一種極小類胚胎樣幹細胞的製備方法

2023-05-30 14:22:41

專利名稱：一種極小類胚胎樣幹細胞的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種骨髓幹細胞分選製備方法，具體的涉及極小類胚胎樣幹細胞的分選製備方法。
背景技術：
心血管疾病每年奪走1200萬人的生命，接近世界人口總死亡的1/4，成為人類健康的頭號大敵。對於心肌梗死或心力衰竭，傳統的治療方法，包括藥物、介入和外科手術均不能使缺失的心肌細胞再生，由於心肌缺失造成不可逆轉的心肌重塑過程，終至心力衰竭和死亡。近年來，幹細胞再生醫學在心血管疾病治療中取得了突破性進展，該技術又被稱為細胞心肌成形術(cellular cardiomyoplasty)，即通過移植幹細胞或心肌細胞，或者動員外周循環血幹細胞或骨髓幹細胞遷移到心肌受損部位來實現損傷心肌的修復。目前應用於動物實驗及臨床實驗的幹細胞種類主要包括胚胎幹細胞和各種成體幹細胞。胚胎幹細胞由於受到免疫排除和倫理道德等問題的幹擾，因而在臨床應用中受到限制。成體幹細胞，主要包括造血幹細胞、骨髓單核細胞、骨髓間充質幹細胞、內皮祖細胞、 骨骼肌成肌細胞、臍血幹細胞及脂肪來源的幹細胞等。成體骨髓幹細胞不存在免疫排斥反應，採取方便，被認為是最有前景的細胞移植類型。通常認為幹細胞移植可以增加細胞因子如VEGF的釋放，促進缺血區新生血管的形成，改善灌注、改善冬眠心肌和頓抑心肌的功能，減少心室擴張和心室重構。移植的幹細胞在局部微環境的誘導下可以分化為心肌細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞等，即具有可塑性，但也有研究發現移植的骨髓幹細胞並沒有分化為心肌細胞，只是分化為不同的血液細胞。因此，目前爭議的焦點主要是成體幹細胞的橫向分化潛能。近年來，研究者在成體組織中發現類似於胚胎幹細胞的、能真正橫向分化的成體幹細胞類型。數項研究表明骨髓中存在表達多能幹細胞標記(如Oct-4、Nanog, SSEA-U Rex-I 等)的成體幹細胞，如 MSC 亞群[Colter DC, Sekiya I, ProckopDJ. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotentialadult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci US A,2001. (98) :7841-7845. Pochampally RR, Smith JR, Ylostalo J, et al. , Serum deprivation of human marrow stromal cells(hMSCs)selects for asubpopulation of early progenitor cells with enhanced expression of OCT-4 andother embryonic genes. Blood, 2004. 103 1647-1652] > MAPC [Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al., Pluripotency of mesenchymal stem eellsderived from adult marrow.Nature, 2002. 418 :41-49]、MIAMI[D，Ippolito G,Diabira S,Howard GA,et al. ,Marrow-isolated adult multilineage inducible(MIAMI)cells,a unique population of postnatal young and old human cells withextensive expansion and differentiation potential.J Cell Sci，2004. 117 :2971-2981]、USSC[Kogler G, Sensken S, Airey JA, et al.