MicroRNA-429在製備抗肝癌藥物中的應用的製作方法

2023-06-30 04:32:16 1

MicroRNA-429在製備抗肝癌藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及MicroRNA-429在製備抗肝癌藥物中的應用。本發明首次揭示miR-429在維持肝癌幹細胞特性中起到重要的作用。高表達miR-429能夠增強EpCAM+的肝癌幹細胞的增殖、自我更新以及腫瘤形成能力；抑制miR-429的表達能夠引起相反的效應。因此，miR-429可作為肝癌治療的新靶點，miR-429抑制劑可作為肝癌治療藥物，同時對肝癌復發及轉移起到預防作用。
【專利說明】MicroRNA-429在製備抗肝癌藥物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物製藥領域，更具體地，本發明涉及一種以microRNA-429(miR-429) 為靶點的抗肝癌藥物的製備和應用。

【背景技術】
[0002] 肝癌是常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，我國每年死於肝癌的患者佔全世界肝癌 死亡人數的45%。目前，關於肝癌發生的機制仍不清楚，而近年來的"幹細胞"理論在腫瘤的 研究方面引起了眾多學者的關注。
[0003] 腫瘤幹細胞假說認為只有很小一部分細胞有無限的增殖能力和分化潛能，具有 引起腫瘤發生、維持腫瘤生長、保持腫瘤異質性的能力，這樣的細胞叫腫瘤幹細胞（cancer stem cell，CSC)。它在腫瘤的發生、惡化、轉移、復發中起重要作用。目前，研究學者先後在 多種惡性腫瘤，如白血病、腦膠質瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、結腸癌、鼻 咽癌等實體腫瘤中鑑定分離到腫瘤幹細胞的存在[1-5]。
[0004] 國內外專家學者對肝癌幹細胞表面標誌物不斷進行著探究，研究表明EpCAM是高 致瘤性腫瘤細胞的一個標記[6-8]。譬如，Kimura等[9]發現肝癌EpCAM+亞群具有更強的 克隆形成率。體內致瘤實驗發現在超免疫缺陷NOD/SCID/Ycnull (NOG)鼠中，最少100個 EpCAM+細胞即能形成腫瘤，而EpCAM-細胞不能成瘤。
[0005] miRNAs是一種內源性的、長約22nt的RNA，它通過靶向mRNA導致其降解或翻譯抑 制而在動、植物中起到重要的調節作用。miRNAs廣泛存在於靈長類、嚙齒類、鳥類、魚類、蠅 類、蠕蟲類、植物、病毒中，從2002年有統計的200多種到2008年底的將近9000種，miRNAs 的發現呈現爆發性增長，並且不斷有新物種中的miRNAs被發現。人類miRNAs基因僅約佔 基因總數的2-3%，但卻能調控人體內1/3的蛋白表達，這種轉錄後調控作用直接影響了這 些靶基因的功能，參與了包括消化系統在內的多個系統的生理、病理過程。miRNAs在消化系 統中的作用涉及發育、老化、分泌、代謝、病毒感染、免疫反應、腫瘤等等方面，尤其是作為癌 基因或者抑癌基因在腫瘤發生發展中的作用顯的尤為重要。
[0006] 以前的研究表明，miR-200microRNA家族成員，尤其是miR-429在多種腫瘤中高表 達，並且對於保持上皮表型、誘導細胞基質上皮轉化起重要作用[10-14]。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供肝癌治療的新靶點。
[0008] 本發明的另一目的在於提供MicroRNA-429在製備抗肝癌藥物中的應用。
[0009] 本發明的另一目的在於提供以miR-429為靶點的小分子核酸藥物及其在肝癌治 療中的應用。
[0010] 在本發明的第一方面，提供一種用於治療肝癌的小分子核酸藥物。所述的藥物是 一類miR-429的抑制劑，通過抑制或阻止miR-429與其靶基因結合的物質，從而抑制EpCAM 陽性的肝癌幹細胞的增殖、自我更新及腫瘤形成能力，起到對肝癌的治療、預防復發及轉移 等效果。
[0011] 所述的miR-429抑制劑包括（但不限於）：miR-429的反義核酸、miR-429的鎖核 酸反義核酸、siRNA ;或攜帶或表達miR-429的反義核酸、miR-429的鎖核酸反義核酸、siRNA 的構建物（如表達載體）。
[0012] 所述的miR-429抑制劑是：包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示的反義核苷酸， 或其修飾形式包括（但不限於）：鎖核酸修飾、甲氧基化修飾、肽核酸修飾、硫代修飾、磷酸 骨架由磷脂連接骨架代替的修飾。
