一種高親和力的抗cd20單克隆抗體的製作方法

2023-07-01 00:29:51 2

專利名稱：一種高親和力的抗cd20單克隆抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程產品領域，更具體地，本發明公開了一種具有高親和力的抗 CD20單克隆抗體和其在製備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術：
惡性腫瘤是當今世界嚴重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致死亡中高居第二 位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin's lymphoma, NHL)是臨床最常見的淋巴系統惡性腫瘤， 其中B細胞來源的約佔85 %，好發於青壯年，發病率和病死率呈逐年上升趨勢。根據病情 特點，NHL可分為低、中、高三度。其中低度和部分中度NHL病程進展緩慢，統稱為惰性NHL。 它們對首次化療敏感，但很容易復發或耐藥，當再次化療或放療時，療效明顯降低，因而被 認為是難以治癒的惡性腫瘤。近年來，單克隆抗體及其導向治療NHL的臨床試驗研究取得 了重大進展，其中被廣泛使用且富有成效的是抗CD20的單抗製劑。CD20抗原是一種B細胞 分化抗原，僅位於前B細胞和成熟B細胞，它在95%以上的B細胞性淋巴瘤中表達，且表面 密度很高，而在造血幹細胞、血漿細胞和其他正常組織中不表達。更為重要的是，CD20分子 在與單克隆抗體結合後，無顯著內化及脫落，故成為治療B細胞淋巴瘤的理想靶點[^cchi S,Federico M,Dastoli G,Fiorani C,Vinci G,Clo V,Casolari B.Treatment of B—cell non-Hodgkin' s lymphoma with anti CD 20 monoclonal antibodyRituximab. Crit Rev Oncol Hematol，2001，37(1) :13-25]。
目前採用抗CD20抗體治療非霍奇金淋巴瘤已取得了較好的療效。 Rituxan(Rituximab, C2B8)為美國基因科技公司研製的以⑶20為靶點的單克隆抗體，它 是一種人鼠嵌合基因工程抗體，包含了鼠單克隆抗體的可變區基因和人抗體的恆定區基因 [Reff ME, Carner K，Chambers KS, Chinn PC，Leonard JE, Raab R，Newman RA, Hanna N， Anderson DR. Depletionof B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood. 1994,83(2) :435-45]。Rituxan 已於 1997 年 11 月獲 FDA 的批准 上市，用於復發性或頑固性低度或濾泡性非霍奇金淋巴瘤的臨床治療[Leget GAiCzuczman MS.Use of rituximab, the new FDA-approved antibody. Curr Opin Oncol. 1998 ；10 548-551]。儘管C2B8抗體在臨床治療中已顯示出較好的療效，仍有52%的病人對C2B8治 療不產生反應。因此，尋求更為有效用於治療B淋巴瘤的CD20抗體藥物顯得尤為迫切。
最新的實驗數據表明，對Rituximab耐受的細胞通常變現為⑶20表達減低； Bcl-2 ^iifiiiii^ [Title !Development of Rituximab-Resistant LymphomaClones withAltered Cell Signaling and Cross-Resistance to Chemotherapy. Author Jazirehi, A. R. ；Vega, Μ. I. ；Bonavida, B. Source :Cancer Research，2007，67(3) 1270-1281；Title -Acquirement ofRituximab Resistance in Lymphoma Cell Lines Is Associated with Both Global CD20 Gene andProtein Down-Regulaion Regulaed at the Pretranscriptional and Posttranscriptional Levels. Author :Czuczman， M. S. ；Ole jniczak, S. ；Gowda, A.(…)Source :Clinical Cancer Research，2008，14 (5)1561-1570]。而抗體親和力的提高能夠增強抗體的特異性，提高檢測靈敏度，增強抗體的功 能同時降低抗體的用量。因此，通過在臨床上廣泛使用具有較好治療效果的Rituximab的 基礎上，通過有限的幾個突變，顯著的提高Rituximab的親和力，從而提高Rituximab對腫 瘤的殺傷效果。發明內容
本發明的申請人進行了大量的實驗，採用基因工程技術構建了多種具有高親和力 的抗⑶20單克隆抗體突變體。這些突變抗體與Rituximab相比具有更高的親和力活性，能 夠更加有效的識別CD20抗原。高親和力的抗CD20單克隆抗體突變體可用於製備治療B細 胞淋巴瘤的藥物。與Rituximab相比，突變抗體親和力提高，抗體特異性增強，對腫瘤的殺 傷效果也顯著提高。
