血管生成因子例如HIF-la和碳酸酐酶IX。本發明還提供了用於治療糖尿病受試者或前驅糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。在本方法的一個實施方案中，受試者是I型糖尿病或II型糖尿病的前驅糖尿病患15者。在另一個實施方案中，受試者是遭受I型糖尿病或II型糖尿病的糖尿病患者。預期許多啟動子/增強子組合和增進內皮細胞生長的蛋白可用於該方法。在一個實施方案中，啟動子/增強子組合是Tie2啟動子/增強子，增進內皮細胞生長的蛋白是與血管生成相關的血管內皮生長因子(VEGF)。本發明還提供了用於治療患肌營養不良的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼在受試者的肌肉細胞中不存在的或表達不足的或其在受試者的肌肉細胞中過表達是期望的蛋白質的區域，該區域與(ii)肌肉特異性啟動子或肌肉特異性啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。在本方法的優選實施方案中，受試者患有杜興肌營養不良或貝克肌營養不良，並且CD34—幹細胞對於受試者是同種異體的或自體的。預期許多肌肉特異性啟動子/增強子組合可用於該方法。在一個實施方案中，肌肉特異性啟動子/增強子組合是MyoD啟動子/增強子。在杜興肌營養不良的優選實施方案中，受試者的肌肉細胞中不存在的蛋白質是肌養蛋白(dystrophin)。本發明還提供了用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷手術的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。該方法適合於任何類型的手術，包括但不限於腹部手術、胸部手術、神經外科手術或整形手術。此外，手術可以是腹腔鏡手術或開放手術。預期許多啟動子/增強子組合和增進內皮細胞生長的蛋白可用於該方法。在一個實施方案中，啟動子/增強子組合是Tie2啟動子/增強子，增進內皮細胞生長的蛋白是與血管生成相關的血管內皮生長因子(VEGF)。最後，本發明提供了用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷身體創傷的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。本方法適合於任何類型的身體創傷。特別預期的是(i)分娩，(ii)由劇烈動作引起的皮肉傷，其中在身體創傷後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞，和(iii)燒傷，其中在身體創傷後立即向受試者的血流中導入CD34—幹細胞。預期許多啟動子/增強子組合和增進內皮細胞生長的蛋白可用於該方法。在一個實施方案中，啟動子/增強子組合是Tie2啟動子/增強子，增進內皮細胞生長的蛋白是與血管生成相關的血管內皮生長因子(VEGF)。在使用經遺傳修飾的CD34—幹細胞的上述方法中，治療的受試者可以是任何受試者。在優選實施方案中，受試者是人。此外，在使用經遺傳修飾的CD34—幹細胞的方法中，除非另外說明或指出，否則CD34—幹細胞對於受試者來說可以是同種異體的、自體的或異種的。在使用經遺傳修飾的CD34—幹細胞的本方法中，當幹細胞(i)鄰近靶組織中的適當細胞，(ii)分化和/或(iii)與靶組織中的適當細胞融合時，外源基因表達，即"打開"。用於本發明的各種蛋白質和調控序列可由本領域技術人員容易地獲得。例如，Tie2啟動子增強子的內皮細胞特異性示於SchlaegerTM，BartunkovaS，LawittsJA，Teichma皿G，RisauW，DeutschU，SatoTN.Uniformvascular_endothelial_cell_specificgeneexpressioninbothembryonicandadulttransgenicmice.ProcNatlAcadSciUSA.199794:3058-63中。對於胸苷激酶，可使用HSVTK-V00467皰疹基因(ATP:胸苷5'磷酸轉移酶，e.c.2.7.1.21)(I型株系CL101)。通過參考下面的實驗細節可更好地理解本發明，但本領域技術人員將容易地理解，所述的特定實驗只是在其後的權利要求中更詳盡描述的本發明的舉例說明。實驗細節(ExperimentalDetail)第I部分脂臺m牛細歴白條劍紅跑腦條細CD34-隨f麵幹細胞和基因療法極有希望用於開發治療許多威脅生命的疾病的新工具。幹細胞療法與選擇性基因療法的結合增加了患病或丟失的細胞的再生或替代的治療選擇。CD34-陰性、體外貼壁生長的幹細胞的分化背景中的組織特異性基因表達可用於產生轉基因CD34-陰性祖細胞，這將導致細胞的選擇性以及基因表達的可誘導性(也出於安全原因)。病毒和非病毒基因遞送技術已獲得詳細地描述，同樣地也詳細描述了用於在幹細胞募集和分化的背景中調節基因表達的技術。該新治療策略的潛在臨床應用描述為，將轉基因祖細胞導入癌症或組織再生的部位，從而誘導抗腫瘤治療或促進組織改建(remodeling)和傷口癒合。轉基因祖細胞用作有效的基因遞送媒介物。作為基因遞送媒介物的幹細胞幹細胞提供了為其他療法難以治療的疾病提供細胞療法的潛能。對於每一種類型的幹細胞，最終目標是一樣的所述細胞應當表達特定的基因庫(r印ertoireofgene)，從而改變細胞身份以維持、替代或拯救特定組織。為了幫助支持特定組織環境中的分化，正在嘗試改變幹細胞的"細胞核編程(nuclearprogramming):多能幹細胞、間充質幹細胞和多能成體祖細胞(multipotentadultprogenitorcell，MAPC)代表有希望的幹細胞群體，因為它們能夠沿著不同的譜系分化。它們代表驅動成年哺乳動物組織的更新的"細胞引擎"。此類細胞在整個生命周期中連續分裂而產生經歷分化和成熟的程序的新後代細胞來取代更老的死亡的組織細胞。在一些情況下，所述細胞更新程序被認為提供了用於成體組織的修復和再生的細胞源。不同幹細胞類型的再生潛能構成了當前使人們對使此類細胞適用於細胞替代療法(r印lacementtherapy)產生興趣的用於治療的幹細胞的潛在來源包括骨髓、外周血、CNS、肝、胰腺、肌肉、皮膚、肺、腸、心臟禾卩月旨肪(KoerblingM，EstrovZ，Adultstemcellsfortissuerepair—anewther即euticconc印t)NEJM2003349:570-582)。對於臨床應用，幹細胞的來源應當容易得到和容易收穫(同時對於患者風險最小)並且提供充足的細胞。在這點上，脂肪組織代表了很有希望的組織來源。(AdiposederivedstemcellsfortheregenerationofdamagedtissueParkerM，AdamK，ExpertOpionBiolTherap，2006，567-568)。月旨肪來源的幹細胞和骨髓來源的幹細胞共有相似的生長動力學、細胞衰老的特徵、基因轉導效率、CD表面標記表達和基因轉錄特徵譜(CellsTissuesOrgans.2003;174(3):101-9.Comparisonofmulti—lineagecellsfromhumanadiposetissueandbonemarrow.DeUgarteDA，MorizonoK，ElbarbaryA，AlfonsoZ，ZukPA，ZhuM，Dragoo幾，AshjianP，ThomasB，BenhaimP，ChenI，FraserJ，HedrickMH，MolBiolCell.2002Dec;13(12):4279—95.Humanadiposetissueisasourceofmultipotentstemcells.ZukPA，ZhuM，AshjianP，DeUgarteDA，HuangJI，MizunoH，AlfonsoZC，FraserJK，BenhaimP，HedrickMH)。