多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物及其製備方法
2023-05-30 11:52:26
多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物及其製備方法
【專利摘要】多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物及其製備方法，將模板分子、功能單體混合溶解在致孔劑中，超聲混勻，形成模板分子－功能單體複合物，再加入有效量的引發劑、交聯劑，超聲通氮氣後密封；在氮氣保護下，分子印跡聚合物採用熱引發，置于振蕩培養箱中進行聚合反應；聚合反應結束後，所得到的分子印跡聚合物用甲醇-冰醋酸進行洗脫，除去模板分子，再用甲醇洗至中性，然後真空乾燥，得到多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物。本發明所製備的沉澱分子印跡聚合物微球，具有單分散性好、粒徑均一、大小可控，製備簡單、產率高等優點。減少了結合位點和印跡空穴的破壞，保證了聚合物對模板分子的高親和力和高選擇性。
【專利說明】多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程【技術領域】，具體涉及一種分子印跡聚合物的製備方法，尤其涉及一種多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物及其製備方法。
【背景技術】
[0002]三七為五加科植物三七(Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen)的乾燥根及根莖，具有增強機體功能、增加冠脈血流量、擴張血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、降低血粘度等作用，是我國傳統的珍貴藥材之一。三七的主要有效成分是三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，其中人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量較高。自古因其功效卓著頗受眾多醫家推崇，被譽為金瘡杖瘡之聖藥，更是馳名中外「雲南白藥」的主要組成部分。自20世紀70年代以來，人們對三七單味藥及其複方的化學成分、藥理作用進行了大量的研究工作，然而由於三七所含成分複雜，且含量低，傳統的分離方法如吸附樹脂、活性炭等純化三七活性皂苷，步驟繁多，操作繁瑣，選擇性差、分離效率低且重現性差，產品質量難以準確控制，嚴重影響了臨床的用藥安全，也是目前制約三七注射劑發展的瓶頸性問題。因此迫切需要一種高效分離三七活性皂苷的新方法。
[0003]分子印跡技術是模仿「抗原-抗體」識別原理發展的一種特異性識別目標分子的技術。它以欲識別的分子為模板，通過共價或非共價鍵的方式與特定的功能單體用交聯劑結合生成聚合物，然後用特定的溶劑將模板分子洗脫，得到具有特異性識別位點的分子印跡聚合物(molecular imprinted polymers, MIPs),從而對模板分子及其結構類似物表現出高度的特異性識別性能。由於分子印跡技術操作簡單，對目標分子的特異性識別能力強，近年來在越來越多的領域廣 泛應用，並取得良好效果。應用多模板分子印跡聚合物來分離純化三七活性皂苷的研究，尚未見文獻報導。
【發明內容】
[0004]解決的技術問題:本發明提供一種多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物及其製備方法，從而克服現有分離純化技術的不足，使其能夠簡單、快速、特異性地吸附三七活性皂苷分子，實現對三七藥材提取物中化學成分的選擇性分離、高效富集。
[0005]技術方案:多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物，由以下步驟製得:
[0006]I)將模板分子、功能單體混合溶解在致孔劑中，超聲混勻，靜置2~4h，形成模板分子一功能單體複合物，再加入有效量的引發劑、交聯劑，超聲5~lOmin，通氮氣5~lOmin，密封；其中，模板分子與功能單體的摩爾比為1:2~1:6，功能單體與交聯劑的摩爾比為1:1~1:6 ;致孔劑的體積用量與模板分子的摩爾量之比為25~150ml/mmol ;引發劑的用量是模板分子、功能單體和交聯劑總質量的3%~5% ；
[0007]2)在氮氣保護下，分子印跡聚合物採用熱引發，置于振蕩培養箱中進行聚合反應，培養箱轉速為100r/min~300r/min，聚合溫度為50°C~70°C，聚合反應時間為20~36h ；
[0008]3)聚合反應結束後，所得到的分子印跡聚合物用甲醇-冰醋酸進行洗脫，除去模板分子，再用甲醇洗至中性，然後45°C真空乾燥12~24h，得到多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物。[0009]多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的製備方法，製備步驟為:
