耐高溫精氨酸抑制因子基因及其編碼的多肽和製備方法
2023-05-30 14:23:06 1
專利名稱：耐高溫精氨酸抑制因子基因及其編碼的多肽和製備方法
技術領域：
本發明涉及突變或遺傳工程，尤其涉及一種耐高溫精氨酸抑制因子基因及其編碼的多肽和製備方法。
背景技術：
精氨酸抑制因子(arginine repressor)是一個L一精氨酸依賴性DNA粘合蛋白，它控制著精氨酸的生物合成基因組表達，同時是質粒中cer以及相關的結合位點的Xer特定位點結合的必須蛋白。形成於精氨酸抑制因子中的直接位點突變，常用來分離兩個突變異種。
精氨酸抑制因子是一種普遍存在於細菌基因組之間的轉錄因子。儘管在一個基因組內部位點之間只有很小的相似性，它的識別信號，一個微弱的迴文序列，仍然存在於基因組之間。因此，精氨酸抑制因子和其他的兩個普遍存在轉錄因子是不同的。HrcA，它的識別信號十分強的存在於基因組之間以及內部；而LexA/DinR，它的信號十分強的保存於基因組內部而不是之間。在Escherichiacoli，Bacillus subtilis以及其他的一些基因組中的精氨酸抑制因子被很好的研究。
Escherichia coli中精氨酸抑制因子是一種典型的反饋調節因子，信號發自於細胞內部的L-精氨酸。它不同於其他大多數具有六聚體作用的抑制因子，而且它缺乏具體的結構，也不同其他的轉錄調節因子那樣擁有清晰的同族序列。精氨酸抑制因子的胺基酸殘基序列以及蛋白水解分裂模型的分析，可以應用於鑑定DNA粘合物功能的預測區域。當這個蛋白的碎片從一個相應的基因組碎片中被過分表達的時候，它可以抑制體內鳥氨酸轉氨甲醯酶的水平，而且於體外限制DNA的操縱子。溶液中的沉澱平衡以及凝膠體過濾顯示，純化蛋白碎皮是一個單體。結果在低的精讀條件下，限定了抑制因子的區域結構，顯示出肽鏈的N，C末端蛋白可以被結構性及功能性的邊界所分割，這個邊界可以減弱六聚體聚合物以及DNA結合物的精氨酸粘合物的震波。
在Escherichia coli中，精氨酸抑制因子調節L-精氨酸生物合成基因組的轉錄因子，同時也作用於Xer特定位點的在結合。在DNA合成以及六聚體聚合過程中，氨酸抑制因子需要L-精氨酸的加入。同源六聚體精氨酸抑制因子的單肽鏈具有156個胺基酸長度而且有兩個功能區域組成，一個鹼性N末端區域(1-79個殘基)，用於DNA的合成，一個酸性C末端區域(80-156個殘基)，用於六聚體聚合物以及L-精氨酸的合成。
精氨酸抑制因子蛋白由78個胺基酸組成，它的長度相當於78個殘基。在蛋白內部每個螺旋有3個區域。一個螺旋由一個嚴格的圓柱體組成，由分子中的疏水性因子以及氫鍵連接而成。在一個螺旋體中每個翻轉由3.6個殘基，所以在精氨酸的三個螺旋中，大約每一個都有三個完全的翻轉，而每個長度大約是10個殘基。他們顯示的位置為胺基酸10-19，26-36，43-53。41％的精氨酸抑制因子由一個螺旋體組成。精氨酸抑制因子的晶體結構在2.7的精度條件下被測定。因子的每個亞基有兩個區域。C末端區域排列分布著32個對稱位點群，它調節著主要的內部亞基的相互作用。N末端區域在這個核心周圍定位，他們的定位有微弱的關聯性，但是沒有嚴格的遵守對稱規則。
精氨酸的X-射線晶體結構圖譜分析結果顯示，三聚體內的二聚體中夾入一個L-精氨酸分子的層，在2.2精度條件下，精氨酸物理資料庫受限於在Accelrys′Insight II軟體的構象研究。運用分子造型工具，可以限定晶體結構以及分析它的化學和物理成分，以用於更好的理解文獻中所描述的精氨酸抑制因子的生物成份。
騰衝嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)，是生活在我國雲南省騰衝縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細菌(eubacteria)，最適生長溫度為75攝氏度，厭氧生長，革蘭氏染色反應呈陽性。它由中國科學院微生物所首先發現並進行了分類學上的分析。菌種保存在中國微生物保存中心MB4T(Chinese collection of microorganisms AS 1.2430T＝JCM 11007T)。該嗜熱厭氧菌是我國特有的一個物種，其體內所具有的耐高溫精氨酸抑制因子也具有自己特有的結構。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種分離的，編碼具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽的核苷酸序列。
本發明的目的之二是提供一種分離的，具有耐高溫精氨酸抑制因子活性多肽。
本發明的目的還提供了嗜熱厭氧菌的精氨酸抑制因子重組載體、含有重組載體的宿主細胞，以及生產蛋白的方法。
本發明一方面提供一種能編碼具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽的核苷酸序列。所說的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2中的胺基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與精氨酸抑制因子相關。核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無義、插入、錯義。
本發明另一方面提供了一種耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽。該多肽具有SEQ ID No.2中的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