，A newhuman somatic stemcell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J Exp Med，2004. 200 :123-135]等。2004 年，Kucia 等 [Kucia, Μ. , et al. , Cellsexpressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilizedinto the peripheral blood after myocardial infarction. Circ Res, 2004. 95(12) :1191-9]首次報導小鼠骨髓MNCs中富集一類表達心肌細胞轉錄因子(Nkx2. 5/Csx，GATA-4，MEF2C)的非造血幹細胞，表面標記為 C)(CR4(+)、Iin(-)、CD45(_)、 Sca-I㈠。該研究小組連續進行數項研究，於2006年首次提出極小類胚胎樣幹細胞(very small embryonic-like stem cells, VSELs)的概念[Kucia Μ. , et al. , A population of very small embryonic-like (VSEL)CXCR4(+)SSEA-1(+)Oct-4+stem cells identified in adult bone marrow. Leukemia,2006. 20(5) :857-69]。歸納起來，VSELs主要有以下特點1)體內數量少，約佔骨髓MNCs的 0. 01-0. 02%，且隨年齡增加而減少；2) VSELs表達ESCs的多能性原始標記蛋白類小鼠為 Sca-I (+)/lin (-) /CD45 (-)，人為 CD133 (+) /CXCR4 (+) /CD34 (+) /Lin (-) /CD45 (-) ；3)形態學VSELs體積小，直徑約2-4 μ m(小鼠)、6_8 μ m(人)，電鏡下可見其具有典型的ESCs形態特徵，如細胞核大，細胞壁薄，高核/漿比值，染色體排列無序，含有雙倍DNA結構和大量線粒體；4)在 mRNA 和蛋白質水平表達 SSEA-I、0ct_4、Nanog,以及 GATA-4、Nkx2. 5/Csx、 MEF2C和內皮標記VE-cadherinj)分布廣泛存在小鼠多個組織器官(其中骨髓、腦、腎、 肌肉、胰腺數量較多)及人臍血、骨髓和外周血；6)可被動員正常情況下，外周血中VSELs 數量極少，AMI後大量VSELs動員至外周血，其動員與梗死區多種趨化因子，如SDF-I等表達上調有關；7)橫向分化潛能在適當促分化條件下能分化為三個胚層來源的細胞，包括心肌細胞。有關VSELs移植的動物實驗顯示，AMI後48h經心肌輸注IX IO4個eGFP標記的VSELs，觀察至AMI後35天，移植組心功能明顯改善，心肌細胞代償性肥大減輕，而移植IX IO5個造血幹細胞(HSCs)未見任何心功能和組織結構改善。VSELs移植組梗死區可見數量極少的eGFP+心肌細胞和毛細血管。該研究表明經心肌內輸注小劑量VSELs 即可改善心功能、減輕左室重構，為VSELs移植治療AMI提供了實驗基礎[Dawn，B.， et al. ， Transplantation of bonemarrow-derived very small embryonic-like stem cells attenuates left ventriculardysfunction and remodeling after myocardial infarction. Stem Cells,2008. 26(6) :1646-55]。VSELs的發現意義不僅在於為心肌再生找到一種新的「種子」，更重要的是其類似 ESCs的形態學特徵及多向分化潛能，從而可能為前述爭議畫上句號，將幹細胞再生心肌研究引入一個全新方向。VSELs具有與ESCs相似的無可比擬的橫向分化潛能，有固定的表面抗原標記，且無ESCs的免疫排斥及倫理爭議等問題，故可臨床應用。在體內，骨髓基質成纖維細胞分泌SDF-I等趨化因子，使表達SDF-I受體CXCR4的VSELs粘附或包繞在骨髓細胞周圍，因此，常規方法獲取的MSCs極有可能混雜VSELs，這可能解釋關於幹細胞橫向分化能力的諸多研究結果的差異。由於表面標記的相似性，VSELs同上述諸多表達ESCs標記的多能幹細胞很可能存在部分甚至完全重疊。因此，VSELs很可能就是骨髓幹細胞橫向分化的核心。