還對不同來源的幹細胞用作用於抵抗疾病的細胞和基因特異療法的潛在媒介物進行了評價。它們的高自我更新潛能使它們成為恢復或替代器官系統和/或遞送基因產物的極有希望的候選物。雖然祖細胞在體外可顯示良好的增殖和分化潛能，但它們在體內的生物學特性仍不明確。體外擴增的幹細胞代表異質群體，其包括缺乏大多數分化標記如CD34的表達的多代間充質(基質)細胞後代。此類群體可能仍然保留有限的增殖潛能和對沿著間充質和非間充質細胞譜系的終末分化和成熟的應答性。將來，多能幹細胞群體的更好的標記將有望提高區分此類幹細胞與其他祖細胞群體的能力。用於在矯治生物學背景中遞送治療性基因表達的組織特異性啟動子。幹細胞介導的治療最終需要進行核重編程-改變不同組織和器官中的細胞類型的獨特的基因表達模式。在許多遺傳性幹細胞疾病中，遺傳缺陷將存活的不利方面賦予受影響的幹細胞群體。在此類疾病中，"矯正的"幹細胞群體的移植據認為在不存在任何外加的選擇壓力的情況下進行自發的體內選擇。例如，在X-連鎖SCID中，治療性轉基因的導入為經轉導的細胞群體提供了持續增殖和存活有利方面(Neff等人，2006)。然而，相似的體內選擇作用在大部分疾病中通常不是直接可能的。在其中治療性基因的過表達不提供存活有利方面的情況下，可將第二選擇基因(理想地處於藥物調控之下的)整合入載體(Tirona和Kim，2005)。允許受藥物調控的選擇的系統包括使用所謂的"二聚化的化學誘導齊U"(chemicalinducersofdimerization，CID)的可逆蛋白質_蛋白質相互作用。此類系統依賴於兩個組分。第一組分是配體或藥物，第二組分是結合配體結合蛋白結構域和效應結構域(通常為生長因子受體的細胞內部分)的融合蛋白。效應結構域通過藥物結合而被激活，從而導致蛋白質二聚化。從而，信號融合用作在CID存在時打開和在CID撤出後關閉的開關。將象這樣的系統整合入幹細胞群體可以使得能夠藥物依賴性地控制所轉導的細胞群體的增殖(Neff等人，2006;NeffandBlau，2001)。可以看到，幹細胞作為治療性基因的遞送媒介物的用途提供了一系列有利方面。幹細胞通常被活躍地募集至損傷的組織，在組織修復過程中它們在該處進行分化。例如CD34+骨髓來源的祖細胞通過分化成內皮細胞、血管平滑肌細胞、造血細胞和可能地其他細胞類型來促成組織修復。然而，循環祖細胞歸巢至改建組織的機制仍然不清楚。Jin等人已證明整聯蛋白a4l31(VLA-4)可促進循環祖細胞歸巢至在活躍改建的新生血管上表達的a4P1配體VCAM和細胞纖連蛋白。已顯示，表達整聯蛋白a4P1的祖細胞歸巢至活躍的18腫瘤新血管形成位置，但不歸巢至正常組織。整聯蛋白a4Pl但非其他整聯蛋白的拮抗劑可阻斷此類細胞與內皮的粘附和發展成分化的細胞類型。(Jin等人，2006)除了整聯蛋白外，趨化因子和它們的受體也顯示在幹細胞的組織特異性歸巢中起著中心作用。基於它們的趨化因子受體表達譜，預測CD341SC將歸巢至次級淋巴器官(CCR7)、皮膚(CCR4，CCR10)、小腸(CCR10)和唾液腺(CCR10)。在用CMFDA短暫地標記CD34-MSC或穩定地導入綠色螢光蛋白(GFP)表達質粒後，將細胞注射入同基因型健康小鼠，然後在1、3和7天後測定細胞的組織分布。有趣地，幹細胞不回歸至骨髓，而是根據它們的趨化因子受體表達譜遷移至次級淋巴器官、唾液腺、腸和皮膚。假定幹細胞在正常以及患病情況下可顯示至不同組織微環境的選擇性遷移，那麼在理論上可使用與在被募集的幹細胞中啟動的分化途徑相關的組織特異性啟動子來驅動治療性基因只在確定的生物學背景中選擇性表達。被募集至其他組織微生態環境，但不進行相同的分化程序的幹細胞將不表達所述治療性基因。該方法允許在顯著的程度上潛在地控制治療性基因在確定的微環境中選擇性表達並且已成功地用於在新血管形成過程中調節治療性基因表達。許多啟動子已就它們的組織特異性表達進行了表徵。該信息的詳細來源可見於轉基因文獻，或例如見於各種資料庫，所述資料庫列出了CRE轉基因表達(用於驅動小鼠的組織特異性CRE/Lox靶向基因缺失模型)的組織特異性啟動子活性(例如http:〃www.mshri.on.ca/nagy/Creiorks.htm)。可導入在炎症或新血管形成的背景中被選擇性調控的啟動子。在這點上，已就內皮特異性表達研究了Tie2-啟動子、Flkl啟動子和內含啟動子、內皮素-l啟動子和前內皮素原-1啟動子(Huss等人，2004)。特定報告基因和新成像技術的應用可用於確定候選啟動子在幹細胞移植背景中的組織特異性表達。關於基因遞送的其他選擇包括將內部核糖體進入位點(IRES)信號用於從單個啟動子表達多個基因(Jackson，2005)，例如，可將與報告基因連接的治療性基因用於在實驗背景下更好地跟蹤治療性基因表達的分布。重要地，許多啟動子可顯示在其他組織類型中的表達"滲漏"或在經工程改造的細胞中的低水平基礎表達。啟動子工程改造是項新技術，其可允許人們"調節"啟動子特異性以限制跨組織活性，從而允許將表達更好地限制至特定細胞類型(Fessele等人，2002;Werner等人，2003)。基因遞送方法目前可用於幹細胞工程的各種基因遞送方法包括病毒和非病毒載體以及轉染的生物學或化學方法。所述方法可在所使用的系統中產生穩定的基因表達或瞬時基因表達。病毒基因遞送系統由於經遺傳修飾的病毒的高轉染效率，它們已被廣泛用於將基因遞送至幹細胞內。DNA病毒載體(i)腺病毒腺病毒是雙鏈、無包膜二十面體病毒，其包含36kb的病毒基因組(Kojaoghlanian等人，2003)。取決於其表達是在DNA複製之前還是之後發生，它們的基因被分類為早期(E1A、E1B、E2、E3、E4)、延遲(delayed)(IX，IVa2)和主要晚期(Ll、L2、L3、L4、L5)基因。迄今為止，已描述了51個可在多種器官中感染和複製的人腺病毒血清型。病毒被分類為下列亞型A-以高頻率和短潛伏期誘導腫瘤，B-具有微弱的致癌性，和C-是不致癌的(Cao等人，2004;Kojaoghlanian等人，2003)。此類病毒已用於產生一系列用於基因轉移細胞工程的載體。第一代腺病毒載體是通過缺失E1基因(病毒複製所必需的)，從而產生具有4kb克隆容量(cloningcapacity)的載體來產生的。E3(負責宿主免疫應答)的額外缺失提供了8kb的克隆容量(Bett等人，1994;Danthinne和Imperiale，2000;Danthinne和Werth，2000)。第二代載體是通過缺失E2區域(病毒複製所必需的)和/或E4區域(參與宿主細胞細胞凋亡的抑制)以及缺失El或E3來產生的。所得的載體具有10-13kb的克隆容量(Armentano等人，1995)。第三"gutted"代的載體是通過缺失除了反向末端重複(ITRs)和順式作用包裝信號外的全部病毒序列來產生的。此類載體具有25kb的克隆容量(Kochanek等人，2001)並且保留它們在靜止和分裂細胞中的高轉染效率。重要地，腺病毒載體通常不整合入宿主細胞的基因組，但它們已顯示將基因瞬時遞送入成體幹細胞的功效。此類載體具有一系列有利和不利方面。