生產耐高溫精氨酸抑制因子的方法為1)分離出編碼耐高溫精氨酸抑制因子的核苷酸序列SEQ ID NO.1；2)構建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫精氨酸抑制因子的重組細胞；4)培養步驟3)中的重組細胞；5)分離、純化得到耐高溫精氨酸抑制因子。
本發明涉及嗜熱厭氧菌的耐高溫精氨酸抑制因子基因的分離及表達。以騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析為基礎，克隆分離了耐高溫精氨酸抑制因子基因。該基因對於製備用於生產耐高溫精氨酸抑制因子的轉基因微生物或動植物，並回收穫得該基因編碼的酶有用。另外，本發明還提供了具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽的胺基酸序列及功能等同體。同時，本發明還提供了製備，分離，純化具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽的方法。
圖1是測序文庫構建步驟流程圖；圖2是測序與數據分析流程圖。
具體實施例方式
首先，本發明提供了分離的，編碼耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽的多聚核苷酸分子，該核苷酸分子是通過對騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析而獲得的，具有SEQ.ID NO.1的核苷酸序列，它編碼具有151胺基酸的多肽，該多肽推測分子量為17006道爾頓。
本發明還提供一種重組載體，該載體包含本發明的分離的核苷酸分子，以及包含有重組載體的宿主細胞。同時，本發明包括構建該重組載體和宿主細胞的方法，以及用重組工程技術生產耐高溫精氨酸抑制因子的方法。
本發明進一步地提供了一種分離的耐高溫精氨酸抑制因子或多肽，其特徵在於具有SEQ.ID NO.2胺基酸序列，或至少70％相似，更佳地，至少具有90％，95％，99％的相同。
在本發明中，「分離的」DNA是指該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，「耐高溫精氨酸抑制因子基因」指編碼具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ.ID NO.1的核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指該序列中有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於公知的密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的胺基酸序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳地在高度嚴謹條件下與SEQ IDNO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
在本發明中，「分離的」蛋白的多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析，PAGE或HPLC法測量多肽的純度。分離的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組份。
在本發明中，「耐高溫精氨酸抑制因子」指具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括SEQ ID NO.2序列的變異體，這些變異體具有與天然耐高溫精氨酸抑制因子相同的功能。這些變異體包括(但不限於)若干個胺基酸的缺失，插入和/或取代，以及在C末段和/或N末端添加一個或數個胺基酸，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，為本領域所公知的，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末段和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括耐高溫精氨酸抑制因子的活性片段和活性衍生物。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒，粘粒，噬菌體及反轉錄病毒等。在生產本發明的耐高溫精氨酸抑制因子時，可以將耐高溫精氨酸抑制因子基因序列與表達調控序列相連，從而形成耐高溫精氨酸抑制因子表達載體。表達載體含有複製起始點和表達調控序列，啟動子，增強子和必要的加工信息位點。表達載體還必須含有可供選擇的標記基因，如a)提供對抗生素或其它毒性物質(氨苄青黴素，卡那黴素，氨甲蝶呤等)的抗性的蛋白質或b)互補營養缺陷型蛋白質或c)提供複合培養基中沒有的必需營養成分的蛋白質。各種不同宿主的合適標記基因是本領域中所熟知或生產廠商說明書註明的。這些表達載體可以用本領域技術人員公知的重組DNA技術製備，如可參考Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1992。