[0010]I)將模板分子、功能單體混合溶解在致孔劑中，超聲混勻，靜置2~4h，形成模板分子一功能單體複合物，再加入有效量的引發劑、交聯劑，超聲5~lOmin，通氮氣5~lOmin，密封；其中，模板分子與功能單體的摩爾比為1:2~1:6，功能單體與交聯劑的摩爾比為1:1~1:6 ;致孔劑的體積用量與模板分子的摩爾量之比為25~150ml/mmol ;引發劑的用量是模板分子、功能單體和交聯劑總質量的3%~5% ；
[0011]2)在氮氣保護下，分子印跡聚合物採用熱引發，置于振蕩培養箱中進行聚合反應，培養箱轉速為100r/min~300r/min，聚合溫度為50°C~70°C，聚合反應時間為20~36h ；
[0012]3)聚合反應結束後，所得到的分子印跡聚合物用甲醇-冰醋酸進行洗脫，除去模板分子，再用甲醇洗至中性，然後45°C真空乾燥12~24h，得到多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物。
[0013]所述的模板分子為人參皂苷Rb1,人參皂苷Rg1和三七皂苷R1,三者摩爾比為44:43:13。
[0014]所述的功能單體為丙烯醯胺、甲基丙烯酸、烯丙基脲或4-乙烯基吡啶。
[0015]所述的引發劑為偶氮二異丁腈或過氧化苯甲醯。
[0016]所述的致孔劑為四氫呋喃、N，N-二甲基甲醯胺、乙腈、正丁醇、甲醇或乙醇。
[0017]所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
[0018]所述甲醇-冰醋酸溶液的體積比為甲醇:冰醋酸=9:1。
[0019]有益效果:其一:三七藥材中存在的化合物結構非常相似，且含量低、幹擾大，非選擇性的分析材料很難對其進行分離純化。本發明合成的多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物為藥材中活性成分的高親和力、高選擇性分離提供了可能。
[0020]其二:本發明所製備的沉澱分子印跡聚合物微球，與傳統的本體分子印記聚合物相比較，具有單分散性好、粒徑均一、大小可控，製備簡單、產率高等優點。並且不需要碾磨，過篩等複雜的後處理過程，減少了結合位點和印跡空穴的破壞，保證了聚合物對模板分子的高親和力和高選擇性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1是實施例3合成的多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的透射電鏡圖，其中.MIP,.NIP ；
[0022]圖2是實施例3合成的多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的動態吸附曲線，其中 MIP，.NIP ；
[0023]圖3是實施例3合成的多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的靜態吸附曲線，其中 MIP，.NIP。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0025]丙烯醯胺(AM)[0026]烯丙基脲(AU)
[0027]甲基丙烯酸(MAA)
[0028]4-乙烯基吡啶(4-VP)
[0029]三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)
[0030]乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)
[0031]四氫呋喃(THF)
[0032]N, N- 二甲基甲醯胺(DMF)
[0033]偶氮二異丁腈(AIBN)
[0034]實施例1:
[0035]將348.5mg人參皂苷Rb1,人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物(三者摩爾比為44:43:13)和1.0Ommol功能單體MAA溶於25mL DMF溶劑中，超聲IOmin溶解，預聚合2~4h。再加入6.0Ommol交聯劑EGDMA和48.72mg引發劑AIBN，超聲IOmin溶解。混合後的溶液通氮氣IOmin,恆溫搖床升溫至60°C, 300rpm聚合24h。
[0036]離心收集並以甲醇-冰醋酸進行洗脫(v/v，9:l)，除去模板分子，直到紫外分光光度儀在204nm處檢測不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然後45°C真空乾燥12h，即得多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物(MIP-1)。
[0037]除合成過程中不添加模板分子三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1以外，其餘步驟均與印跡聚合物製備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-1)。
[0038]實施例2:
[0039]將348.5mg人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物(三者摩爾比為44:43:13)和1.50mmol功能單體AU溶於30mL THF溶劑中，超聲IOmin溶解，預聚合2~4h。再加入6.0Ommol交聯劑TRM和75.88mg引發劑AIBN，超聲5min溶解。混合後的溶液通氮氣1Omin,恆溫搖床升溫至50°C, 200rpm聚合36h。