重要的有利方面是它們可以以高滴度擴增並且可感染多種細胞(Benihoud等人，1999;KanervaandHemminki，2005)。一般地，載體由於它們在各種貯存條件下的穩定性而容易操作。腺病毒5型(Ad5)已被成功用於遞送基因至人和小鼠幹細胞中(Smith-Arica等人，2003)。腺病毒不整合入宿主細胞遺傳物質在許多情況下可視為不利方面，因為其的使用只允許治療性基因的瞬時表達。例如在評估當TGF-P1和骨形態發生蛋白_2(BMP-2)通過腺病毒介導的表達遞送時，間充質幹細胞進行軟骨形成的能力的研究中，發現軟骨形成與瞬時表達的蛋白質的水平和持續時間密切相關。所有聚集體(aggregate)中轉基因表達是高度短暫的，顯示在7天後顯著減少。軟骨形成在經修飾表達>100ng/mlTGF-P1或BMP-2的聚集體中被抑制；然而，這部分是由於暴露於高腺病毒負荷的抑制作用(MolTher.2005Aug;12(2):219—28.Gene—inducedchondrogenesisofprimarymesenchymalstemcellsinvitro.PalmerGD，SteinertA，PascherA，GouzeE，GouzeJN，Betz0，JohnstoneB，EvansCH，GhivizzaniSC.)。在使用用攜帶重組人骨形態發生蛋白_7(BMP-7)基因的腺病毒轉導的大鼠脂肪來源的幹細胞的第二模型中，顯示了幹細胞的自體來源用於BMP基因治療的極具前景的結果。然而，通過體外測量鹼性磷酸酶來估量的活性是短暫的，其在第8天達到峰值。因此結果與在軟骨形成模型中發現的結果相似(Cytother即y.2005;7(3):273-81)。因此，對於不需要穩定的基因表達的治療或實驗，腺病毒載體可以是良好的選擇。使用腺病毒載體的另外的重要問題是它們可在經工程改造的細胞轉移入宿主後引起針對所述經工程改造的細胞的強免疫應答。顯然，當考慮在治療情況下應用經工程改造的細胞時，這可以是重要的問題。(J.N.Glasgow等人，Transductionalandtranscriptionaltargetingofadenovirusforclinical鄰plications.CurrGeneTher.2004Mar54(1):1-14).Invitroandinvivoinductionofboneformationbasedonexvivogenether即yusingratadipose—derivedadultstemcellsexpressingBMP_7，YangM，MaQJ，DangGT，MaK，ChenP，ZhouCY.)已顯示，基於Ad5型的腺病毒載體通過主受體(primaryrec印tor)柯薩奇病毒20和腺病毒受體(CAR)有效且短暫地導入外源基因。然而，一些類型的幹細胞例如MSC和造血幹細胞因為不存在CAR表達而明顯不能用基於Ad血清型5(Ad5)的常規腺病毒載體來有效轉導。為了克服該問題，已開發了纖維修飾(fiber-modified)腺病毒載體和基於另一種腺病毒血清型的腺病毒載體。(MolPharm.2006Mar_Apr;3(2):95-103.Adenovirusvector—mediatedgenetransferintostemcells.KawabataK，SakuraiF，KoizumiN，HayakawaT，MizuguchiH.LaboratoryofGeneTransferandRegulation,NationalInstituteofBiomedicalInnovation,Osaka567-0085，Japan.)(ii)腺伴隨病毒腺伴隨病毒(AAV)是細小病毒科的ssDNA動物病毒的普遍存在的、非致細胞病變的、不會g複製的成員(G.Gao等人，NewrecombinantserotypesofAAVvectors.CurrGeneTher.2005Jun;5(3):285-97)。AAV是具有4.7kb基因組的小二十面體病毒。此類病毒具有由摺疊成髮夾結構的回文重複組成的特徵末端。它們在輔助病毒的幫助下複製，所述輔助病毒通常是腺病毒的許多血清型之一。在輔助病毒不存在的情況下，它們在第19號染色體的特定基因座(AAVS1)上整合入人基因組並且保持潛伏態直至輔助病毒感染發生(Atchison等人，1965，1966)。AAV可轉導來自不同物種包括小鼠、大鼠和猴子的細胞類型。在血清型中，AAV2的研究最詳盡並且被廣泛用作基因遞送載體。其基因組編碼兩個巨大的開放讀框(0RF)r印和c即。R印基因編碼在病毒生命周期的不同階段(例如DNA複製、轉錄控制、位點特異性整合、用於病毒包裝的單鏈基因組的積累)起著重要作用的4種蛋白R印78、R印68、R印52和R印40。c即基因編碼3種病毒殼體蛋白VP1、VP2、VP3(Becerra等人，198S;B皿ing等人，2003)。基因組3'末端用作第二鏈合成的引物並且具有用作病毒的整合序列的末端斷裂位點(terminalresolutionsite,TRS)，因為該序列與第19號染色體上的序列相同(Young和Samulski，2001;Young等人，2000)。此類病毒與腺病毒的相似之處在於它們能夠感染廣泛的分裂和非分裂細胞。與腺病毒不同，它們具有在人基因組的特定位置整合入宿主基因組的能力。不幸的是，由於它們的基因組相當大，因此AAV載體具有有限的轉移外源基因插入物的容量(Wu和Ataai，2000)。RNA病毒載體(i)逆轉錄病毒逆轉錄病毒基因組由兩個相同的單鏈有義RNA拷貝組成，其長度為7-10kb，編碼3個基因gag、pol和env，側翼有長末端重複(LTR)(Yu和Schaffer，2005)。gag基因編碼包含基質和核殼體元件(其為gag前體蛋白的切割產物)的核心蛋白殼體。pol基因編碼來源於gag-pol前體基因的病毒蛋白酶、逆轉錄酶和整合酶。env基因編碼介導病毒進入的包膜糖蛋白。逆轉錄病毒基因組的重要特徵是在基因組的每一末端存在LTR。此類序列有助於病毒DNA合成的起始、調節前病毒DNA至宿主基因組的整合以及用作病毒基因轉錄調控中的啟動子。逆轉錄病毒被細分為3個大組致癌逆轉錄病毒(莫洛尼鼠白血病病毒，MoMLV)、慢病毒(HIV)禾口泡沫病毒(spumavirus)(泡沫病毒(foamyvirus))(Trobridge等人，2002)。基於逆轉錄病毒的載體是最常使用的基因治療整合載體。此類載體通常具有大約8kb的克隆容量，且通常通過完全缺失除了LTR和順式作用包裝信號外的病毒序列來產生。逆轉錄病毒載體在基因組的隨機位置上整合。與此相關的問題包括潛在的插入誘變和由LTR驅動的潛在的致癌活性。LTR的U3區域具有啟動子和增強子元件，因此該區域，當從載體缺失時，可導致其中LTR驅動的轉錄被阻止的自失活載體(self-inactivatingvector)。內部啟動子然後可用於驅動轉基因的表達。小鼠幹細胞基因轉移的初步研究產生了這樣的希望，即至人中的基因轉移將同樣是有效的(0'Co皿or和Crystal，2006)。不幸的是，使用可獲得的逆轉錄病毒載體系統轉染多譜系長期再生的幹細胞的基因轉移在小鼠中仍然顯著更有效率。逆轉錄病毒載體在人中基因轉移功效的減少以及不受控制的整合代表了在幹細胞工程背景中將此類載體用作治療手段的重要障礙。(ii)慢病毒慢病毒是病毒的逆轉錄病毒科的成員(M.Scherr等人，Genetransferintohematopoieticstemcellsusinglentiviralvectors.CurrGeneTher.2002Feb;2(1):45-55.)