[0013] 本發明還提供一種miR-429的用途，用於作為篩選治療肝癌的潛在物質的靶標； 以及一種篩選治療肝癌的潛在物質的方法；較佳地，所述的肝癌是肝細胞癌或EpCAM+的肝 癌。
[0014] 所述篩選治療肝癌的潛在物質的方法，包括：
[0015] (1)用候選物質處理表達miR-429的體系；和
[0016] (2)檢測所述體系中miR-429的表達情況；
[0017] 其中，若所述候選物質可降低miR-429的表達，則表明該候選物質是治療肝癌的 潛在物質。
[0018] 再一個優選例中，所述篩選方法中，步驟（1)包括：在測試組中，將候選物質加入 到表達miR-429的體系中；和/或
[0019] 步驟⑵包括：檢測測試組的體系中miR-429的表達，並與對照組比較，其中所述 的對照組是不添加所述候選物質的表達miR-429的體系；
[0020] 如果測試組中miR-429的表達在統計學上低於（優選顯著低於，如低20%以上，較 佳的低50%以上；更佳的低80%以上）對照組，就表明該候選物是治療肝癌的潛在物質。
[0021] 在另一優選例中，所述的候選物質包括（但不限於）：針對miR-429設計的幹擾分 子、核酸抑制物、結合分子（如抗體或配體）、小分子化合物。
[0022] 在另一優選例中，所述的體系選自：細胞體系（如表達miR-429的細胞）（或細胞 培養物體系）、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。
[0023] 在另一優選例中，所述的方法還包括：對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗 和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對於治療肝癌有用的物質。
[0024] 本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖I、miR-429促進EpCAM+細胞的比例。
[0026] 圖2、過表達以及幹擾miR-429表達對Spheroids形成的影響。
[0027] 圖3、miR-429抑制劑對腫瘤生長的抑制作用。

【具體實施方式】
[0028] 本發明人經過長期研究，首次揭示miR-429在維持肝癌幹細胞特性中起到重要的 作用。高表達miR-429能夠增強EpCAM+的肝癌幹細胞的增殖、自我更新以及腫瘤形成能 力。相反的，在EpCAM+的肝癌幹細胞中抑制miR-429的表達能夠引起相反的效應。因此， miR-429可作為肝癌治療的新靶點，抑制miR-429的小分子核酸藥物可用於肝癌患者術後 輔助治療的有效手段，同時對肝癌復發及轉移起到預防作用。
[0029] miR-429 及其用途
[0030] 本發明中，所述的miR-429是具有如下所示核酸序列的小核糖核酸（SEQID N0:1)：
[0031] miR-429:5'-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3' ；
[0032] miR-429是為一種本領域已知的microRNA (miRNA)小分子，其對於調控RNA是有用 的。然而本領域之前對於miR-429與肝癌的幹細胞特性之間的相關性沒有研究。
[0033] miR-429可以被分離自細胞，或者可通過人工合成的方式獲得。在得知了 miR-429 或其前體的序列後，本領域人員可以方便地製備獲得miR-429或其前體。
[0034] 在本發明的具體實施例中，利用細胞生物學實驗及模型動物體內實驗等方法，發 現以miR-429為靶點的小分子核酸藥物在製備抗腫瘤藥物中的應用方面的新功能，並對其 進行了如下研究：
[0035] 1、通過磁珠分選出EpCAM+的肝癌幹細胞，通過miR-429過表達以及對其進行幹 擾，驗證其對於肝癌幹細胞特性的影響。
[0036] (a)其中使用的miR-429過表達試劑中至少包含以下任一序列：
[0037] SEQ ID N0:1 :5, -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3，
[0038] SEQ ID N0:2 :5' -TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3'
[0039] 使用的過表達試劑為包含上述任一序列的核酸片段或經過修飾的核酸片段；
[0040] (b)其中使用的miR-429抑制劑中包含以下任一序列：
[0041] SEQ ID N0:3 :5, -ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3'
[0042] SEQ ID N0:4 :5' -ACGGTTTTACCAGACAGTATTA-3'
[0043] 使用的抑制劑為包含上述任一序列的核酸片段或經過修飾的核酸片段；
