使用超臨界流體的壓縮抗溶劑沉澱(pca)製備大豆異黃酮納米顆粒的方法
2023-05-30 11:52:21
專利名稱：使用超臨界流體的壓縮抗溶劑沉澱(pca)製備大豆異黃酮納米顆粒的方法
技術領域：
本發明涉及製備固體形式大豆異黃酮(在大豆或大豆產品中表徵的一個類黃酮亞類)的方法。具體而言，本發明涉及使用超臨界流體的壓縮抗溶劑沉澱(PCA)製備固體形式大豆異黃酮(例如染料木黃酮及其衍生物)的方法，用於產生具有改善的溶出度和生物利用度的大豆異黃酮納米尺寸的顆粒。本發明還涉及包含大豆異黃酮納米顆粒的用於口服施用或者用於霧化吸入的組合物。
背景技術：
口服途徑是最常用的藥物施用途徑。通過口服施用遞送的藥物常常是散劑、片劑或膠囊劑的形式，並且首先溶解於 沿胃腸道的胃腸液內，然後溶解的藥物穿過胃腸黏膜。然而，口服途徑不適用於許多藥物分子，因為由於它們的低水溶解度、差的胃腸黏膜通透性、首過代謝和胃腸環境中的不穩定性導致難以接受的低生物利用度。大豆異黃酮是具有與雌性激素(雌激素)相似的化學結構和生理功能的植物雌激素。因此，它們可以緩解雌激素缺乏疾病，尤其是更年期症狀，包括熱潮紅、骨質疏鬆症和心血管問題。目前，在大豆和大豆產品中已經表徵了 12種主要的異黃酮，包括染料木黃酮、大豆苷元和黃豆黃素(糖苷配基)，以及它們各自的丙二醯基、乙醯基和葡糖基形式(葡糖苷)(Apers等,2004 ；Rostagno等,2004)。雖然異黃酮(例如染料木黃酮)已經廣泛地用作保健品以緩解雌激素缺乏疾病，尤其是更年期症狀，但是可能它們差的水溶解度妨礙了其治療效果。為了改善它們的水溶解度，一些研究組已經嘗試在染料木黃酮和不同載體例如環糊精類(Lee 等,2007 ;Stancanelli 等，2007 ;Daruhazi 等，2008)和 PEG (Motlekar 等，2006)之間形成複合物。然而，這些方法具有局限性，例如高的殘留有機溶劑含量，藥物和載體的不穩定性以及載體材料的安全問題。因此，仍然需要可以產生具有改善的水溶解度和生物利用度的大豆異黃酮劑型的方法。又一種增加水溶性差的藥物的溶出度的方式是通過降低藥物粒度增加總的表面積來實現。為此目的已經應用了不同的技術，包括噴霧乾燥、冷凍乾燥、研磨、液體抗溶劑結晶和以超臨界流體沉澱。與其他技術相比，基於超臨界流體的技術吸引了極大的注意力，因為它們具有下列4個主要優勢:(I)受控的粒度和粒度分布，(2)低成本和環境友好特性，
(3)由於操作條件溫和(Tc = 31.10C, Pc = 7.38MPa)相對地沒有因機械或熱應力產生產物降解，(4)沒有因有機溶劑的存在而對終產物產生汙染。在產生精細顆粒的基於超臨界流體的方法當中，使用超臨界CO2的壓縮抗溶劑沉澱(PCA)吸引了極大的注意力。美國專利號 5，874, 029 (Subramaniam ;Bala 等，1999)、6，319, 521 (Randolph ；Theodore W.等，2001)、7，332，IlKGrothe ；ffilly等，2008)，公開了用於產生精細顆粒的PCA方法。然而，這些傳統方法均未實現顯著的粒度減小和證明被霧化形成精細顆粒的活性成分的溶出度和生物利用度改善。因此，需要提供優化的PCA方法以產生具有明顯的粒度減小和改善的溶出度/生物利用度的、適宜於口服和可吸入施用兩者的合乎需要的大豆異黃酮納米顆粒。
發明內容