。它們具有與致癌逆轉錄病毒相比較更複雜的基因組和複製周期(Beyer等人，2002)。它們與較簡單的逆轉錄病毒的不同之處在於它們具有額外的調控基因和元件，例如介導病毒轉錄的反式激活的tat基因(Sodroski等人，1996)和介導未剪接的病毒RNA的細胞核輸出的rev(Cochrane等人，1990;Emerman和Temin，1986)。通過除去病毒複製所必需的基因(而使病毒無活性)來從人免疫缺陷病毒(HIV-1)獲得慢病毒載體。儘管它們缺乏複製基因，但載體仍然能夠有效整合入宿主基因組，從而使得轉基因能夠穩定表達。此類載體具有額外的有利方面，低細胞毒性和感染不同細胞類型的能力。也已從猿猴、馬科和貓科動物來源開發出慢病毒載體，但來源於人免疫缺陷病毒(HIV)的載體是最常用的(Yo皿g等人，2006)。慢病毒載體通過缺失除了LTR和順式作用包裝信號外的全部病毒序列來產生。所得的載體具有大約8kb的克隆容量。此類載體與逆轉錄病毒載體的一個不同的特徵是它們轉導分裂和非分裂細胞以及終末分化的細胞的能力(Kosaka等人，2004)。慢病毒遞送系統能夠在人間充質和胚胎幹細胞中具有高感染率。在由Clements等人進行的研究中，慢病毒的主鏈經改造表達單和雙順反子轉基因，並且還可用於遞送用於在人幹細胞中特異性沉默基因表達的短髮夾核糖核酸。(TissueEng.2006Jul;12(7):1741-51.Lentiviralmanipulationofgeneexpressioninhumanadultandembryonicstemcells.ClementsMO，GodfreyA，CrossleyJ，WilsonSJ，TakeuchiY，BoshoffC.)表1概述了上述病毒載體。載體插入容量(kb)向性載體基因組形式表達炎症潛力效率包膜的22tableseeoriginaldocumentpage23非病毒基因遞送系統(i)用於促進基因整合的方法除了上面論述的基於病毒的載體外，目前正在開發缺乏病毒序列的其他載體系統。備選策略包括常規質粒轉移和利用整合酶或轉座酶技術進行的靶向基因整合的應用。這些策略代表了用於載體整合的重要的新方法並且在它們的整合中具有有效和通常位點特異性的有利方面。目前3種重組酶系統可獲得用於遺傳工程來自噬菌體PI的ere重組酶(Lakso等人，1992;0rban等人，1992)、來自酵母2微米質粒的FLP(翻轉酶)(Dymecki，1996;Rodriguez等人，2000)和從鏈黴菌噬菌體(str印tomysesphage)fIC31分離的整合酶(GinsburgandCalos，2005)。這些重組酶的每一種識別特異性耙整合位點。Cre和FLP重組酶分別在稱為loxP(用於交換的基因座)和FRT(FLP重組酶的靶)的34bp迴文序列上催化整合。噬菌體整合酶催化哺乳動物基因組中的兩個短att識別位點之間的位點特異性單向重組。重組導致整合(當att位點存在於兩個不同的DNA分子上時)和缺失或倒位(當att位點存在於相同分子上時)。已發現其在組織培養細胞(體外)和小鼠(體內)中起作用。睡美人(Sle印ingBeauty,SB)轉座子由兩個各自340個鹼基對的反向末端重複組成(Izsvak等人，2000)。該系統指導特定構建體從供體質粒精確轉移至哺乳動物染色體內。轉座子從質粒載體至染色體位點的切割和整合由SB轉座酶介導，該轉座酶可以以順式23或反式方式被遞送至細胞(Kaminski等人，2002)。染色體整合的轉座子中的基因可在細胞中終生表達。SB轉座酶隨機地在TA-二核苷酸鹼基對上整合，雖然側翼序列可影響整合。雖然迄今為止的結果不表明SB轉座子的隨機整合代表了相同的對於病毒載體所觀察到的風險水平，但在該系統可安全地用於人試驗之前需要更多的數據。將載體導入細胞的物理方法(i)電穿孔電穿孔依賴於通過克服膜電容在膜上產生瞬間小孔的短暫的、高電壓電脈衝的使用。該方法的一個有利方面是其可用於大多數細胞類型的穩定和瞬時基因表達。該技術依賴於磷脂膜中疏水和親水相互作用的相對弱的性質以及其在擾亂後恢復其原始狀態的能力。當膜被擊穿時，極性分子可以以高的效率被遞送入細胞。大的帶電荷分子如DNA和RNA通過由它們的電泳梯度驅動的過程移入細胞。脈衝的振幅控制細胞表面上被擊穿的總面積，脈衝的持續時間確定擊穿的程度(Gabriel和Teissie，1997)。細胞的穿透狀態取決於脈衝的強度。強脈衝可導致對細胞的不可逆的擊穿、不可修復的損傷和最終細胞死亡。為此，電穿孔可能是最劇烈的基因遞送方法，其通常需要更大數量的DNA和細胞。該方法的效率取決於許多至關重要的因素如細胞的大小、脈衝應用期間的重複次數(implication)和溫度(Rols和Teissie，1990)。該技術最有利的方面是可將DNA直接轉移入細胞核，從而增加其整合入宿主基因組的概率。甚至難以轉染的細胞也可使用該方法穩定地轉染(Aluigi等人，2005;Zernecke等人，2003)。電穿孔期間使用的轉染方法的改進已導致稱為核轉染(皿cleofection)的有效的基因轉移法的開發。NucleofectorTM技術是非病毒的基於電穿孔的基因轉移技術，已證明該技術是轉染難以轉染的細胞系和原代細胞(包括MSC)的有效工具(MichelaAluigi，StemCells第24巻，No.2，February2006，pp.454-461)。基於生物分子的方法(i)蛋白質轉導結構域(PTD)PTD是不利用胞吞途徑或蛋白質通道而被運送入細胞的短肽。它們進入細胞的機制還不十分清楚，但其即使在低溫下亦可發生(Derossi等人1996)。兩種最常用的天然存在的PTD是人免疫缺陷病毒轉錄結構域的反式激活蛋白(TAT)和觸角足基因(Antenn即edia)轉錄因子的同源域。除了此類天然存在的PTD夕卜，存在許多具有自發穿過細胞膜的能力的人工肽(Joliot和Prochiantz，2004)。這些肽可共價連接至PNA(肽核酸)的假肽主鏈以幫助將它們遞送入細胞。(ii)脂質體脂質體是與細胞膜相似的合成媒介物。當用水攪動脂質分子時，它們自發地形成圍繞水性中心的球形雙層膜區室，從而形成脂質體。它們可與細胞融合併且允許"包裝的"物質轉移入細胞。脂質體已成功地用於將基因、藥物、報告蛋白和其他生物分子遞送入細胞(Felnerova等人，2004)。脂質體的有利方面是它們由天然的生物分子(脂質)製造並且無免疫原性。可在形成期間將不同的親水分子整合入其中。例如，當將具有帶正電荷的頭部基團(headgroup)的脂質與重組DNA混合時，它們可形成其中帶負電荷的DNA與脂質分子的帶正荷的頭部基團複合的脂質體複合物(lipoplexe)。此類複合物然後可利用胞吞途徑進入細胞並且將DNA遞送入溶酶體區室。DNA分子可在二油醯乙醇胺(DOPE)的幫助下逃離該區室並且被運送入細胞核，在細胞核中它們可進行轉錄(Tranchant等人，2004)。儘管它們非常簡單，但脂質體遭受低轉染效率的詬病，因為它們因血漿蛋白的吸附而被網狀內皮系統快速清除。已使用許多穩定脂質體的方法，包括用寡糖修飾脂質體表面，從而在立體上穩定脂質體(Xu等人，2002)。(iii)免疫脂質體免疫脂質體是具有插入它們的膜的特異性抗體的脂質體。抗體選擇性結合靶細胞上的特定表面分子以促進吸收。被抗體靶向的表面分子是優選被細胞內化的表面分子，從而在結合後，整個複合物被吸收。該方法通過增強脂質體組分的細胞內釋放來增加轉染效率。可將此類抗體插入脂質體表面(通過不同的脂質錨)或附著在脂質體表面上接枝的聚乙二醇末端上。