本發明公開了
1，一種高親和力的抗⑶20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體包括如SEQ ID NO 5 所示的C2B8重鏈可變區和/或如SEQID NO 6所示的輕鏈可變區的下述任何一個或多個氨 基酸位點上的胺基酸取代，所述位點為重鏈可變區第57、102位，輕鏈可變區第93位胺基酸 的位置。
2，上述抗CD20單克隆抗體，其特徵在於所述一個或多個胺基酸位點上由穀氨酸、 賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸取代。
3，上述1或2所述的抗⑶20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體結合⑶20的親和 力與Rituximab相比提高至少2倍。
4，上述3所述的抗⑶20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體的重鏈可變區(VH)的 胺基酸序列為 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :11， 或SEQ ID N0:14，輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列為SEQID NO :6或SEQ ID NO :12。
5，上述1或2所述的抗⑶20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體結合⑶20的親和 力與Rituximab相比提高至少4倍。
6，上述5所述的抗⑶20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體的重鏈可變區(VH)的 胺基酸序列為SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:11或SEQ ID N0:14，輕鏈可變區(VL)的胺基酸序 列為 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
7，上述1或2所述的抗⑶20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體結合⑶20的親和 力與Rituximab相比提高至少10倍。
8，上述7所述的抗⑶20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體的重鏈可變區(VH)的 胺基酸序列為SEQID NO :14，輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列為SEQ ID NO 6或SEQ IDNO 12。
9，一種製劑，含有上述1至8任一所述的抗⑶20單克隆抗體和可藥用的載體。
10，上述1至9任一所述的抗⑶20單克隆抗體或其製劑在製備抗B細胞淋巴瘤的 藥物中的用途。
11，上述10的用途，其中B細胞淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤。
12，上述11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤為低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。
13，上述10的用途，其中B細胞淋巴瘤為慢性淋巴性白血病。
更具體地，本發明的申請人通過大量實驗，首先參照美國專利6，399，061公開的 抗CD20單抗資料及序列，構建了抗CD20嵌合抗體C2B8的輕、重鏈可變區和恆定區基因，然 後通過表達、純化，獲得嵌合抗體C2B8。根據圖1所示的胺基酸突變位點，採用overlapPCR 的方式對嵌合抗體C2B8進行構建，其構建與表達、純化的方法與未突變的嵌合抗體C2B8相 同。所述突變抗體包括重鏈可變區和/或輕鏈可變區的下述任何一個或多個胺基酸位點上 的胺基酸取代，所述位點為重鏈可變區第57、102位，輕鏈可變區第93位胺基酸的位置，取 代胺基酸為穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
對於本發明，任何合適的真核表達載體都可以使用，這些載體可以為 pcDNA3. 1 (+)，pDRl, pDHFF 之一。
本發明的申請人對上述C2B8突變抗體進行了親和力檢測。實驗結果表明，申請 人構建的C2B8抗體的親和力與市售的Rituxiamb的親和力相似。相對於未突變的原本 C2B8抗體或市售的Rituxiamb，提高親和力程度較高的單點突變抗體為重鏈可變區第57 位穀氨酸或第102位賴氨酸取代的突變抗體(H57DE或H102I)，親和力提高了至少4倍左 右；重鏈可變區第102位精氨酸或絲氨酸或蘇氨酸取代的突變抗體(H102YR或H102YS或 H102YT)，親和力提高了 2倍左右；輕鏈可變區第93位精氨酸取代的突變抗體(L93NR)，其 親和力也提高了。針對上述重鏈可變區和/或輕鏈可變區的突變點進行兩點或三點的組合 突變，親和力均提高了 10倍以上，最終提高親和力程度最高的組合突變抗體為重鏈可變 區第57位穀氨酸、第102位賴氨酸，以及輕鏈可變區第93位精氨酸三個突變點同時取代的 突變抗體(H57DE，H102YK, L93NR)。