發明內容
本發明提供一種極小類胚胎樣幹細胞的製備方法，該方法採用全骨髓培養法，以多次更換培養液的方式逐步去除未貼壁的細胞，細胞呈明顯克隆樣生長後，酶解使其重新懸浮，流式細胞儀富集sCa-l(+)、lineage(-)及CD45(_)的亞群細胞，即得極小類胚胎樣幹細胞。本方法包括如下三步(一)首先採用全骨髓貼壁培養法，去除全骨髓細胞中的懸浮細胞；(二)待細胞克隆化生長至一定程度後，在已貼壁或半貼壁的剩餘細胞中分選 VSELs ；(三)行透射電鏡掃描，觀察兩種分選方法所獲得的VSELs是否存在細胞形態學差
已本發明提供的極小類胚胎樣幹細胞的製備方法，全骨髓培養法的培養時間優選為 5-6天，更優選為5天，更換培養液的次數優選為3次，優選的更換時間為第1次為M小時， 以後每隔兩天清洗一次。本發明提供的極小類胚胎樣幹細胞的製備方法，優選的具體步驟如下a.取出全骨髓細胞接種到塑料培養瓶中，置於37°C、含5% C02的潮溼培養箱中培養；b.接種後M小時初次更換培養液，去除非貼壁細胞，之後每兩天更換一次培養液，共計更換3次；c.全骨髓細胞培養5天，細胞呈明顯克隆樣生長後，加入0.25%胰酶-0.02% EDTA液使所有細胞重新懸浮；d.將細胞懸液加至螢光素標記抗體稀釋液混勻，避光，置冰上孵育30min ；e.清洗未結合的抗體，離心，重複兩次，然後重新懸浮；f.以流式細胞儀分選sca-1 (+)/lin(_)/⑶45(-)，即得極小類胚胎樣幹細胞。由於VSELs體積小、數量少，通過常規密度梯度離心法獲取骨髓單個核細胞 (MNCs)並進一步分選的方法容易損失大多數VSELs。同時，由於VSELs僅佔骨髓MNCs的 0.01-0. 02%，通過全骨髓細胞裂解法去除紅細胞獲得MNCs並進一步從中分選的方法，同樣容易損失大部分VSELs細胞。因此，本發明的目的是提供一種能夠最大程度地保存骨髓中VSELs、減少其損耗的分選方法，從而優化骨髓幹細胞移植治療的「種子」來源，優化心肌治療心肌梗死的操作流程。本發明提供的研究數據表明，採用聯合培養的間接分選方法，能夠明顯提高VSELs 在分選細胞中所佔的比例，減少損耗。並且培養過程並未影響VSELs的生物學特性，從而為下一步幹細胞移植治療提供可靠的細胞來源。
具體實施例方式以下舉例說明本發明的具體實施的方法，並不對本專利構成任何限制，實施例1 中的實施方式不限於動物，在本領域普通技術人員的可預測的情況下，可以擴展為其他動物和人類，只是在人類中需要採用活體對骨髓進行採樣，本實施例在說明本發明實施方式的同時，也和傳統的紅細胞裂解的直接分選法做了對比說明本發明的技術效果。實施例1 小鼠骨髓極小胚胎樣幹細胞分選材料與方法
實驗動物本實驗所使用的動物為SPF級C57/BL6種系小鼠，雄性，4_6周齡，體重約 14g士2g，由北京市維通利華實驗動物技術有限公司提供。所有實驗動物均受到人道對待， 符合美國國立衛生研究院頒布的《實驗動物管理和使用指南》。所有實驗方案均得到中國醫學科學院實驗動物管理委員會和北京協和醫學院阜外心血管病醫院實驗動物倫理委員會
的批准。
主要實驗試劑及配製方法
試劑名稱廠商
IMEM(Iscove' s Modified Dulbecco' sGibco
Medium)
胎牛血清(FBS，特優級)Gibco
0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTASigma
青-鏈黴素儲存液(10，000U/ml)Invitrogen
細胞裂解液(IOX)BD Pharmingen
PE-anti-Ly-6A/E (Sca-I)單克隆抗體BD Pharmingen
FITC-anti-CD45單克隆抗體BD Pharmingen
APC-anti-TCR β chain 單克隆抗體BD Pharmingen