本發明的第一方面是提供用於產生具有改善的溶出度和生物利用度的大豆異黃酮納米顆粒的方法。在本公開方法中，採用使用超臨界CO2的壓縮抗溶劑沉澱(PCA)來沉澱大豆異黃酮以減小粒度，從而改善其溶出度和口服生物利用度。本發明的方法可以改善大豆異黃酮亞類下任何預期物質的水溶解度，以產生更有效的藥品和保健品。本發明的第二方面是提供包含通過本公開方法製備的、具有改善的溶出度和生物利用度的大豆異黃酮納米顆粒的組合物。在本發明中，通過使用PCA過程減小粒度來增加大豆異黃酮(例如染料木黃酮)的溶出度和口服生物利用度。研究了可能影響大豆異黃酮的粒度和粒度分布的過程變量，例如沉澱壓力、藥物溶液濃度和超臨界CO2與預期物質溶液的進料速率比。通過粉末X-射線衍射(XRD)和差示掃描量熱法(DSC)表徵PCA過程之前和之後處於固體狀態的顆粒的物理化學特性。體外溶出度實驗和在大鼠中開展口服生物利用度研究以比較加工的和未加工的染料木黃酮顆粒的吸收。在本發明的第一方面中，所述方法包括:向在其中將發生大豆異黃酮沉澱的沉澱室提供超臨界流體；將未處理的大豆異黃酮溶解於有機溶劑中以形成大豆異黃酮溶液；預先設置沉澱室條件，例如壓力、溫度和超臨界流體，大豆異黃酮溶液的進料速率比；在達到預先設定條件之後將大豆異黃酮溶液經過同軸噴嘴引入到沉澱室內；通過將超臨界流體與大豆異黃酮溶液在沉澱室內混合導致過飽和急劇升高，形成包含大豆異黃酮的精細固體顆粒；通過在停止溶液泵送之後將過多的超臨界流體泵入到室內，從所得到的顆粒去除有機溶劑殘留物；在沉澱室中逐步降壓至大氣壓之後，從位於沉澱室底部的金屬過濾器收集包含大豆異黃酮的精細固體顆粒；通過低壓力旋風分離器進一步去除有機溶劑。過量的超臨界流體變成蒸汽，該 蒸汽經由低壓力旋風分離器處的排氣口從沉澱室去除。在示例性的實施方案中，在本發明中使用的大豆異黃酮是大豆糖苷配基異黃酮，包括染料木黃酮、大豆苷元和黃豆黃素。其它大豆異黃酮例如大豆葡糖苷異黃酮，包括大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、乙醯基大豆苷、乙醯基黃豆黃苷、乙醯基染料木苷、丙二醯基大豆苷、丙二醯基黃豆黃苷和丙二醯基染料木苷也可以在本發明中使用以根據本發明的方法沉澱形成顆粒。在本發明的第二方面中，還提供包含通過本發明方法製備的大豆異黃酮納米顆粒的組合物。與未處理的大豆異黃酮相比，大豆異黃酮納米顆粒具有至少2倍的溶出度增加和大約2.6倍的生物利用度增加。通過使用最佳操作條件，例如最佳壓力、溫度和超臨界流體與包含大豆異黃酮的溶液的進料速率比，顆粒寬度可以減小多達約50-200倍。染料木黃酮顆粒的平均寬度小於I μ m。更優選地，染料木黃酮顆粒的平均寬度小於260nm。
圖1是PCA過程的系統示意圖。
圖2顯示不同沉澱壓力對以4mg/mL的初始染料木黃酮濃度的染料木黃酮顆粒形成在顆粒形態和粒度分布方面的影響:從(a) 100巴(運行4)，(b) 85巴(運行5)和(c) 70巴(運行6)得到的染料木黃酮顆粒的SEM圖像以及以(d)寬度和(e)長度計的粒度分布。圖3顯示不同沉澱壓力對以0.4mg/mL的初始染料木黃酮濃度的染料木黃酮顆粒形成在顆粒形態和粒度分布方面的影響:從(a) 120巴(運行I)，(b) 100巴(運行2)和(c) 70巴(運行8)得到的染料木黃酮顆粒的SEM圖像以及以(d)寬度和(e)長度計的粒度分布。圖4顯示不同的初始染料木黃酮濃度對在100巴沉澱壓力下的染料木黃酮顆粒形成在顆粒形態和粒度分布方面的影響:從(a)4mg/mL(運行4), (b)2mg/mL(運行3)和(c)0.4mg/mL(運行2)得到的染料木黃酮顆粒的SEM圖像以及以(d)寬度和(e)長度計的粒度分布。圖5顯示不同的初始染料木黃酮濃度對在70巴沉澱壓力下的染料木黃酮顆粒形成在顆粒形態和粒度分布方面的影響:從(a)4mg/mL(運行6), (b)2mg/mL(運行7)和(c)0.4mg/mL(運行8)得到的染料木黃酮顆粒的SEM圖像以及以(d)寬度和(e)長度計的粒度分布。圖6顯示不同的進料速率比對在70巴沉澱壓力下的染料木黃酮顆粒形成在顆粒形態和粒度分布方面的影響:從(a) R= 30(運行9)，(b) R = 60 (運行8)和(c) R = 90 (運行10)得到的染料木黃酮顆粒的SEM圖像以及以(d)寬度和(e)長度計的粒度分布。