以上實驗結果說明，高親和力的C2B8突變抗體，其最佳突變位點為重鏈可變區第 57、102位，輕鏈可變區第93位胺基酸的位置；取代的胺基酸為穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲 氨酸或蘇氨酸，其中，最佳取代的胺基酸為穀氨酸、賴氨酸或精氨酸。並且，多個單點組合突 變抗體的親和力要高於單點突變抗體。
申請人還針對Rituximab突變體(C2B8突變抗體)的功能進行研究。通過對 Rituximab突變體的ADCC功能檢測，隨著Rituximab突變體親和力的提高，ADCC功能也顯 著增強，三點組合突變Rmi^8的ADCC殺傷活性顯著高於Rituximab。通過對Rituximab突 變體凋亡功能檢測，結果顯示，親和力的提高不能顯著的增加Rituximab突變體的凋亡功 能，但是三突變體RmirtS卻顯示出了較強的凋亡能力；雖然加入不同濃度的caspase (半胱 氨酸蛋白酶)抑制劑可以部分的抑制RmirtS引起的凋亡，但是其仍然顯示出了較強的促凋 亡能力。通過研究高親和力Rituximab突變體(Rmut8)對Rituximab抵制型細胞的殺傷， 結果顯示，Rmi^8不能提高對Rituximab抵制型細胞的⑶C殺傷，但是能夠引起較強的ADCC 殺傷；RmirtS在Rituximab抵制型細胞株上仍然表現出較強的促凋亡能力。通過高親和力 Rituximab突變體體內小鼠生存實驗，結果顯示，Rmut8不僅僅在正常的Daudi細胞處理組 顯示出較強的抗腫瘤效果(P < 0. 001)，而且在Rituximab抵制型細胞株(Daudi-R)上，顯 示出良好的治療效果(P < 0. 01)。
本發明公開上述高親和力的C2B8突變抗體，可以和藥學上可以接受的輔料一起 組成藥物製劑組合物從而更穩定地發揮療效，製劑可為製藥領域常用的混懸、水針、凍乾等 製劑，優選水針或凍幹製劑，對於本發明公開的上述C2B8突變抗體的水針或凍幹製劑，藥 學上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶液穩定劑、等滲調節劑和緩衝液之一或其組合，其中表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80)； poloxamer (如poloxamer 188) ；Triton ；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；十四烷基、 亞油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics ；M0NAQUAT 等，其加入量應使C2B8突變抗體顆粒化 趨勢最小，溶液穩定劑可以為糖類，包括還原性糖和非還原性糖，胺基酸類包括穀氨酸單鈉 或組氨酸，醇類包括三元醇、高級糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其組合，溶液穩定劑的加入 量應該使最後形成的製劑在本領域的技術人員認為達到穩定的時間內保持穩定狀態，等滲 調節劑可以為氯化鈉、甘露醇之一，緩衝液可以為TRIS、組氨酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液之一。
上述製劑為包含高親和力的C2B8突變抗體的組合物，在對包括人在內的動物給 藥後，抗腫瘤效果明顯。具體來講，對腫瘤的預防和/或治療有效，可以作為預防和/或治 療腫瘤的藥物使用。
本發明中C2B8突變抗體及其組合物在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因 病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種 種情況，總給藥量不能超過一定範圍。具體講靜脈注射的劑量是0.廣3000mg/天。
本發明公開的C2B8突變抗體及其組合物還可以和其他的抗腫瘤藥聯合給藥，用 於腫瘤的治療，這些抗腫瘤藥包括1、細胞毒類藥物(1)作用於DNA化學結構的藥物烷 化劑如氮芥類、亞硝尿類、甲基磺酸酯類；鉬類化合物如順鉬、卡鉬和草酸鉬等；絲裂黴素 (MMC) ； (2)影響核酸合成的藥物二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等； 胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(5FU、FT-207、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成酶抑制劑 如6-巰基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制 劑如阿糖胞苷(Ara-C)和健擇(Gemz)等；(3)作用於核酸轉錄的藥物選擇性作用於DNA模 板，抑制DNA依賴RNA聚合酶，從而抑制RNA合成的藥物如放線菌素D、柔紅黴素、阿黴素、 表阿黴素、阿克拉黴素、光輝黴素等；(4)主要作用於微管蛋白合成的藥物紫杉醇、泰索 帝、長春花鹼、長春瑞濱、鬼白礆類、高三尖杉酯鹼；( 其他細胞毒藥門冬醯胺酶主要抑 制蛋白質的合成；2、激素類抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制劑 氨魯米特、蘭特隆、來曲唑、瑞寧德等；抗雄激素氟它氨RH-LH激動劑/拮抗劑諾雷德、依 那通等；3、生物反應調節劑主要通過機體免疫功能抑制腫瘤幹擾素；白細胞介素-2 ；胸腺 肽類；4、單克隆抗體Cetuximab (C225)；赫賽汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin) ；5、 其他括一些目前機制不明和有待進一步研究的藥物；細胞分化誘導劑如維甲類；細胞凋亡 誘導劑。本發明公開的C2B8突變抗體及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合 聯合用藥。