APC-anti-CDllb單克隆抗體BD Pharmingen
APC-anti-Gr-I單克隆抗體BD Pharmingen
APC-anti-Ly-76單克隆抗體BD Pharmingen
APC-anti-CD45R/B220 單克隆抗體BD Pharmingen
主要試劑配製方法
(I)IMDM完全培養液
IMDM培養液 88%
胎牛血清 12%
青黴素 100U/ml
鏈黴素 100U/ml
用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌，4°C保存備用O
O) PBS緩衝液
KCl 0. 2g
KH2PO4 0. 2g
NaCl 8.Og
Na2HPO4 · 12H20 2. 08g
調pH至7. 4，定容至1L，高壓滅菌。
(3)洗滌緩衝液
PBS 98%
FBS 2%
用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌，4°C保存備用O
(4)細胞裂解工作液(IX)
細胞裂解液(IOX) 10%蒸餾水90%將pH調至7. 1-7. 4，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，用時加熱至室溫。A組(本發明方法)C57/BL6小鼠骨髓幹細胞的分離和培養(1)動物腹腔麻醉(氯胺酮30mg/kg體重)；(2) 75%乙醇浸泡3-5min (頭部在液面上，以防動物嗆水)；(3)於細胞培養用超淨臺內，剪開動物腿部皮膚，分離腿部肌肉，取出動物腿部股骨和脛骨(粘有骨骼肌)；(4)用PBS或不含血清的細胞培養液洗去所取骨骼上的殘留血液，置於PBS中備用；(5)剔除骨骼上殘留的骨骼肌，除去長骨兩端的軟骨帽；(6)輕輕刮去一層骨端的骨垢(不要直接剪去長骨兩端，以防損失兩端骨垢中的大量細胞)，用完全培養液緩慢衝出骨髓腔中的細胞，特別要儘量衝出骨垢中的細胞(動作要輕，儘量不要產生氣泡)；(7)將衝出的細胞直接種到塑料培養瓶中(一隻小鼠細胞接種一瓶25cm2培養瓶)，置於37°C、含5% CO2的潮溼培養箱中培養；(8)接種後M小時初次換液，去除造血細胞、成纖維細胞和其它非貼壁細胞，可用 PBS輕緩洗一次，動作儘量輕柔，以免將附著於瓶底的半貼壁細胞洗掉；之後每兩天更換一次培養基；(9)全骨髓細胞培養5-6天後，可見細胞形成多個形態不均一的細胞克隆，約達到 70-80%融合，加入0. 25%胰酶-0. 02% EDTA液使所有細胞重新懸浮，以血細胞計數板計算細胞數量；B組(直接分選法)C57/BL6小鼠骨髓單個核細胞的分離——紅細胞裂解法(1)動物腹腔麻醉(氯胺酮30mg/kg體重)；(2) 75%乙醇浸泡3-5min (頭部在液面上，以防動物嗆水)；(3)於細胞培養用超淨臺內，剪開動物腿部皮膚，分離腿部肌肉，取出動物腿部股骨和脛骨(粘有骨骼肌)；(4)用PBS或不含血清的細胞培養液洗去所取骨骼上的殘留血液，置於PBS中備用；(5)剔除骨骼上殘留的骨骼肌，除去長骨兩端的軟骨帽；(6)輕輕刮去一層骨端的骨垢(不要直接剪去長骨兩端，以防損失兩端骨垢中的大量細胞)，用完全培養液緩慢衝出骨髓腔中的細胞，特別要儘量衝出骨垢中的細胞(動作要輕，儘量不要產生氣泡)；(7)離心，350gX10min，棄上清，加入Iml洗滌緩衝液重懸細胞；(8)按10 1比例加入細胞裂解液，立即漩渦混勻，室溫孵育15min ；(9)離心，200gX5min,輕輕吸棄上清，加入5ml洗滌緩衝液混勻清洗，相同條件離心一次，吸棄上清。若裂解不全，肉眼可見較多紅細胞，可重複一次裂解步驟；(10)將裂解得到的小鼠骨髓單個核細胞重懸於洗滌緩衝液，並以血細胞計數板計數。