圖7是未處理的染料木黃酮相對於PCA加工的染料木黃酮的DSC熱分析圖。圖8是未處理的染料木黃酮相對於PCA加工的染料木黃酮的粉末X-射線衍射圖。圖9是未處理的染料木黃酮相對於在70巴(運行6)和100巴(運行4)的不同壓力下所得PCA加工的染料木黃酮的溶出度曲線。圖10是未處理的染料木黃酮相對於在70巴和100巴的不同壓力下所得PCA加工的染料木黃酮的血漿濃度-時間曲線，其從3個組中每一組的I只代表性的大鼠得到，並且AUCQ — 24h(右上圖)從每一組的所有4隻大鼠得到*，P < 0.05。
具體實施例方式定義如本文所使用，術語「壓縮抗溶劑」指超臨界的或者接近超臨界的C02。如本文所使用，術語「大豆異黃酮」指大豆糖苷配基異黃酮，例如染料木黃酮、大豆苷元和黃豆黃素等，或者它們各自的丙二醯基、乙醯基和葡糖基形式/大豆葡糖苷異黃酮，例如大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、乙醯基大豆苷、乙醯基黃豆黃苷、乙醯基染料木苷、丙二醯基大豆苷、丙二醯基黃豆黃苷和丙二醯基染料木苷等。如本文所使用，術語「納米顆粒」意思是指具有小於Iym的平均寬度的顆粒。更優選地，顆粒的平均寬度小於200nm。如本文所使用，術語「寬度」指如從掃描電子顯微鏡(SEM)圖像所推導出的顆粒的最短長度。如本文所使用，染料木黃酮濃度意思是指在室溫和大氣壓下溶解在有機溶劑例如丙酮中的染料木黃酮的濃度。在室溫和大氣壓下溶解在丙酮中的染料木黃酮濃度飽和點是4mg/mT,n如本文所使用，「壓力」或「沉澱壓力」指從亞臨界相至超臨界相的壓力，它們分別低於或高於73.8巴，或者如任何具體實施方案中所定義。在本發明的實驗設置中，可以達到的亞臨界相壓力的下限是大約60巴，而超臨界相壓力的上限是大約350巴。本發明描述使用壓縮抗溶劑沉澱(PCA)過程產生具有改善的溶出度和生物利用度的大豆異黃酮納米顆粒的方法。評價了多種過程參數-沉澱壓力、初始藥物溶液濃度和CO2/藥物溶液進料速率比-對顆粒形成的影響。在這些參數當中，壓力是極大影響粒度和形態學的最重要參數。在優化的操作條件下，大豆異黃酮納米顆粒寬度從大約10-50 μ m減小至大約200-250nm (尺寸減小大約50至200倍)。已經通過表徵技術，包括掃描電子顯微鏡(SEM)、差示掃描量熱法(DSC)、X-射線衍射(XRD)和溶出度研究分析了所得到的納米顆粒的物理化學特性。在大鼠中開展的24小時藥物代謝動力學研究顯示，納米尺寸的染料木黃酮的生物利用度比未處理的大豆異黃酮(粗大豆異黃酮)高大約2.6倍。實施例通過參考下列實施例更加具體地解釋本發明。給出這些實施例僅為了更好地理解本發明，並且無論如何不旨在限制本發明的範圍。實施例1PCA過程的系統設置示於圖1中(Lin等，2007)。CO2槽105與冷卻器106相連以在將CO2在加熱器內升至所需溫度之前將其維持在液相中。冷卻器106可以是-4°c的水/乙二醇循環浴。流量計107用於監測CO2流率。高性能泵108用於遞送流體經過加熱器109進入到沉澱室101內，沉澱室101周圍有加熱套110並且整合有頂裝的同軸噴嘴123。