除了提供基因遞送的特異性外，抗體還可為脂質體提供在吸收後幫助限制它們被內源性RNA酶或蛋白酶降解的防護層(protectivecovering)(Bendas，2001)。為了進一步防止脂質體和它們的內容物在溶酶體區室中被降解，可使用pH敏感性免疫脂質體(Torchilin，2006)。此類脂質體通過與細胞器內的內體膜融合來增加脂質體內容物至細胞溶膠的釋放，因為它們在酸性PH下變得不穩定且易於融合。—般來說，非病毒基因遞送系統不如病毒基因遞送系統一樣被廣泛用作將基因遞送入幹細胞的工具。然而，在著眼於成體神經幹細胞/祖細胞的轉染成活力、增殖和至3種神經譜系神經元的分化的研究中顯示了富有希望的結果。非病毒、非脂質體基因遞送系統(ExGen500和FuGene6)具有16%(ExGen500)至11%(FuGene6)的細胞轉染效率。FuGene6-處理的細胞在它們的成活力或增殖率上與未轉染的細胞不同，然而此類特徵在ExGen500轉染後顯著減少。重要地，沒有一種試劑在轉染後影響分化的模式。兩種試劑都可用於遺傳標記細胞，從而在離體移植入器官型海馬腦切片(organotypichi卯ocampalslice)培養物後追蹤它們至3種神經譜系的分化(JGeneMed.2006Jan;8(1):72-81.Efficientnon_viraltransfectionofadultneuralstem/progenitorcells,withoutaffectingviability,proliferationordifferentiation.TinsleyRB，FaijersonJ，ErikssonPS)。(iv)基於聚合物的方法多聚L-賴氨酸(PLL)的質子化的e-氨基與帶負電荷的DNA分子相互作用，從而形成可用於基因遞送的複合物。此類複合物相當不穩定並且顯示聚集的傾向(Kwoh等人，1999)。聚乙二醇(PEG)的綴合經發現導致增加的複合物的穩定性。(Lee等人，2005，Harada-Shiba等人，2002)。為了提供一定程度的組織特異性，還利用了靶向性分子例如組織特異性抗體(Trubetskoy等人，1992，Suh等人，2001)。已用於轉染細胞的另外的基因載體是也與DNA形成複合物的聚乙烯亞胺(PEI)。由於存在具有不同pKa值的胺，其具有逃脫內體區室的能力(Boussif等人，1995)。發現接枝至PEI複合物上的PEG減少了此類複合物的細胞毒性和聚集。還可將其與綴合的抗體組合使用以提供組織特異性(Mishra等人，2004，Shi等人，2003，Chiu等人，2004，Merdan等人，2003)。用於藥物的暗示(Implicationsformedicine)幹細胞不僅具有分化成不同組織的能力，而且由於它們固有的歸巢至受損組織的能力，它們具有將治療性基因的表達遞送至特定組織環境的潛能。通過使用分子工程方法，幹細胞可用作在缺陷或需要的區域中選擇性表達基因，從而只在需要其的地方釋放轉染的治療性產物的媒介物。其中經遺傳工程改造的幹細胞在將來可能起重要作用的疾病是其中蛋白質或整個酶丟失或無功能或其中某些因子在特定的組織中提供改善的功能的疾病。對於許多疾病包括癌症、神經變性障礙例如帕金森病或阿爾茨海默病，缺血性心臟病和肌營養不良的治療，已進行了一系列在治療背景中使用幹細胞的研究。藥物抗性基因至造血幹細胞的轉移顯示，其有希望用於治療許多遺傳疾病。此類遺傳疾病包括X-連鎖嚴重聯合免疫缺陷、腺苷脫氨酶缺陷、地中海貧血。聯合的幹細胞和基因療法有可能進行定製以用於獲得性障礙例如乳腺癌、淋巴瘤、腦瘤和睪丸癌的治療。在這點上，已開始了使用聯合療法治療癌症的研究。這些研究的範圍從提高移植的造血幹細胞的藥物抗性至使用經遺傳修飾的幹細胞靶向癌症。將藥物抗性基因轉移入造血幹細胞以提供抗化學治療誘導的骨髓抑制的骨髓保護作用(myeloprotection)或選擇用矯治遺傳性障礙的另一種基因共同轉導的造血幹細胞。(CancerGeneTher.，2005Nov;12(11):849-63.Hematopoieticstemcellgenetherapywithdrugresistancegenes:anupdate.Budak—AlpdoganT，BanerjeeD，BertinoJR)。使用幹細胞靶向癌症的實例包括通過使用經遺傳工程改造的神經幹細胞治療神經膠質瘤，和使用攜帶核糖核酸酶抑制劑基因的造血幹細胞靶向黑色素瘤的血管系統來增強旁觀者效應介導的基因療法。用於癌症的另外的方法利用幹細胞被募集至腫瘤血管系統並且分化成內皮樣細胞的能力。取決於腫瘤類型，腫瘤中大約30%的新血管內皮細胞可來源於骨髓祖細胞(Hammerling和Ganss，2006)。因此，從外周循環募集的經遺傳修飾的祖細胞的使用可代表用於腫瘤的基因治療的潛在媒介物(Reyes等人，2002)。已將單純皰疹病毒1(HSV)胸苷激酶(tk)自殺基因和更昔洛韋@(GCV)—起成功地用於各種實體瘤的體內治療(Dancer等人，2003;Pasahen等人，2003)。內皮細胞在新血管形成過程中對HSV-tk的選擇性表達與GCV的tk修飾一起產生了增殖細胞的致死環境。已鑑定了一系列啟動子，所述啟動子在新血管形成過程中被誘導，從而使得在經工程改造的前體細胞被募集和分化後能夠選擇性激活自殺基因。"旁觀者效應"被描述為細胞介導對遠距離細胞的細胞損傷的能力。在Li等人進行的最近的研究中，檢查到用HSV-tk基因轉導的神經幹細胞(NSCtk)對大鼠神經膠質瘤細胞的旁觀者效應。無胸腺裸小鼠或Sprague-Dawley大鼠中的顱內共植入實驗顯示，用NSCtk和神經膠質瘤細胞共植入，然後用更昔洛韋@(GCV)治療的動物顯示無顱內腫瘤並且存活100天以上，而用生理鹽水(PS)治療的動物死於腫瘤進展。(CancerGeneTher.，2005Juls12(7):600_7.Bystandereffect_mediatedgenether鄰yofgliomasusinggeneticallyengineeredneuralstemcells.LiS，TokuyamaT，YamamotoJ，KoideM，YokotaN，NambaH)。人核糖核酸酶抑制劑(hRI)可抑制胰腺RNA酶(RNA酶A)的活性，已表明RI可用作潛在的抗血管生成劑。Fu等人檢查了將RI基因轉染入鼠類造血細胞，然後誘導表達以阻斷實體瘤中的血管生成的可行性。將人胎盤的RI克隆和插入逆轉錄病毒載體pLNCX。26然後用pLNCX-RI逆轉錄病毒載體感染鼠骨髓造血細胞。然後將感染的細胞注射入經致死性輻射處理的小鼠。在施用攜帶RI基因的造血細胞後，將B16黑色素瘤植入小鼠並讓腫瘤生長21天。對照組的腫瘤變得很大並且形成豐富的血管。相反地，用攜帶RI基因的造血細胞處理的小鼠的腫瘤較小並且具有密度相對低的血管。(CancerGeneTher.2005Mar:12(3):268-75.Anti-t咖orefrectofhematopoieticcellscarryingthegeneofribo皿cleaseinhibitor.FuP，ChenJ，TianY，WatkinsT，CuiX，ZhaoB.)聚焦在帕金森病上的許多研究利用細胞移植或基因療法(GeneTher.，2003S印；10(20):1721-7.Genetherapyprogressandprospects:Parkinson'sdisease.BurtonEA，GloriosoJC，FinkDJ)。然而，迄今為止，少數研究組合這兩種方法。