[0044] (c)過表達實驗表明miR-429能夠促進肝癌幹細胞的自我更新、增殖和化療抵抗； 在EpCAM+的肝癌幹細胞中抑制miR-429的表達能夠引起相反的效應。
[0045] 2、通過NOD-SCID老鼠皮下荷瘤實驗，體內水平驗證抑制miR-429的小分子核酸藥 物（包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4任一序列的核酸片段或經過修飾的核酸片段）在肝 癌治療中的作用。研究發現抑制miR-429的小分子核酸藥物對於肝癌的生長具有顯著抑制 作用。
[0046] 以上實驗結果判定，miR-429是一個肝癌分子治療新的靶點，抑制miR-429的小分 子核酸藥物可用於治療肝癌，並預防術後復發及轉移。
[0047] 因此，miR-429是一個新的、與肝癌的幹細胞特性密切相關的藥物靶點。針對 miR-429的各種治療手段可以作為治療肝癌的新穎和有效的手段。
[0048] miR-429為靶點的藥物篩選
[0049] 在得知了 miR-429與肝癌的幹細胞特性的密切相關性後，可以基於該特徵來篩選 抑制miR-429的物質。之後，可從所述的物質中找到對於治療肝癌真正有用的藥物。
[0050] 因此，本發明提供一種篩選治療肝癌的潛在物質的方法，所述的方法包括：用候 選物質處理表達miR-429的體系；和檢測所述體系中miR-429的表達或活性；若所述候選 物質可抑制miR-429的表達或活性，則表明該候選物質是治療肝癌的潛在物質。所述的表 達miR-429的體系例如可以是細胞（或細胞培養物）體系，所述的細胞可以是內源性表達 miR-429的細胞；或可以是重組表達miR-429的細胞。所述的表達miR-429的體系還可以 是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系（如動物模型，優選非人哺乳動 物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等）等。
[0051] 在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易於觀察到miR-429的表達或活 性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的表達miR-429的 體系。
[0052] 作為本發明的優選方式，所述的方法還包括：對獲得的潛在物質進行進一步的細 胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對於治療肝癌真正有用的物質。
[0053] 另一方面，本發明還提供了採用所述篩選方法獲得的治療肝癌的潛在物質。這 些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便於人們最終可以從中篩選出能夠對於抑制 miR-429的表達和活性，進而治療肝癌有用的物質。
[0054] miR-429調節劑及其用途
[0055] 基於本發明人的上述新發現，本發明提供了一種miR-429抑制劑的用途，用於制 備治療肝癌的組合物。所述的miR-429抑制劑還用於：抑制EpCAM陽性的肝癌幹細胞的增 殖、自我更新及腫瘤形成能力。
[0056] 如本文所用，所述的"miR-429抑制劑"包括了核酸抑制物、拮抗劑、下調劑、阻滯 齊U、阻斷劑等，只要它們能夠下調miR-429或其前體的表達水平。它們可以是化合物、化學 小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平（包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水 平的。
[0057] 所述的miR-429抑制劑是指任何可阻止miR-429 (特別是其中的結合關鍵位點） 或其前體與其靶向序列結合、降低miR-429或其前體的活性、降低miR-429或其前體的穩定 性、下調miR-429或其前體的表達、減少miR-429或其前體有效作用時間的物質，這些物質 均可用於本發明，作為對於下調miR-429有用的物質，從而可用於治療肝癌、抑制EpCAM陽 性的肝癌幹細胞的增殖、自我更新及腫瘤形成能力。例如，所述的抑制劑是：核酸抑制物，蛋 白抑制劑，抗體，配體，核酸酶，核酸結合分子，只要其能夠下調miR-429的表達。
[0058] 作為本發明的一種優選方式，所述的抑制劑是核酸抑制物。較佳地，所述的核酸抑 制物通過阻止miR-429與其祀向序列結合，從而發揮作用。所述的核酸抑制物例如選自（但 不限於）：miR-429的反義核酸，miR-429的鎖核酸反義核酸；肽核酸；siRNA (沉默miR-429 前體）。