流式細胞儀純化sca-1 (+) /1 in (_) /CD45 (-)骨髓極小胚胎樣幹細胞(VSELs)(1)將上述兩種分選方法得到的細胞懸液離心，收集細胞，並以PBS清洗1次，按 10750 μ 1濃度重懸細胞；(2)取適量螢光素標記的抗體原液PE-anti-Ly-6A/E (Sca-I)、FITC-anti_CD45、 APC-anti-TCR β chain、APC_anti_CDllb、 APC-anti-Gr-l, APC-anti-Ly-76 , APC-anti-CD45R/B220，以洗滌緩衝液(PBS+2% FBS)稀釋至0. 1 μ g/50 μ 1，與細胞懸液等體積；(3)將細胞懸液加至抗體稀釋液，輕輕吹打混勻，避光，置冰上孵育30min ；(4)以洗滌緩衝液QOO μ VlO6ceIls)清洗未結合的抗體，離心350gX5min，重複兩次；(5)將抗體孵育後的細胞重懸於洗滌緩衝液，濃度調至5X 105Cells/100 μ 1 ；(6)行流式細胞儀(MoFlo)檢測，觀察sca-Ι⑴、lin(-)及CD45 (-)的細胞亞群在總細胞中所佔比例，並分選sca-1 (+)/lin (_)/CD45(_)的VSELs。透射電鏡(TEM)觀察骨髓極小胚胎樣幹細胞的形態及超微結構(1)固定①收集經流式細胞儀分選出的骨髓極小胚胎樣幹細胞，轉移至EP管，以PBS清洗 2次，離心，吸棄上清；②沿EP管壁緩緩加入4°C預冷的2%戊二醛lml，4°C固定30π η- ι ；③以探針撥離細胞團塊，移入青黴素小瓶中，在4°C用PBS洗3次X IOmin ；④以四氧化鋨在4°C固定15_30min ；⑤PBS 漂洗 3 次 X IOmin。(2)脫水用系列丙酮在室溫下脫水，依次為50%丙酮，1次X IOmin ；70%丙酮，1 次 XlOmin ；90%丙酮，2 次 XlOmin ；100%丙酮，3 次 XlOmin。(3)浸透吸棄瓶中脫水劑，加3ml純丙酮-EPON 812 (1 1體積比)，室溫下放置 30min後，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1ml，室溫放置過夜。(4)包埋吸取混合包埋劑，滴2滴於2號膠囊模塊孔的底部，把細胞團塊移入膠囊底部中心，注滿混合包埋劑，放60°C烤箱烘烤Mh，使之固化成硬塊。(5)修塊將包埋塊安裝在特製的夾具上，在體視顯微鏡下用單刃刀片修正包埋塊，即修去細胞團塊表面的包埋劑，然後在細胞團塊四周以45°角切去多餘包埋劑，並做記號，以便定位。(6)製備半薄切片①切片將修好的包埋塊固定在超薄切片機上，切取厚度Iym的半薄切片；②染色取潔淨載玻片，浸入明膠和鉻明礬混合液中，取出放在烤片機上加熱至60°C使之乾燥。在玻片上滴加一滴蒸餾水，用鑷子將半薄切片移入水滴中，再放在烤片機上加熱使之展平乾燥。然後滴加美藍染液(1%美藍、硼酸鈉和天青藍)，在 600CSfe 30s，用水衝洗，再滴加1 1的0. 25%硼酸鈉和0. 5%鹼性復紅，在60°C染10s，水洗，烤乾。③鏡檢及定位在顯微鏡下觀察半薄切片的細胞圖像，確定欲做超薄切片的部位並作標記。
(7)製備超薄切片清洗150-200目銅網，製備支持膜和三角形玻璃刀，在超薄切片機上安裝玻璃刀，切取50-70nm厚度的超薄切片，貼在銅網有支持膜的一側，保持在乾燥器皿中，待染色。(8)電子染色①將載有切片的銅網垂直夾於橡膠板上並平放入平皿內，在切片一側滴加一滴醋酸雙氧鈾染色液，加蓋，室溫下染5-lOmin。②取出橡膠板，以雙蒸水衝洗切片，並用濾紙吸乾，放入平皿內，加一滴鉛染液 (含醋酸鉛、硝酸鉛和枸櫞酸鉛)，室溫下染5-lOmin。③水洗、吸乾、晾乾備用。(9)電鏡觀察按說明書要求安裝超薄切片，調試電鏡，觀察細胞形態、直徑、核漿比值及細胞內部超微圖像。統計分析兩種分選方法均重複三次以上，得到各亞組細胞在總細胞中的比例(％ )，所有連續變量均採用均數士標準誤表示，用t檢驗(ttest)對兩種分選方法的差異進行分析。所有數據均使用SPSS15. 0進行統計分析。結果A組中，經全骨髓貼壁培養後，每隻C57/BL6小鼠平均獲得4X IO5個骨髓幹細胞； B組中，每隻C57/BL6小鼠平均獲得2 X IO7個單個核細胞。A組重複6次，B組重複3次，分別測算、Lingeage (_)、CD45(_)亞群細胞在總細胞中所佔比例，及VSELs在參與分選的總細胞中所佔比例，如表1所示。表1:兩種方法分選比較
GroupNSca-l(+)%Lingeage(-)% CD45(-)%VSELs0/.