在同軸噴嘴123的另一端與溶液槽1 21和溶液泵122相連用於將最佳濃度的大豆異黃酮，例如染料木黃酮溶解於有機溶劑中並且將大豆異黃酮溶液泵入到沉澱室101內。在示例性的實施方案中，沉澱室101的容積為大約100mL。具有5 μ m孔徑大小的金屬過濾器102位於沉澱室101的底部，用於收集在PCA過程之後形成的顆粒。背壓調節器111與沉澱室101的排出口和較低壓力旋風分離器104相連，其中較低壓力旋風分離器104從沉澱室101收集剩餘的有機溶劑，而來自沉澱室101的過量CO2經過與低壓力旋風分離器104相連的排氣口 131排出。通過控制整個PCA系統的計算機化系統控制沉澱壓力、溫度和CO2流率。在示例性實施方案中，首先從包括CO2槽、冷卻器、流量計、高性能泵和加熱器的CO2組件製備超臨界C02。然後將超臨界CO2流從CO2組件泵入到沉澱室內作為壓縮抗溶劑，用於發生預期物質的沉澱。待沉澱的預期物質，即染料木黃酮首先以0.4-4mg/mL範圍的最佳濃度溶解於有機溶劑，例如丙酮中。一旦達到預設條件，例如沉澱壓力、溫度和30-90g/mL範圍的超臨界的CO2與染料木黃酮溶液的進料速率比，將溶解於丙酮中的染料木黃酮溶液經同軸噴嘴引入到沉澱室中。當溶解了染料木黃酮的丙酮溶液在沉澱室內與超臨界CO2在從311:至601:，優選40°C的最佳溫度，和從亞臨界壓力至超臨界壓力，即60至350巴，更優選70至120巴的沉澱壓力下混合時，在液體混合物內發生過飽和的急劇升高並且導致形成包含染料木黃酮的精細固體顆粒。在停止泵送溶液後通過再泵送超臨界C0230分鐘將顆粒充分洗滌以去除溶劑殘留物。然後在將沉澱室逐漸降壓至大氣壓之後從位於沉澱室底部處的金屬過濾器收集顆粒。最後，從低壓力旋風分離器底部再次收集有機溶劑，而蒸汽排出系統。
實施例2為了研究壓力應用了 70至120巴之間不同的壓力；0.4mg/mL至4mg/mL的染料木黃酮溶解於丙酮中；至沉澱室的總進料中CO2的摩爾分數維持在99.0mol%。圖2顯示當染料木黃酮濃度設置在4mg/mL時的結果。在100和85巴的較高壓力下產生的幾乎所有顆粒是長矩形棒狀的(分別是圖2a和2b)，而在70巴下得到短棒狀顆粒(圖2c)。從來自每次運行的至少300個顆粒測量顆粒的寬度和長度並且它們的平均值總結於表I中。在85巴和100巴下矩形棒的長寬比(L/W)在8.3-8.5之間，但是在70巴下的該長寬比為3.1(表I)。顆粒的寬度和長度分布分別示於圖2d和2e中。區別最大的特徵是在70巴下有大量的局部成團的短棒狀顆粒，這可能是導致在該低壓力下L/W比率減小的主要原因。當染料木黃酮濃度設置為0.4mg/mL時觀察到相似的現象，除了在0.4mg/mL下在較高壓力例如100和120巴下顆粒大得多之外(圖3a、3b和3c)。寬度和長度分布分別示於圖3d和3e中。同樣地，在70巴下製備產生大量的局部成團的短棒狀顆粒。表權利要求
1.基於壓縮抗溶劑沉澱製備具有改善的溶出度和生物利用度的大豆異黃酮納米顆粒的方法，所述方法包括: 向沉澱室提供超臨界流體作為壓縮抗溶劑，在所述沉澱室內發生大豆異黃酮沉澱形成納米顆粒； 將未處理的大豆異黃酮溶解於有機溶劑中以形成大豆異黃酮溶液； 預先設置所述沉澱室達到最佳條件； 在所述沉澱室中達到所述最佳條件之後，將所述大豆異黃酮溶液經過同軸噴嘴引入到所述沉澱室內； 將所述超臨界流體溶解到液滴中，導致液體溶劑溶解力降低，引起所述沉澱室內的所述超臨界流體與所述大豆異黃酮溶液的液體混合物內過飽和的急劇升高並且在所述沉澱室底部處的金屬過濾器上形成多個顆粒； 向沉澱室中提供過量的超臨界流體以從所述多個顆粒中去除剩餘的有機殘留物； 在所述沉澱室中逐步降壓至大氣壓之後從所述沉澱室底部處的所述金屬過濾器收集所述顆粒； 從低壓力旋風分離器再次收集所述有 機溶劑，而所述過量的超臨界流體在所述低壓力旋風分離器中變成蒸汽，並通過與所述低壓力旋風分離器相連的排氣口排出。