本發明所指的B細胞淋巴瘤，包括B細胞慢性淋巴細胞白血病，B細胞原淋巴細胞 淋巴瘤，濾泡淋巴瘤，毛細胞白血病，Burkitt淋巴瘤，淋巴漿細胞淋巴瘤等，這裡不再一一 列舉。
本發明所稱的抗腫瘤藥物，指具有預防和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫 瘤生長相關症狀發展的延遲和/或這些症狀嚴重程度的降低，它進一步還包括已存在的腫 瘤生長伴隨症狀的減輕並防止其他症狀的出現，還也減少或防止轉移。


圖1. Rituxiamb (又稱C2B8抗體)重鏈和輕鏈可變區的核苷酸序列和胺基酸序列。圖中第一行序列表示Rituxiamb的重鏈、輕鏈的鹼基序列，第二行序列表示胺基酸序 列。其中有下劃線的地方表示構建突變體的突變點。
圖2. biacore檢測Rituxiamb及C2B8抗體突變體。不同突變體按照相同濃度，等 倍比稀釋在50μ Ι/min流速和25°C環境下進行檢測。圖中所示為，不同C2B8抗體突變體在 相同濃度下的sensorgram圖。WT，表示申請人自行構建的未突變的C2B8抗體。
圖3. Rituximab突變體結合飽和曲線。檢測125碘標記的不同rituximab突變體 對Daudi細胞的結合飽和曲線。對不同的抗體突變體按照相同濃度等倍比稀釋，37°C孵育 2h，通過離心分離，檢測結合在細胞上的碘標記的抗體片段。飽和結合實驗的數據通過 非線性最小二乘法進行擬合併確定結合常數。
圖4. Rituximab突變體ADCC功能檢測。圖中A-D分別顯示的是E T為50 1， 25 1,5 1和1 1四種比率下，ADCC殺傷作用與不同濃度Rituximab突變體的關係。
圖5. Rituimab突變體凋亡功能檢測。圖5A顯示不同條件下的Rituximab突變 體的凋亡功能檢測結果；圖5B-C顯示加入不同濃度的caspase抑制劑ZVAD (圖5B)和 VDVAD(圖5C)後，Rituximab突變體的凋亡功能檢測結果。
圖6. Rituximab突變體對rituximab抵制型細胞株的殺傷情況。圖6A顯示Daudi 或者Daudi-R細胞與不同濃度的抗體(Rituximab或者Rmut8)作用，Rituximab抵制型細胞 株的CD20表達下降；圖6B顯示Raji-R和Daudi-R與10 μ g/mL的抗體和人補體(1 10) 作用的CDC殺傷情況；圖6C顯示Raji-R和Daudi-R與10 μ g/mL的抗體和PBMC (外周血單 核細胞)(E T = 40 1)作用的ADCC殺傷結果；圖6D顯示Rituximab或者Rmut8 (10 μ g/ mL)在有二抗交聯(20yg/mL的羊抗人KF(ab' )2的片段)或者無交聯的情況下的細胞 凋亡情況。
圖7.高親和力Rituximab突變體小鼠生存率實驗。每日觀察小鼠狀況，當出 現後肢癱瘓情況時，處死該小鼠。生存曲線做圖參照Kaplan-Meier的方法進行，組間比 較採用 log-rank 檢驗進行分析[Bland JM, Altman DG. Survival probabilities (the Kaplan-Meier method). BMJ. 1998 ；317 :1572.]。
具體實施方式
以下實施例僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施 例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質拉的方法，將編碼蛋白的基因 插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對於本領域 中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J.，Fritsch，Ε.F. and Maniais，Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual， 2nedition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
實施例1.人抗體輕、重鏈恆定區基因的克隆
用淋巴細胞分離液(鼎國生物技術發展公司產品)分離健康人淋巴細胞，用 iTrizol 試劑 Qnvitrogen 公司產品)提取總 RNA，根據文獻(Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. HieterPA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P. Cell. 1980Nov ；22(1 Pt 1) 197-207.)禾口文獻(The nucleotide sequence of a human immunoglobulin Cgamma1 gene. Ellison Jff,Berson BJ,Hood LE. Nucleic Acids Res. 1982 Jul 10 ； 10 (13) 4071-9.)報導的序列分別設計引物採用RT-PCR反應擴增抗體重鏈和輕鏈恆定區基因。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收並克隆到PGEM-T載體(promega公司)中，測序驗證後確 認獲得了正確的克隆。SEQ ID NO 1和SEQID NO 2分別顯示了重鏈恆定區(CH)的核苷酸 序列和胺基酸序列。SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4分別顯示了輕鏈恆定區(CL)的核苷酸序 列和胺基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。