重組表達載體可以用本領域熟知的方法引入宿主細胞，這些方法包括電轉化法，氯化鈣法，基因槍法等。將外源重組載體導入宿主細胞的過程稱為「轉化」。通過培養宿主細胞，誘導所需蛋白的表達，並通過本領域所熟知的蛋白分離技術，如柱層析等得到所需的蛋白質。也可採用固相技術等人工合成該蛋白質。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核細胞如大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核細胞如酵母細胞，或各種動植物細胞。本發明的耐高溫精氨酸抑制因子基因全長序列或其片段通常可以用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增法，重組法，或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，用本領域技術人員已知的常規方法製備的嗜熱厭氧菌全基因組DNA為模板，擴增而得到有關序列。一旦獲得了有關序列，就可以將其克隆入有關載體，再轉入宿主細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到大批量的有關序列。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1構建測序文庫測序文庫的構建採用全基因組霰彈法(shotgun)進行。首先培養騰衝嗜熱厭氧菌，培養方法按(Yanfen Xue，2000)改進的MB培養基(Balch et al.，1979)，按Marmur(1961)方法收集細菌，提取總DNA。為了保證測序文庫構建的隨機性，最大程度地避免產生斷裂熱點的問題，採用多種方法、不同條件的建庫原則。先採用物理剪切方法(包括超聲波法及用Hydroshear Machine進行剪切)，其次根據該菌基因組特徵選用AluI進行隨機部分酶切。物理剪切時採用不同強度處理樣品，酶切時通過設置酶量梯度處理樣品。處理後的樣品經平末端處理後，採用電泳分部收集1.5-4kb DNA片段，與去磷酸化的經SmaI酶切的pUC18進行連接，連接產物通過電轉化E.coli DH5α構建了隨機測序的文庫。同時，為了便於以後重疊群(contig)的搭接還構建了長插入片段(10kb左右)的測序文庫(將基因組DNA以Sau3AI隨機部分酶切，電泳收集10kb左右的片段，與去磷酸化的經BamHI酶切的pUC18進行連接、構建文庫)。該文庫經兩個末端的測序在完成圖(finishing)的過程中可以得到contig之間的關係，並可以解決較大的洞(gap)對補洞造成的困難。建庫流程見圖1。
實施例2基因組測序在完成騰衝嗜熱厭氧菌基因組的測序時，主要使用了兩種全自動測序儀ABI377和MegaBACE 1000。這兩種測序儀都是利用電泳原理進行測序(見圖2)，每次可完成96個樣品。ABI377是PE公司的產品，是ABI系列的一種。它屬於平板凝膠電泳測序儀。MegaBACE 1000是法瑪西亞公司的產品，屬於毛細管凝膠電泳測序儀。
實施例3Basecalling和測序質量監控所謂Basecalling是指從測序儀上得到的原始數據文件中得到正確的鹼基序列的過程。由於測序儀上得到的是A，T，G，C四種鹼基對應的不同波長的光的強度變化軌跡(trace)，需要用計算機採取一定的算法從中正確識別出不同的軌跡對應的鹼基。我們使用的是Phred軟體(Ewing B，Hillier L，1998)，原因是其結果更可靠，並且其結果輸出更便於同一軟體包中的其他程序進行進一步的分析。
Phred進行Basecalling的算法原理，是根據軌跡中各個峰的形狀，間距，以及信噪比等因素，判斷鹼基類型，同時對這個鹼基給出可信度信息，即鹼基的測序質量。在大規模測序中，測序質量的監控是十分重要的，它直接影響對測序的決策，包括文庫的構建，覆蓋率的大小。同時對測序實驗中可能出現的失誤能及時反饋。
實施例4序列拼接所謂序列拼接，就是把全基因組霰彈法，又稱鳥槍法隨機測序得到的樣品序列組裝成連續的重疊群(contig)，主要利用它們之間的重疊序列作參考。考慮到測序中存在載體的影響，需要先對樣品序列進行去載體處理。這裡所用的軟體cross match和後面拼接所用的軟體Phrap都是美國Washington大學的軟體(Gordon D，Abajian C，1998)，其基本原理為Swith-Waterman算法(WatermanMS，1990)。這是一種動態算法，在考慮了兩兩序列之間的比較之後，可以得到一組序列的公有序列(consensus sequence)。去除載體後的樣品序列再用Phrap進行拼接。在拼接時，鹼基的測序質量也被考慮了，所得到的公有序列各鹼基的可信度，由組成該公有序列的樣品的測序質量計算得到。
實施例5基因注釋在大體得到基因組的大部分序列(完成工作框架圖)後，就需要對基因組進行注釋，包括進行開讀框架(Open Reading Frame，ORF)的預測，基因功能的預測，以及特殊RNA片段的分析等。
第一步採用預設參數的GLIMMER2.0(Delcher，A.L.，Harmon，D.1999)和ORPHEUS(Frishman，D.1998)軟體預測基因編碼序列，然後所有預測的開讀框和非編碼區(intergenic region)都用BLAST軟體(Altschul，S.F.et al.1997)與NCBI的無冗餘蛋白資料庫(non-redundant protein database)比較來發現可能漏掉的基因。在判斷一個基因的起始點時，將參考各種相關信息，如序列同源性，核糖體結合位點，可能的信號肽序列和啟動子序列等。如果在一個開讀框內出現多個啟動子時，一般採用第一個啟動子作為基因的起始點。採用TransTerm軟體(Ermolaeva，M.D.2000)在非編碼區預測不依賴於Rho(ρ)因子的轉錄終止子。如果該終止子位於一個基因的下遊區的太遠處，則可能暗示一個小基因的丟失或測序錯誤人為地縮短了該基因，可作為進一步分析的參考。在確定移框突變和點突變時，主要根據與資料庫中的蛋白質的相似性來判斷。如果出現一個蛋白質對應於兩個彼此相鄰的編碼序列的情況，則被認為是一個無活性基因(假基因pseudogenes)，因為這說明這兩個編碼序列之間由於突變而產生異常中止現象，進而使基因失去活性。所有分析結果再用Artemis sequence viewer軟體(Rutherford，K.et al.2000)進行手工分析。一些明顯與其它編碼序列有重疊的開讀框，長度小於150鹼基對並且在已有資料庫中沒有同源性和其中沒有明顯的啟動子或終止區域的開讀框將被去除。