[0059] 作為本發明的優選方式，所述的miR-429的抑制劑是miR-429的反義 核酸。如本文所用，"反義核酸"又稱為"反義核酸"或"反義寡核苷酸（AS-ONs， antisense-oligonucleotides) "或"反義藥物"，是指長度約為15-30個鹼基的DNA分子、 RNA分子它們的經修飾的形式或它們的類似物，可與mRNA互補。
[0060] 本領域人員均了解，根據本發明提供的反義核酸，可以進行適當的變化並保留其 活性，這些變化形式均可用於本發明。任何可起到抑制或沉默miR-429的作用的反義核酸 都是可用於本發明的，其類型不限於DNA或是RNA。例如，所述的miR-429的反義核酸是與 miR-429的序列基本上（較佳地為完全）互補的序列。例如，所述的miR-429的反義核酸 與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列具有80%以上的相同性，較佳地具有85%以上 的相同性，更佳地具有90%以上的相同性，最佳地具有95%以上的相同性，如具有96%、97%、 98%或99%以上的相同性；或者所述的miR-429的反義核酸是SEQ ID NO:3或SEQID N0:4 所示序列的片段；它們均具有SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:4所示序列的反義核酸相同的功 能。
[0061] 現有技術中已經指出了一些反義核酸的變化形式是可取的，它們也可以針對相 應的祀序列發揮抑制作用。如 Design and delivery of antisense oligonucleotides to block microRNA function in cultured Drosophila and human cells(NATURE PROTOCOLS ;V0L. 3N0. 10 ;2008 ; 1537-1549)文獻綜述了多個研究，認為一般而言，在反義核 酸的兩邊延長一些鹼基是可以的。而在反義核酸和miRNA間親和性很高（如鎖核酸修飾） 時，反義核酸可以被截短到約2/3長度。
[0062] 在本發明中，所述的"反義核酸"還包括經修飾的反義核酸，所述的修飾基本不改 變反義核酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義核酸的活性、穩定性或治療效果。對反義 核酸的修飾包括但不限於：鎖核酸修飾、甲氧基化修飾、肽核酸修飾、硫代修飾、磷酸骨架由 磷脂連接骨架代替的修飾，這些修飾均是本領域技術人員易於實現的。優選地，所述的修飾 為鎖核酸修飾。
[0063] 藥物組合物
[0064] 本發明還提供了一種組合物，它含有有效量的miR-429抑制劑，以及藥學上可接 受的載體。所述的組合物可用於治療肝癌、抑制EpCAM陽性的肝癌幹細胞的增殖、自我更新 及腫瘤形成能力。任何前述的miR-429或其抑制劑均可用於組合物的製備。
[0065] 如本文所用，所述"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和 /或動物所接受的量。所述"藥學上可接受的載體"指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦 形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身並不是必要的活性成分，且施用後沒 有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的 載體可含有液體，如水、鹽水、緩衝液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充 齊U、潤滑劑、助流劑、潤溼劑或乳化劑、PH緩衝物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染 試劑。
[0066] 在得知了所述miR-429抑制劑的用途後，可以採用本領域熟知的多種方法來將所 述的miR-429抑制劑或含有其的藥物組合物給藥於哺乳動物。包括但不限於：皮下注射、肌 肉注射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等。
[0067] 本發明所述的miR-429製劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程 度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定（例如 通過臨床試驗）。所述的因素包括但不限於：所述的miR-429抑制劑的藥代動力學參數例 如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫 狀況、給藥的途徑等。