Liu等人使用骨髓來源的基質細胞來遞送治療性基因至大腦。作者使用腺伴隨病毒(AAV)載體來遞送酪氨酸羥化酶(TH)基因至骨髓基質細胞。然後將表達TH基因的MSC移植入帕金森病大鼠的紋狀體(striatum)。發現基因表達效率為大約75%。在經TH工程改造的骨髓基質細胞植入後檢測到患病大鼠的功能性改善。組織學檢查顯示，TH基因在移植點周圍表達，並且大鼠的受損紋狀體中多巴胺水平比對照中高。觀察到動物的功能性改善(BrainResBrainResProtoc.，2005May;15(1):46-51.Epub2005，Apr22.TherapeuticbenefitofTH_engineeredmesenchymalstemcellsforParkinson'sdisease丄uL，ZhaoC丄iuY，SunX，DuanC，JiM，ZhaoH，XuQ，YangH.)。缺血性心血管疾病是經工程改造的幹細胞治療的另外的靶。Chen等人使用從人臍帶血獲得的純化的CD34(+)細胞，然後使用AAV載體用人血管生成素-l(Angl)和VEGF(165)基因進行轉染。將經工程改造的細胞和VEGF—起在左前游離壁進行心肌內注射，這導致治療後減少的梗塞面積和顯著增加的毛細血管密度，以及在心肌梗塞後4周使用超聲心動圖測得的改善的長期心功能。(EurJClinInvest.，2005Nov;35(11):677_86.Combinedcordbloodstemcellsandgenether即yenhancesangiogenesisandimprovescardiacperformanceinmouseafteracutemyocardialinfarction.ChenHK，HungHF，ShyuKG，WangBW，SheuJR，LiangYJ，ChangCC，KuanP.)肌營養不良代表了特徵在於進行性肌肉萎縮的神經肌肉障礙的異質群體。迄今為止，對於此類患者沒有適當的治療方案。已就其矯治營養不良表型的能力對包括MSC在內的成體幹細胞群體以及胚胎幹細胞進行了評估。迄今為止，所述方法未顯現多大希望。解釋失敗的理由例證了當使用經遺傳修飾的幹細胞時研究者遭遇的困難負責幹細胞的生肌潛能的背後機制仍然未完全闡明，供體群體至肌肉的歸巢通常不足，以及受者中未被充分理解的免疫應答可導致有限的治療成功(Stemcellbasedtherapiestotreatmusculardystrophies.Price，Kuroda，Rudnicki)。用於治療杜興肌營養不良(DMD)的一個方法利用已用治療性表達盒轉導的生肌幹細胞(myogenicstemcell)的自體細胞移植。該方法的發展受到一系列問題的阻礙，包括低頻率的細胞植入、跟蹤移植的細胞的困難、攜帶標記基因的自體細胞的快速丟失以及將肌養蛋白基因穩定轉移入生肌幹細胞中的困難。通過用eGFP編碼序列替代肌養蛋白C末端結構域(DeltaCT)和除去大部分肌養蛋白中心柱結構域(DeltaH2-R19)來對miniDys-GFP融合基因進行工程改造。在表達處於骨骼肌特異性啟動子控制之下的miniDys-GFP融合蛋白的轉基因mdx(4Cv)小鼠中，綠色融合蛋白定位在肌纖維膜上，其在該處裝配肌養蛋白-糖蛋白複合物並且阻止營養不良在轉基因mdx(4Cv)小鼠肌肉中發生。(HumMolGenet.，2006Mayl5;15(10):1610-22.Epub2006Apr4.Ahighlyfunctionalmini_dystrophin/GFPfusiongeneforcellandgenetherapystudiesofDuche皿emusculardystrophy丄iS，KimuraE，NgR，FallBM，MeuseL，ReyesM，FaulknerJA，ChamberlainJS.)維-奧二氏症候群(Wiskott-Aldrich-Syndrome)特徵在於血小板減少、失調和在生命更晚期朝向淋巴瘤發展的傾向，其代表了經工程改造的幹細胞治療的潛在靶(Dupre等人，2006)。範可尼貧血被認為是"幹細胞疾病"並且已成為有關使用基因療法的治療的深入研究的主題。該疾病代表了詳盡表徵的造血幹細胞的先天性缺陷。其是以骨髓衰竭和發育異常、高發病率的脊髓發育不良(myelodysplasia)、急性非淋巴細胞性白血病和實體瘤為特徵的罕見遺傳性疾病。範可尼貧血的遺傳學基礎在於任何一個已知的範可尼貧血基因中的選擇性突變，這使該疾病成為基因療法的候選物。但該疾病非常複雜，因為已描述了至少12個遺傳亞型(FA-A，-B，-C，-Dl，-D2，_E，_F，_G，-1，-J，_L，_M)，並且除了FA-I以外所有亞型都與獨特的基因相關聯。大多數FA蛋白形成通過單泛素化激活FANCD2蛋白的複合物，而FANCJ和FANCD1/BRCA2在該步驟下遊起作用。除了FANCJ/BRIP1和FANCM(其為DNA解旋酶)以及FANCL(其可能為E3泛素綴合酶)夕卜，FA蛋白通常缺乏功能性結構域。基於對交聯劑的超敏感性，FA蛋白據認為在阻止DNA複製叉前進的DNA鏈內交聯的修復中起作用。(CellOncol.2006:28(1-2):3-29.TheFanconianemiapathwayofgenomicmaintenance.LevitusM，.ToenieH，deWinterJP.)作為基因治療的潛在候選對象的另外的遺傳性幹細胞缺陷包括無巨核細胞性血小板減少症(amegakaryocyticthrombocytopenia)、先天性角化不良(dyskeratosiscongenity)和舒-戴二氏症候群(Shwachman-Diamondsyndrome)。地中海貧血和鐮狀細胞病(SickleCelldisease)屬於遺傳性溶血性貧血群體，其代表了世界上最常見的遺傳性疾病，從而是幹細胞基因治療的重要候選對象(PersonsandTisdale，2004)。在臨床情況下使用經遺傳修飾的間充質幹細胞的良好實例是對系帶骨病(bridledbonedisease)成骨不全中的遺傳突變的矯治。成骨不全因編碼I型膠原的基因C0LIA1或C0LIA2中的突變而引起骨質脆弱。Chamberlain等人從成骨不全患者的骨中獲得間充質幹細胞(MSC)並且鑑定了C0LIA1基因中的點突變(Chamberlain等人，2004)。已用腺伴隨病毒成功地感染了MSC以靶向並且使突變的C0LIA1基因失活。然後將經矯治的MSC移植入免疫缺陷型小鼠，受損細胞顯示提高的穩定性和膠原加工。實施例實施例1從患者或供體的骨髓和其他來源分離多能成體幹細胞，利用體外貼壁生長來測定細胞活性和生物學功能。在該體外階段，貼壁生長的細胞不表達"幹細胞標記"CD34，從而在體外培養期間被認為是0034_陰性的。在該階段，利用病毒或非病毒技術瞬時或穩定地轉染0034_陰性、貼壁生長的幹細胞，並在體內應用之前進行體外選擇性擴增。為了產生轉基因CD34-陰性祖細胞，將2個啟動子用於治療性基因的選擇和器官/靶特異性可誘導性。基於其轉染和整合(如果期望的話)(與粘附選擇性組合)來選擇基因轉移系統。如本實施例，tie2-啟動子增強子驅動只在內皮分化(其在腫瘤新血管生成期間發生)的背景中表達的HSV-TK基因。當循環內源性幹細胞以及全身性施用的幹細胞被生理性募集至腫瘤生長部位參與腫瘤新血管生成(無論其是原發性腫瘤部位還是轉移灶部位)時，幹細胞分化成腫瘤內皮細胞。在該器官特異性分化過程中，幹細胞表達通過血管生成相關tie2激活來驅動的HSV-TK基因。