蛋白質的功能片段(motif)和功能區域(domain)分別採用與Pfam、PRINTS、PROSITE、ProDom和SMART資料庫進行比對分析，結果再用InterPro資料庫(Apweiler，R.et al.2001)進行匯總分析。根據NCBI的COGs資料庫(Tatusov，R.L.et al.2001)並且參照其他資料庫的查詢結果來確定蛋白質在COGs分類中的功能分類和可能的代謝途徑。用TMHMM軟體(Krogh，A.et al.2001)來確認膜蛋白、ABC轉運蛋白和跨膜功能域。採用革蘭氏陰性菌為參數，用SIGNALP2.0軟體(Nielsen，H.et al.1999)分析信號肽區域。
(4)補洞在完成基因組的工作框架圖之後，就要進行更加困難的補洞工作，即完成整個基因組100％的測序，得到一個環形基因組。主要工作就是把前面得到的contig連接起來。這是一項十分具體而又繁雜的工作。主要方法包括
A.利用測序中的正反向測序樣品信息在測序過程中，我們有意對某些樣品進行了雙向測序，即同時測序某個插入片段的兩端，再將所得序列與其他序列一起進行拼接。由於這一對序列在基因組上的關係一定，其之間的距離大致已知，根據這一信息，一可以確認某段contig是否可靠，二是當這一對序列分別位於不同的contig上時，可以確定這兩個contig的方向關係和位置關係，為進一步設計實驗提供參考。
B.長插入片段及Cosmid末端測序基於同樣的原理，我們可以構建不同長度的插入片段文庫，只對其兩端測序，然後拼接，分析其具體位置。這些文庫包括長度為9-12Kb的長插入片段庫和20-40Kb左右的Cosmid文庫。具體分析方法同上所述。
C.PCR和末端延伸Walking實驗根據A和B所提供的contig方向和位置關係，進一步的生物化學實驗就可以進行了。如設計一對引物進行PCR擴增，或以某一contig末端序列合成引物進行末端延伸(Walking)來補洞等。
實施例6精氨酸抑制因子的製備和提純根據實施例中基因注釋得到的精氨酸抑制因子全長編碼序列(SEQ IDNO.1)，設計能擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的測序文庫的質粒DNA為模板，經PCR擴增後，在保證閱讀框正確的前提下重組至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。再將重組載體轉化入大腸桿菌DH5α中(轉化方法為CaCL2法或電轉化法)。篩選鑑定的到含有表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-ArgR。
挑取單菌落的工程菌DH5α-pGEX-2T-ArgR於3ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振搖培養37℃過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的LB培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中培養約3小時，至OD600達0.5後，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續於37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2×SDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達所需蛋白的工程菌。
按上述方法誘導表達所需蛋白的工程菌後，將細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS飽和的50％穀胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了所需蛋白的穀胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉澱加入100μl還原型穀胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，上清即為洗脫的蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在17006道爾頓處的蛋白質條帶即為精氨酸抑制因子。