[0068] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照製造廠商所建議的條件。
[0069] 實施例1、miR-429過表達片段和抑制片段的製備
[0070] I、miR-429過表達試劑
[0071] 根據miR-429序列，設計miR-429過表達試劑，選自以下任一序列：
[0072] SEQ ID N0:1 :5, -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3,；
[0073] SEQ ID N0:2 :5' -TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3' ；
[0074] 其中使用的miR-429抑制劑，選自以下任一序列：
[0075] SEQ ID N0:3 :5, -ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3,；
[0076] SEQ ID N0:4 :5' -ACGGTTTTACCAGACAGTATTA-3，。
[0077] 實施例2、miR-429過表達以及對其進行幹擾，驗證其對於肝癌幹細胞特性的影響
[0078] EpCAM為肝癌幹細胞的表面標誌物。用美天旎（Miltenyi Biotech)磁珠結合 EpCAM抗體，從人肝癌細胞系HCCLM3中分選得到了 EpCAM+肝癌幹細胞，隨後外源轉入 miR-429過表達片段或抑制片段，具體實驗方法及結果如下：
[0079] 在 24 孔培養皿中接種適量 HCCLM3 (EpCAM+)細胞（500 ii 1DMEM+10%(v/v) FBS)，使 之培養24h後匯合率達到60-70%，在不同I. 5ml離心管中分別加入50 ill生理鹽水，分別 加入I y g miR-429過表達核酸片段或抑制片段和2 ill JetPEI並混勻，隨即將PEI溶液加 入DNA溶液，振蕩混勻，室溫放置15-20min，將質粒DNA-脂質體複合物滴加至細胞表面，置 5%C02，37 °C 孵箱內培養 24-48h。
[0080] 在HCCLM3 (EpCAM+)細胞中轉入IOOnM miR-429過表達片段4天後，用流式細胞儀 Annexin V法分析，結果，得到EpCAM+細胞的比例從3. 86%上升到60. 8%，如圖1 (應用過表 達核酸片段SEQ ID NO: 2)。該結果說明miR-429促進肝癌細胞的EpCAM+亞群的形成率，促 進腫瘤形成。
[0081] 接下來，觀察過表達以及幹擾miR-429表達後對分選出的肝癌幹細胞 HCCLM3 (EpCAM+)形成 Spheroids 的影響。腫瘤多細胞球（Multicellular TumorSpheroids) 是一種經典的體外三維腫瘤細胞培養模型，通過模擬三維細胞網絡、細胞與基質、細胞與細 胞之間的相互作用，從而能模擬人類腫瘤組織中相應的病理生理學特性，依據其形態和生 長動力學特性，其近似於腫瘤發生早期的無血管瘤或實體瘤組織中遠離血管的區域）。將 轉入miR-429過表達片段或抑制片段後的3000個肝癌幹細胞接種到低粘附培養板上，培養 10天後發現與各自的對照相比，Spehroids數量與miR-429表達成正比，如圖2 (分別應用 過表達核酸片段SEQ ID NO: 2和抑制片段SEQ ID NO:4)。該結果說明，抑制miR-429表達 可以顯著降低Spheroids數量，從而可抑制腫瘤組織生長。
[0082] 實施例4、miR-429抑制片段在肝癌動物模型治療中的應用
[0083] 為了在體內水平進一步驗證miR-429抑制劑對於肝臟EpCAM+T-ICs腫瘤形成後的 治療效果，本發明人製備了 NOD-SCID小鼠皮下荷瘤模型。
[0084] 穩定表達螢光素酶的HCCLM3細胞系的製備方法如下：
[0085] (1)使用JetPEI (購自法國PolyPlus公司，貨號101-10N)轉染試劑將 pGL3-control vector質粒(購自美國普洛麥格公司，貨號為E1741)轉染入HCCLM3肝癌細 胞中；
[0086] (2)轉染後48小時，使用抗生素G418 (購自美國Life Technology公司，濃度為 800ug/ml)進行篩選；
[0087] (3)篩選3周後獲得穩定表達螢光素酶的HCCLM3肝癌細胞系（HCCLM3-Luc)，用於 後續試驗。
[0088] NOD-SCID小鼠皮下荷瘤模型建立方法如下：
[0089] (1)磁珠分選出HCCLM3-Luc (EpCAM+)細胞，種6孔板中；