現在可對患者施用前體藥物更昔洛韋@,該前體藥物在腫瘤血管生成部位被HSV-TK轉化成細胞毒性物質。該方法在乳腺癌、轉移性結腸直腸癌、胰腺癌和膠質母細胞瘤的臨床前模型中顯示是成功的。預期該方法可應用於依賴於腫瘤新血管生成的任何(惡性)瘤。該方法的目的是破壞腫瘤血管生成。實施例2如實施例1中一樣，但本實施例不表達HSV-TK，而是表達凝血物質(clottingsubstance)作為細胞毒性蛋白。實施例3血管生成也是組織改建和傷口癒合的關鍵生物學過程。其不僅用於皮膚或黏膜的的損傷而且還用於其他組織，如胰腺中產生胰島素的P細胞的缺乏(其導致胰島素依賴型糖尿病(IDDM))。轉基因CD34-陰性祖細胞的全身性施用還可在胰腺中誘導靜息的胰島祖細胞的活化，從而補充內分泌胰腺，矯治ID匿患者的高血糖狀態。tie-2增強子啟動子激活血管活性物質如VEGF的基因，從而促進組織改建和傷口癒合。實施例4如實施例3中一樣，但如果內源性再生不再充足，則與同種異體胰島細胞的移植妙A￡口口。實施例5如實施例1中一樣，但轉基因細胞具有增強的至腫瘤生長、組織改建或傷口癒合的部位的歸巢能力(利用趨化因子生物學)。使用GPI-粘蛋白-趨化因子對CD34-陰性、貼壁生長的幹細胞進行工程改造。此類試劑將使得能夠選擇性表達與獲自CX3CL1或CXC16的融合至GPI錨的粘蛋白-結構域連接的特定趨化因子。此類趨化因子-粘蛋白試劑的表達將募集表達趨化因子受體的互補白細胞。例如，在腫瘤治療背景中處於tie2啟動子增強子控制之下的CXCL10-粘蛋白-GPI的表達將促進效應T細胞募集至腫瘤環境。該試劑將用作腫瘤免疫療法的佐劑。相同的方法還可用於組織改建以促進選擇的白細胞群體的平行募集。實施例6如實施例1中一樣，但經遺傳工程改造的CD34-陰性幹細胞在同種異體骨髓/幹細胞移植後可在例如自身免疫性障礙如慢性炎性腸病或移植物抗宿主病中調節炎性環境。這可通過抗炎物質如白細胞介素(IL-10)的位點特異性表達來促進。實施例7如實施例1中一樣，但使用普通病毒抗原(例如其在腫瘤生長的部位誘導內部加強免疫，例如麻疹或禽痘)的位點特異性表達。實施例8如在實施例1中一樣，但治療性基因的激活被早期發育階段的基因(例如Noggin)抑制，其最終在腫瘤或組織改建/再生部位的成熟組織中在轉基因祖細胞的分化過程中被下調。第II部分雄柳嫌鍵腫瘤血管發生代表了癌症治療劑的選擇性遞送的很有前景的耙。開發骨髓來源的間充質幹細胞以將外源基因選擇性靶向腫瘤血管生成環境。此類實驗的結果顯示，外源加入的MSC歸巢至它們在其中經歷分化的腫瘤。基因例如RFP報告基因以及自殺基因HSV-tk在Tie2啟動子/增強子的控制之下在分化期間選擇性表達。前體藥物更昔洛韋⑧與tk表達的協同施用有效地靶向腫瘤並且導致對腫瘤生長的抑制。麵國扁,Dr.ChristophKlein使用之前建立的鼠乳腺癌模型研究經工程改造的MSC在腫瘤血管生成中的用途。該模型可廣泛用於人乳腺癌。在該模型中，將攜帶處於匪TV啟動子的轉錄控制之下的激活的大鼠c-neu癌基因的轉基因小鼠與BALB/c小鼠回交，目的是產生用於癌症治療的可廣泛應用的模型。表達非轉化大鼠原癌基因的雌性HER-2/neu(neu-N)轉基因小鼠在5至6月齡時開始產生自發性局灶性乳腺癌(spontaneousfocalmammaryadeno-carcinomas)。此類腫瘤的發生和組織學與在乳腺癌患者中觀察到的相似。在腫瘤血管生成的背景中處於內皮特異性啟動子控制之下的RFP和GFP基因在imMSC中的表達為了評估在腫瘤血管生成的背景中對組織特異性表達的基因在imMSC中的表達的控制，以及通過顯微鏡追蹤imMSC在更長時期內的分布，已將紅色和綠色螢光蛋白(RFP，GFP)基因克隆入經修飾的表達載體以進行體內檢測。小鼠已知表達非轉化大鼠原癌基因的雌性HER-2/neu(neu-N)轉基因小鼠在5至6月齡時發生自發性局灶性乳腺癌。按照AgreementtotheEuropeanUnionGuidelines維持BALB-neuT轉基因小鼠。篩選半合子(neuT+/neuT-)小鼠。每周檢查Balb-neuT雌性小鼠的乳腺2次，並且測量出現的腫瘤。在手術切除原發性腫瘤後，將經遺傳修飾的細胞注射入乳腺癌模型小鼠。當殘餘的腫瘤長大時，外源加入的imMSC提供用於新血管形成的前體細胞。發現Tie-2-RFP(內皮特異性啟動子驅動紅色螢光蛋白)穩定轉染的imMSC易於歸巢至腫瘤，分化成內皮細胞，並且表達RFP報告基因(圖5)。在此類實驗中，評估間充質細胞至Balb-neuT小鼠的原發性乳房腫瘤內的整合。在應用3次RFP轉染後，可在所有切片的血管樣區域中檢測到表達RFP的細胞。該結果顯示，細胞歸巢至新血管形成的部位並且通過活化的Tie2啟動子/增強子表達標記基因。通過靶向內皮中的自殺基因來抑制腫瘤生長然後改變實驗方案以評估自殺基因HSV-tk的作用。與前體藥物更昔洛韋@(GCV)組合的tk基因產物產生了影響複製性細胞的有效毒素。用攜帶由血管內皮Tie2啟動子/增強子驅動的單純皰疹病毒-胸苷激酶(tk)基因的質粒穩定地轉染ImMSC。為此目的，再次使用乳腺癌血管生成的鼠模型來在抗血管生成治療中評估經工程改造的MSC。方法I.在18或22周齡時在腫瘤生長指數期進行的經工程改造的MSC的注射和更昔洛韋簡治療Balb-neuTtrsg的治療在第0天(第22周)開始用0.2ml細胞(500，000個細胞)和0.2mlPBS(作為對照)注射小鼠。在第5至8天，以30g/gBW的日劑量(例如對於21gBW的小鼠使用100iU)施用更昔洛韋③。在第9天後，重複小鼠的治療循環直至解剖。在治療期間，記錄腫瘤進展、體重(在各治療循環的第0和6天進行測量)和行為。為了獲得關於用Tie2-Tk-as-轉染的細胞和GCV進行治療的效果的總體印象(分別與兩個對照組相比較)，在治療過程中記錄宏觀(macroscopic)體重值直至解剖。測量時間點是各治療循環的第0天和第5天以及解剖當天。實驗包括1個治療組和2個對照組小鼠，並且始於2個不同的時間點，18周齡和22周齡。表2.解剖後治療組的數據，包括體重、絕對和相對腫瘤負荷。方法II.在手術切除後在腫瘤再牛的背景中對治療的評估在手術切除腫瘤後的患者中，在手術中遺漏的殘餘腫瘤通常會生長，從而導致癌症的復發。為了檢測經工程改造的MSC/tk療法在該背景中的功效，在18周齡時切除Balb/cneu-N轉基因小鼠的乳腺組織，從而導致原發性腫瘤的延遲發作。在手術後，用如上所述的MSC-tk和GCV方案治療小鼠。治療導致腫瘤生長在被治療的小鼠中的顯著減小(圖8)。胰腺腫瘤模型然後在C57B1/6小鼠中建立原位胰腺癌模型以評估基於MSC的療法在不同腫瘤系統中的功效。所述系統之前由ChristianeB進s禾口ClaudiusCo腦d建立(SurgeryD印artment，LMU)。在該模型中，將與C57B1/6小鼠同基因型的Panc02胰腺癌細胞被膜下(subc即sularly)注射入正好位於脾臟下方的胰腺區域以建立原發性胰腺腫瘤。將具有處於CMV啟動子控制之下的GFP以及處於Tie2啟動子/增強子的控制之下的RFP和tk的構建體導入從C57B1/6小鼠分離的MSC。通過i.v.注射全身性施用轉染的幹細胞。在預實驗中，將經工程改造以組成型表達GFP(處於CMV啟動子的控制之下)的MSC注射入具有正在生長的腫瘤的小鼠中。發現所述細胞有效地歸巢至腫瘤(圖9)。在平行實驗中，用經Tie2-RFP工程改造的MSC注射具有正在生長的腫瘤的小鼠。5天後，殺死動物，就RFP的表達檢查腫瘤。結果顯示，RFP在腫瘤背景中強烈上調(圖9)。