實施例2.抗⑶20嵌合抗體C2B8的表達載體構建
參照美國專利6，399，061公開的抗⑶20單抗資料及序列，委託上海生工生物工程 有限公司全基因合成抗CD20單克隆抗體C2B8重鏈可變區基因(C2B8VH)及輕鏈可變區基 因(C2B8VL)。圖1顯示了 C2B8重鏈和輕鏈可變區的核苷酸序列和胺基酸序列。
以C2B8VH基因和pGEM_T/CH載體為模板通過重疊PCR合成嵌合抗體重鏈基因，反 應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環；72°C 10分鐘。並使 此嵌合抗體重鏈基因的5』端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，3』端含有翻譯 終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I。信號肽基因序列為ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCC TCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC。最後瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物，回收目的條帶 並克隆到PGEMT載體中，篩選陽性克隆測序。挑選測序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶 切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收嵌合抗體重鏈片段C2B8VHCH，與用HindIII和EcoR I酶切 的質粒pcDNA3. 1 (+)(美國hvitrogen公司產品)進行連接，構建成嵌合重鏈真核表達載 體 pcDNA3. 1(+)(C2B8VHCH)。
以C2B8VL基因和pGEM_T/CL載體為模板通過重疊PCR合成嵌合抗體輕鏈基因，反 應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環；72°C 10分鐘，得到 PCR產物C2B8VLCL，其5』端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，，3』端含有翻譯終 止密碼TAA和限制酶位點EcoR I。信號肽基因序列為ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATTTTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCT TCA GTC ATA ATG TCC AGA GGA。挑選測序正確的克隆 用HindIII和EcoR I酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收嵌合抗體輕鏈片段C2B8VLCL，與用 HindIII和EcoR I酶切的質粒pcDNA3. 1載體(美國hvitrogen公司產品)進行連接，構 建成嵌合輕鏈真核表達載體pcDNA3. 1 (C2B8VLCL)。
實施例3.嵌合抗體的穩定表達與純化
於3. 5cm組織培養皿中接種3 X IO5CHO-Kl細胞(ATCC CRL-9618)，細胞培養 至90% -95%融合時進行轉染取質粒1(^8(質粒？00嫩3.1(+) (C2B8VHCH)4y g，質粒 pcDNA3. 1 (C2B8VLCL) 6 μ g)禾口 20 μ 1 Lipofectamine2000 Reagent (Invitrogen 公司產品) 分別溶於500 μ 1無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20 分鐘以使DNA-脂質體複合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養基替換培養皿中的含血 清培養基，然後將形成的DNA-脂質體複合物加入到板中，CO2孵箱培養4小時後補加2ml含 10%血清的DMEM完全培養基，置於(X)2孵箱中繼續培養。轉染進行24h後細胞換含600 μ g/ ml G418選擇培養基篩選抗性克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆羊抗 人IgG (Fe)包被於ELISA板，4°C過夜，用2% BSA-PBS於37°C封閉池，加入待測的抗性克隆 培養上清或標準品(Human myeloma IgGl，κ )，37°C溫育2h，加入HRP-羊抗人IgG ( κ )進 行結合反應，37°C溫育lh，加入TMB (四甲基聯苯胺)於37°C作用5min，最後用H2SO4終止8反應，測A45tl值。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用ftOtein A親和柱 (GE公司產品)分離純化嵌合抗體C2B8。將純化抗體用PBS進行透析，最後以紫外吸收法 定量確定純化後抗體的濃度。