A689.6±1.9951.1±3.622.9士1.849.4±0.62
B316.53±.0.54A 34.7±3.0*0.91±0.11A0.04±0.01A( ▲ ρ < 0. OOlvs group B,* ρ = 0. 23vs group A)兩種分選方法相比，A組經全骨髓貼壁培養後，骨髓幹細胞中sca-l(+)、 CD45(_)亞群細胞比例(89. 6士 1. 99%，22. 9士 1. 84% )明顯高於 B 組(16. 53士0. 54 %， 0. 91 士0. 11% ；ρ < 0. OOlrespectively) ；A 組 Iin(-)亞群細胞比例(51. 1 士3. 6% )也高於 B 組(34. 7士3.0%，ρ = 0.023) ；A 組分選得到的 sca_l (+)/lin (-)/CD45 (-) VSELs 比例 (9. 4士0. 62% )明顯多於 B 組(0. 04士0. 01%, ρ < 0. 001)。透射電鏡掃描結果顯示，直接分選和培養後間接分選得到的VSELs細胞形態、大小及內部結構均無差別，提示培養後間接分選方法並未影響細胞的生物學特性。本實施例表明(1)經紅細胞裂解法獲取骨髓單個核細胞，進而分選極小胚胎樣幹細胞的直接分選方法效率低下，VSELs僅佔參與分選總細胞的0. 04 士 0. 01%； (2)在全骨髓貼壁培養，初步富集目的細胞亞群的基礎上，間接分選VSELs的方法能夠減少分選造成的VSELs損失，提高分選效率；C3)兩種分選方法相比，獲得的VSELs形態、大小及結構均無差別。 本實施例還說明短期全骨髓貼壁培養，能夠高效地去除非目的細胞，富集 sca-l(+)、CD45(-)及lineage (-)亞群骨髓細胞；同時，多種亞群細胞共同培養，使得VSELs 的體外培養環境更接近於體內骨髓微環境，利於幹細胞生物學特性的維持；細胞間通過旁分泌作用促進相互生長甚至擴增；體外短期培養初步富集目的細胞，使VSELs在參與分選總細胞中的比例明顯增多，提高了細胞分選效率。
權利要求
1.一種極小類胚胎樣幹細胞的製備方法，其特徵在於採用全骨髓培養法，以多次更換培養液的方式逐步去除未貼壁的細胞，細胞呈明顯克隆樣生長後，酶解使其重新懸浮，流式細胞儀富集sCa-l(+)、lineage (-)及CD45 (-)的亞群細胞，即得極小類胚胎樣幹細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於全骨髓培養法的培養時間為5-6天，更換培養液的次數為3次。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於全骨髓培養法的培養時間為5-6天，培養液的更換次數為3次，第1次為M小時，以後每隔兩天清洗一次。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在該方法的具體步驟如下a.取出全骨髓細胞接種到塑料培養瓶中，置於37°C、含5%C02的潮溼培養箱中培養；b.接種後M小時初次更換培養液，去除非貼壁細胞，之後每兩天更換一次培養液，共計更換3次；c.全骨髓細胞培養5天，細胞呈明顯克隆樣生長後，加入0.25%胰酶-0. 02% EDTA液使所有細胞重新懸浮；d.將細胞懸液加至螢光素標記抗體稀釋液混勻，避光，置冰上孵育30min；e.清洗未結合的抗體，離心，重複兩次，然後重新懸浮；f.以流式細胞儀分選sca-l(+)/lin(-)/CD45(-)亞群細胞，即極小類胚胎樣幹細胞。
全文摘要
本發明公開了一種優化的骨髓幹細胞分選方法，用於分選成體骨髓幹細胞中一群數量極少的、具有多向分化潛能的亞群細胞，即極小類胚胎樣幹細胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)。
文檔編號C12N5/0775GK102373176SQ20101025915
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月23日 優先權日2010年8月23日
發明者徐輝, 楊躍進, 錢海燕 申請人:徐輝, 楊躍進, 錢海燕