[0040]離心收集並以甲醇-冰醋酸進行洗脫(v/v，9:l)，除去模板分子，直到紫外分光光度儀在204nm處檢測不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然後45°C真空乾燥24h，即得多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物(MIP-2)。
[0041]除合成過程中不添加模板分子三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb以外，其餘步驟均與印跡聚合物製備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-2)。.[0042]實施例3:
[0043]將348.5mg人參皂苷Rb1,人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物(三者摩爾比為44:43:13)和2.0Ommol功能單體AM溶於40mT,乙醇溶劑中，超聲IOmin溶解，預聚合2~4h。再加入10.0Ommol交聯劑EGDMA和74.20mg引發劑AIBN，10n溶解。混合後的溶液通氮氣IOmin,恆溫搖床升溫至60°C, 200rpm聚合24h。
[0044]離心收集並以甲醇-冰醋酸進行洗脫(v/v，9:l)，除去模板分子，直到紫外分光光度儀在204nm處檢測不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然後45°C真空乾燥24h，即得多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物(MIP-3)。
[0045]除合成過程中不添加模板分子三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1以外，其餘步驟均與印跡聚合物製備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-3)。
[0046]實施例4:[0047]將348.5mg人參皂苷Rb1,人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物(三者摩爾比為44:43:13)和2.0Ommol功能單體4-VP溶於50mL乙醇溶劑中，超聲IOmin溶解，預聚合2~4h。再加入9.0Ommol交聯劑TRIM和180.2Img引發劑AIBN，超聲IOmin溶解。混合後的溶液通氮氣5min,恆溫搖床升溫至70°C, IOOrpm聚合36h。
[0048]離心收集並以甲醇-冰醋酸進行洗脫(v/v，9:l)，除去模板分子，直到紫外分光光度儀在204nm處檢測不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然後45°C真空乾燥12h，即得多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物(MIP-4)。
[0049]除合成過程中不添加模板分子三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1以外，其餘步驟均與印跡聚合物製備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-4)。
[0050]測試實施例:
[0051]取上述實施例3中合成的分子印跡聚合物及非印跡聚合物進行如下測試實驗。
[0052]測試實施例1.透射電鏡
[0053]圖1是本發明合成的多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的透射電鏡圖，可見，製備的印跡聚合物微球粒度均勻，單分散性好。
[0054]測試實施例2.動態吸附試驗
[0055]精密稱取MIP與NIP (20.0mg)各5份，置於15mL三角瓶中，分別分散在5mL，
2.5mmol/L的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的乙醇混合溶液中，室溫振搖。分別在I，2，3，4和5h時取上清 液，0.22 μ m尼龍膜濾過，取續濾液稀釋定容，紫外-可見分光光度儀於204nm處測定吸附前後 樣品的濃度，根據式(I)計算出平衡吸附量Qe，平行操作三次。
?F(Co - Ce)
[0056]Qe= —-;—-'(I)
[0057]式中:(；和(；分別為模板分子的起始濃度和平衡濃度(mmol/L) ；V為吸附溶液的體積(mL) ;m為印記聚合物的質量(g)。
[0058]從圖2可以看出，隨著吸附時間的增加，印跡材料對印跡分子的吸附量不斷上升，4h後基本達到吸附平衡。實驗表明，印跡材料具有較快的吸附速率，而傳統的本體聚合製備的MIP吸附平衡時間一般為12~24h。其原因是本發明採用沉澱聚合合成的分子印跡聚合物單分散性好、粒徑均一、印跡位點分布均勻，而且避免了本體聚合研磨時印跡位點的破壞。
[0059]測試實施例3.靜態吸附試驗