序列表110杭州華大基因研發中心120耐高溫精氨酸抑制因子基因及其編碼的多肽和製備方法1401411602170PatentIn Version 3.12101211456212DNA213騰衝嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)220221gene222(1)…(456)223n＝a或g或c或t4001atgatgaagt tggcaaggca tgccaagatt ttagagataa tttctgaaaa agaaatagag60acgcaggaag agctggcagc agaacttcag aagagaggaa tagatgtcac acaggccacg 120gtgtctagag atattaaaga gcttcgcctc ataaaagttc ttacagaaga tggaaaaaga 180tacaaatatg cgccaatgac aaaagtagat actaatataa gtgaaagact tatgacttta 240ctttctgagt ccatagtcaa tgtggactat gctggaaaca tcatagtcat aaaaacgtta 300tcaggcagtg cttcagcagc agccgaagca attgatactc ttaattggaa aaatattgta 360ggcactattg ccggcgataa tactattttt gtccttgtga gaaaccagga ggatattcaa 420gaactggtgg agaagttcag aaaactcatg aagtag 4562102211151212PRT213騰衝嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)4002Met Met Lys Leu Ala Arg His Ala Lys Ile Leu Glu Ile Ile Ser Glu1 5 10 15Lys Glu Ile Glu Thr Gln Glu Glu Leu Ala Ala Glu Leu Gln Lys Arg20 25 30Gly Ile Asp Val Thr Gln Ala Thr Val Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu35 40 45Arg Leu Ile Lys Val Leu Thr Glu Asp Gly Lys Arg Tyr Lys Tyr Ala50 55 60Pro Met Thr Lys Val Asp Thr Asn Ile Ser Glu Arg Leu Met Thr Leu65 70 75 80Leu Ser Glu Ser Ile Val Asn Val Asp Tyr Ala Gly Asn Ile Ile Val85 90 95Ile Lys Thr Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ala Ala Ala Glu Ala Ile Asp100 105 110Thr Leu Asn Trp Lys Asn Ile Val Gly Thr Ile Ala Gly Asp Asn Thr115 120 125Ile Phe Val Leu Val Arg Asn Gln Glu Asp Ile Gln Glu Leu Val Glu130 135 140Lys Phe Arg Lys Leu Met Lys145 150
權利要求
1.一種分離的DNA分子，其特徵在於它是編碼具有耐高溫精氨酸抑制因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於所說的核苷酸序列編碼具有SEQ.ID NO.2中的胺基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與耐高溫精氨酸抑制因子相關。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於所說的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無義、插入、錯義。
4.一種分離出的多肽，其特徵在於它具有耐高溫精氨酸抑制因子活性。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於它具有SEQ ID No.2中的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
6.一種載體，其特徵在於它含有權利要求1中之DNA。
7.一種宿主細胞，其特徵在於它是用權利要求6所述載體轉化的原核細胞或真核細胞。
8.一種製備耐高溫精氨酸抑制因子的方法，其特徵在於該方法包括1)分離出編碼耐高溫精氨酸抑制因子基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1；2)構建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫精氨酸抑制因子的重組細胞；4)培養步驟3)中的重組細胞；5)分離、純化得到耐高溫精氨酸抑制因子。
全文摘要
本發明公開了一種耐高溫精氨酸抑制因子基因及其編碼的多肽和製備方法。它涉及編碼具有活性或其功能等同變異體的分離的DNA和利用重組DNA技術以所述分離的DNA生產具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽或其功能等同變異體。以騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析為基礎,克隆分離了耐高溫精氨酸抑制因子基因。該基因對於製備用於生產耐高溫精氨酸抑制因子的轉基因微生物或動植物,並回收穫得該基因編碼的酶有用。另外,本發明還提供了具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽的胺基酸序列及功能等同體。同時,提供了製備,分離,純化具有耐高溫精氨酸抑制因子活性的多肽的方法。
文檔編號C12N15/64GK1379091SQ0211136
公開日2002年11月13日 申請日期2002年4月12日 優先權日2002年4月12日
發明者汪建, 李蔚, 張麗敏, 王鵬, 王俊 申請人:杭州華大基因研發中心