2.權利要求1的方法，其中所述大豆異黃酮是選自染料木黃酮、大豆苷元、黃豆黃素、大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、乙醯基大豆苷、乙醯基黃豆黃苷、乙醯基染料木苷、丙二醯基大豆苷、丙二醯基黃豆黃苷和丙二醯基染料木苷的大豆糖苷配基異黃酮或大豆葡糖苷異黃酮。
3.權利要求1的方法，其中所述超臨界流體是超臨界的CO2或者接近超臨界的C02。
4.權利要求1的方法，其中所述有機溶劑是丙酮。
5.權利要求1的方法，其中所述最佳條件包括向所述沉澱室施加的溫度、壓力，和所述超臨界流體與所述大豆異黃酮溶液的進料速率比。
6.權利要求5的方法，其中所述溫度是從31°C至60°C。
7.權利要求5的方法，其中所述壓力是從亞臨界相至超臨界相。
8.權利要求7的方法，其中所述的從亞臨界相至超臨界相的壓力是從60巴至350巴。
9.權利要求5的方法，其中所述大豆異黃酮溶液具有從在室溫和大氣壓下在有機溶劑中的飽和點至比飽和點低十倍的大豆異黃酮濃度。
10.權利要求9的方法，其中所述飽和點是在丙酮中4mg/mL。
11.權利要求5的方法，其中所述進料速率比範圍是從30至90g/mL。
12.權利要求8的方法，其中所述壓力是70-120巴。
13.權利要求9的方法,其中所述大豆異黃酮濃度是從0.4mg/mL至4mg/mL。
14.權利要求11的方法，其中所述進料速率比是從60至90g/mL。
15.權利要求6的方法，其中所述溫度是40°C。
16.權利要求1的方法，其中當在所述沉澱室中預先設定的所述最佳條件達到40°C的溫度、從70巴至100巴的壓力、60g/mL的所述超臨界流體與所述大豆異黃酮溶液的進料速率比，並且使用4mg/mL大豆異黃酮的大豆異黃酮溶液時，所述大豆異黃酮納米顆粒的平均寬度減小大約50-200倍。
17.權利要求16的方法，其中所述大豆異黃酮納米顆粒的溶出度和生物利用度比未處理的大豆異黃酮的溶出度和生物利用度增加2倍和2.6倍。
18.權利要求16的方法，其中所述納米顆粒具有小於Iμ m的平均寬度。
19.權利要求16的方法，其中所述納米顆粒具有小於260nm的平均寬度。
20.一種口服組合物，其包含通過權利要求1的方法製備的具有改善的溶出度和生物利用度的大豆異黃酮納米顆粒。
21.權利要求20的口服組合物，其中所述染料木黃酮納米顆粒是散劑形式。
22.—種霧化製劑，其包含通過權利要求1的方法製備的具有改善的溶出度和生物利用度的大豆異黃酮納米顆粒。
23.權利要求22的霧化 製劑，其中所述大豆異黃酮納米顆粒是氣霧劑形式。
全文摘要
本發明涉及製備固體形式大豆異黃酮(例如染料木黃酮)的方法。具體而言，本發明涉及通過使用超臨界流體的壓縮抗溶劑沉澱製備固體形式大豆異黃酮的方法，以產生具有改善的溶出度和生物利用度的大豆異黃酮納米尺寸顆粒。本文還公開了包含通過本發明方法製備的大豆異黃酮納米顆粒的口服組合物或霧化製劑。通過本發明方法製備的大豆異黃酮納米顆粒的溶出度和生物利用度與未處理的大豆異黃酮的相比分別增加2倍和2.6倍。
文檔編號A61K9/14GK103211750SQ20131002717
公開日2013年7月24日 申請日期2013年1月18日 優先權日2012年1月20日
發明者羅茜, 徐勁節 申請人:納米及先進材料研發院有限公司