在其他器官(脾、淋巴結和胸腺)中未檢測到RFP。參考文獻Aiuti，A，Slavin，S，Aker，M，Ficara，F，Deola，S，Mortellaro，A，Morecki，S，Andolfi，G，Tabucchi，A，Carlucci，F，Marinello，E，Cattaneo，F，Vai，S，Servida，P，Miniero，R，Roncarolo，MG，Bordignon，C(2002)CorrectionofADA-SCIDbystemcellgenetherapycombinedwithnonmyeloablativeconditioning.Science296:2410—2413.Aluigi，MG，Angelini，C，Falugi，C，Fossa，R，Genever，P，Gallus，L，Layer,PG，Prestipino，G，Rakonczay，Z，Sgro，M，Thielecke，H，Trombino，S(2005)Interac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尿病的前驅糖尿病受試者。58.權利要求54的方法，其中所述受試者是糖尿病受試者。59.權利要求58的方法，其中所述糖尿病受試者患有I型糖尿病。60.權利要求58的方法，其中所述糖尿病受試者患有II型糖尿病。61.權利要求54的方法，其中所述啟動子/增強子組合是Tie2啟動子/增強子，並且增進內皮細胞生長的蛋白質是與血管生成相關的血管內皮生長因子(VEGF)。62.權利要求54的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是同種異體的。63.權利要求54的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是自體的。64.權利要求54的方法，其中所述治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞是大約lx103至大約lx107個細胞/kg體重。65.用於治療患有肌營養不良的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼在受試者的肌肉細胞中不存在的或表達不足的或其在受試者的肌肉細胞中過表達是期望的蛋白質的區域，該區域與(ii)肌肉特異性啟動子或肌肉特異性啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。66.權利要求65的方法，其中所述受試者是人。67.權利要求66的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是同種異體的。68.權利要求66的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是自體的。69.權利要求66的方法，其中所述受試者患有杜興肌營養不良或貝克肌營養不良。70.權利要求69的方法，其中所述肌肉特異性啟動子/增強子組合是MyoD啟動子/增強子，並且在所述受試者的肌肉細胞中不存在的蛋白質是肌養蛋白。71.權利要求70的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是同種異體的。72.權利要求70的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是自體的。73.權利要求66的方法，其中所述治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞是大約lx103至大約lx107個細胞/kg體重。74.用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷手術的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。75.權利要求74的方法，其中所述受試者是人。76.權利要求75的方法，其中所述手術是腹部手術、胸部手術、神經外科手術或整形手術。77.權利要求75的方法，其中所述手術是腹腔鏡手術。78.權利要求75的方法，其中所述手術是開放手術。79.權利要求75的方法，其中所述啟動子/增強子組合是Tie2啟動子/增強子，並且增進內皮細胞生長的蛋白質是與血管生成相關的血管內皮生長因子(VEGF)。80.權利要求75的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是同種異體的。81.權利要求75的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是自體的。82.權利要求75的方法，其中所述治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞是大約lx103至大約lx107個細胞/kg體重。83.用於改善將要經歷、正在經歷或已經經歷身體創傷的受試者的微循環和/或急性傷口癒合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導入治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞，其中(a)每一個經遺傳修飾的CD34—幹細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進內皮細胞生長的蛋白質的區域，該區域與(ii)內皮特異性啟動子或啟動子/增強子組合有效連接，和(b)在導入所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞之前、同時或之後未進行骨髓清除。84.權利要求83的方法，其中所述受試者是人。85.權利要求84的方法，其中所述身體創傷是分娩。86.權利要求84的方法，其中所述身體創傷是由劇烈動作引起的皮肉傷，並且在身體創傷後立即向所述受試者的血流中導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞。87.權利要求84的方法，其中所述身體創傷是燒傷，並且在身體創傷後立即向所述受試者的血流中導入經遺傳修飾的CD34—幹細胞。88.權利要求83的方法，其中所述啟動子/增強子組合是Tie2啟動子/增強子，並且所述增進內皮細胞生長的蛋白質是與血管生成相關的血管內皮生長因子(VEGF)。89.權利要求84的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是同種異體的。90.權利要求84的方法，其中所述經遺傳修飾的CD34—幹細胞對於所述受試者來說是自體的。91.權利要求84的方法，其中所述治療有效數量的經遺傳修飾的CD34—幹細胞是大約lx103至大約lx107個細胞/kg體重。全文摘要本發明提供了用於治療許多狀況的新的基於幹細胞的方法。此類方法利用CD34幹細胞，並且具有許多有利方面，因為它們不需要在待治療的受試者中進行骨髓清除。取決於待治療的障礙，可對本方法中所使用的CD34幹細胞進行或不進行遺傳修飾。文檔編號A61K45/00GK101778934SQ200880100100公開日2010年7月14日申請日期2008年5月20日優先權日2007年5月24日發明者M·拉吉,M·斯坦格,P·尼爾森,R·胡斯申請人:埃普塞斯有限責任兩合公司