[0060]精密稱取MIP與NIP (20.0mg)各5份，置於15mL三角瓶中，分別加入1.0mmol/L，
1.5mmol/L, 2.0mmol/L, 2.5mmol/L 和 3.0mmol/L 三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1 和人參皂苷 Rb1的乙醇混合溶液5mL，超聲分散，室溫振搖4h，取上清液，0.22 μ m尼龍膜濾過，取續濾液稀釋定容，紫外-可見分光光度儀於204nm處測定各樣品的濃度，根據式(I)計算出平衡吸附
量Qe，平行操作三次。
[0061]從圖3可以看出，MIP的最大吸附量遠大於NIP，表明MIP對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的吸附不同於物理吸附，而是一種有特異性識別位點的選擇性吸附，這種分子識別特性來自於該聚合物的結合基團與模板分子的功能基之間的氫鍵作用和空穴的幾何選擇性。[0062]上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人是能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所做的等效變換或修飾，都應`涵蓋在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物，其特徵在於由以下步驟製得: 1)將模板分子、功能單體混合溶解在致孔劑中，超聲混勻，靜置2~4h，形成模板分子一功能單體複合物，再加入有效量的引發劑、交聯劑，超聲5~10 min，通氮氣5~10min，密封；其中，模板分子與功能單體的摩爾比為1:2~1:6，功能單體與交聯劑的摩爾比為1:1~1:6 ;致孔劑的體積用量與模板分子的摩爾量之比為25~150 ml/mmol ;引發劑的用量是模板分子、功能單體和交聯劑總質量的3%~5% ； 2)在氮氣保護下，分子印跡聚合物採用熱引發，置于振蕩培養箱中進行聚合反應，培養箱轉速為100 r/min~300 r/min，聚合溫度為50°C~70 °C，聚合反應時間為20~36h ； 3)聚合反應結束後，所得到的分子印跡聚合物用甲醇-冰醋酸進行洗脫，除去模板分子，再用甲醇洗至中性，然後45°C真空乾燥12~24 h，得到多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物。
2.多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於製備步驟為: 1)將模板分子、功能單體混合溶解在致孔劑中，超聲混勻，靜置2~4h，形成模板分子一功能單體複合物，再加入有效量的引發劑、交聯劑，超聲5~10 min，通氮氣5~10min，密封；其中，模板分子與功能單體的摩爾比為1:2~1:6，功能單體與交聯劑的摩爾比為1:1~1:6 ;致孔劑的體積用量與模板分子的摩爾量之比為25~150 ml/mmol ;引發劑的用量是模板分子、功能單 體和交聯劑總質量的3%~5% ； 2)在氮氣保護下，分子印跡聚合物採用熱引發，置于振蕩培養箱中進行聚合反應，培養箱轉速為100 r/min~300 r/min，聚合溫度為50°C~70 °C，聚合反應時間為20~36h ； 3)聚合反應結束後，所得到的分子印跡聚合物用甲醇-冰醋酸進行洗脫，除去模板分子，再用甲醇洗至中性，然後45°C真空乾燥12~24 h，得到多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物。
3.根據權利要求2所述多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於:所述的模板分子為人參皂苷Rb1,人參皂苷Rg1和三七皂苷R1,三者摩爾比為44:43:13。
4.根據權利要求2所述多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於:所述的功能單體為丙烯醯胺、甲基丙烯酸、烯丙基脲或4-乙烯基吡啶。
5.根據權利要求2所述多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於:所述的引發劑為偶氮二異丁腈或過氧化苯甲醯。
6.根據權利要求2所述多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於:所述的致孔劑為四氫呋喃、N，N-二甲基甲醯胺、乙腈、正丁醇、甲醇或乙醇。
7.根據權利要求2所述多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於:所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
8.根據權利要求2所述多模板單分散三七活性皂苷分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於:所述甲醇-冰醋酸溶液的體積比為甲醇:冰醋酸=9:1。
【文檔編號】C08J9/28GK103570870SQ201310495697
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】陳立娜, 何宏亮, 高豔坤 申請人:南京醫科大學