[0090] (2) HCCLM3-Luc (EpCAM+)細胞使用 40 ii M 的 miR-429 抑制劑處理一天；
[0091] (3)陽性對照組是HCCLM3-Luc (EpCAM+)細胞使用生理鹽水處理一天；
[0092] (4) 0? 25-0. 5% 的胰酶消化細胞，900rpm，3min，PBS 重懸細胞；
[0093] (5)細胞計數，調整體積，使每100 ill PBS中含2 X IO4個細胞；
[0094] (6)將含2 X IO4的HCCLM3-Luc (EpCAM+)細胞的miR-429抑制劑處理組和生理鹽 水處理組分別種植到NOD-SCID小鼠(購自第二軍醫大學動物中心）軀幹右側皮下；
[0095] (7)記錄腫瘤發生情況，腫瘤細胞種植6周成瘤後，進行活體成像，斷頸處死動物， 收集腫瘤樣本及血漿樣本。
[0096] 活體成像分析方法如下：
[0097] (1)荷瘤小鼠麻醉後5分鐘使用天平稱量體重。按照每公斤體重15mg螢光素酶底 物（Beetle Luciferin, Potassium Salt,購自美國普洛麥格公司，貨號為E1605)的標準，注 射相應體積的30mg/ml濃度的螢光素酶底物溶液。
[0098] (2)注射螢光素酶底物溶液後將小鼠置於小動物活體成像儀（PE公司）中對麻醉 小鼠進行成像。
[0099] (3)化學發光檢測參數為：成像時間10分鐘，bin值為4*4。
[0100] (4)可見光檢測參數為：成像時間30毫秒，bin值為4*4。
[0101] (5)成像後採用活體成像儀內置軟體對化學發光信號的強度和面積進行分析，t匕 較不同組別小鼠的化學發光信號值。
[0102] 結果發現，miR-429抑制片段對於腫瘤的生長具有顯著抑制作用，如圖3(應用抑 製片段 SEQ ID NO:4)。
[0103] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範 圍。
[0104] 參考文獻
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【權利要求】
1. miR-429的抑制劑的用途，用於製備治療肝癌的藥物。
2. 如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的藥物還用於：抑制EpCAM陽性的肝癌 幹細胞的增殖、自我更新及腫瘤形成能力。
3. 如權利要求1所述的用途，其特徵在於，miR-429抑制劑是抑制或阻止miR-429與其 靶基因結合的物質。
4. 如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的miR-429抑制劑包括：miR-429的反 義核酸、miR-429的鎖核酸反義核酸、siRNA ;或 攜帶或表達miR-429的反義核酸、miR-429的鎖核酸反義核酸、siRNA的構建物。
5. 如權利要求4所述的用途，其特徵在於，所述的miR-429抑制劑包括：包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示序列的反義核苷酸，或其修飾形式。
6. 如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的肝癌是肝細胞癌或EpCAM陽性的肝 癌。
7. -種miR-429抑制劑，其特徵在於，其是：包含SEQ ID NO: 3或SEQ IDNO:4所示序 列的反義核苷酸，或其修飾形式。
8. -種miR-429的用途，用於作為篩選治療肝癌的潛在物質的靶標；較佳地，所述的肝 癌是肝細胞癌或EpCAM+的肝癌。
9. 一種篩選治療肝癌的潛在物質的方法，所述方法包括： (1) 用候選物質處理表達miR-429的體系；和 (2) 檢測所述體系中miR-429的表達情況； 其中，若所述候選物質可降低miR-429的表達，則表明該候選物質是治療肝癌的潛在 物質。
10. 如權利要求9所述的方法，其特徵在於，步驟（1)包括：在測試組中，將候選物質加 入到表達miR-429的體系中；和/或 步驟（2)包括：檢測測試組的體系中miR-429的表達，並與對照組比較，其中所述的對 照組是不添加所述候選物質的表達miR-429的體系； 如果測試組中miR-429的表達在統計學上低於對照組，就表明該候選物是治療肝癌的 潛在物質。
【文檔編號】A61K48/00GK104415351SQ201310413413
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月11日 優先權日:2013年9月11日
【發明者】王紅陽, 陳磊, 李亮, 楊文 , 唐境 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學東方肝膽外科醫院