實施例4. C2B8抗體突變體的構建及表達
採用overlapPCR的方式進行C2B8抗體突變體的構建，其構建與表達、純化的方法 與C2B8嵌合抗體相同。構建的抗體突變體共10個，分別為Rmutl至RmutlO，突變抗體的重 鏈恆定區(CH)和輕鏈恆定區(CL)的胺基酸序列分別見SEQ ID NO 2和SEQID NO 4，重鏈 可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列分別見SEQ ID NO 5 14。
實施例5. C2B8及突變體的biacore鑑定
將SA晶片(GE公司)在50 μ 1/min的PBS溶液中25 °C平衡30min，然後用IM NaCl 50mMNa0H的活化液活化3次，每次Imin ；將biotin標記的抗原肽(為人⑶20分子 膜外區的部分片段，製備方法請見Title :Structural Basis for Recognition of CD20 by TherapeuticAntibody Rituximab. Author :Du, J. ；Wang, H. ； Zhong, C.(…)Source: J Biol Chem,2007,282(20) :15073-15080)稀釋成終濃度為 1μ g/ml,10y 1/min 的流速包被 ARu = 1000 ；然後用PBS緩衝液50 μ 1/min平衡lOmin。將平衡後的晶片用0. 04%的生物 素溶液封閉晶片。將抗體等兩倍比稀釋五個濃度，50 μ 1/min上樣75sec，然後用PBS解離 IOmin0圖2顯示了在相同樣品濃度下biacore檢測的sensorgram圖；具體檢測親和力數 值見表1。其中，我們構建的C2B8抗體的親和力與市售的Rituxiamb的親和力相似。
相對於未突變的原本C2B8抗體，提高親和力程度較高的單點突變抗體為=Rmutl 和Rmut5,親和力分別提高了 6. 08和3. 96倍；Rmut2, 3,4,親和力提高了近2倍。最終，親 和力提高最高的為三點組合突變體RmutS，其親和力最終提高了 15. 47倍。
相對於市售的Rituxiamb，提高親和力程度較高的單點突變抗體為=Rmutl和 Rmut5,親和力分別提高了 7. 73和5. 04倍；Rmut2, 3,4,親和力提高了 2倍多。最終，親和力 提高最高的為三點組合突變體RmutS，其親和力最終提高了 19. 68倍。
表1. biacore檢測抗體突變體的親和力
權利要求
1.一種高親和力的抗⑶20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體包括如SEQ ID N0:5所 示的C2B8重鏈可變區和/或如SEQ ID NO :6所示的輕鏈可變區的下述任何一個或多個氨 基酸位點上的胺基酸取代，所述位點為重鏈可變區第57、102位，輕鏈可變區第93位胺基酸 的位置。
2.權利要求1所述抗CD20單克隆抗體，其特徵在於所述一個或多個胺基酸位點上由谷 氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸取代。
3.權利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體結合CD20的親和 力與Rituximab相比提高至少2倍。
4.權利要求3所述的抗CD20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體的重鏈可變區的氨基 酸序列為 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :14，輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO 6或SEQ ID NO :12。
5.權利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體結合CD20的親和 力與Rituximab相比提高至少4倍。
6.權利要求5所述的抗CD20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體的重鏈可變區的胺基酸 序列為SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 14，輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
7.權利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體結合CD20的親和 力與Rituximab相比提高至少10倍。
8.權利要求7所述的抗CD20單克隆抗體，其特徵在於所述抗體的重鏈可變區的胺基酸 序列為SEQ ID NO :14，輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO 6或SEQ ID NO :12。
9.一種製劑，含有上述1至8任一所述的抗CD20單克隆抗體和可藥用的載體。
10.權利要求1至9任一所述的抗CD20單克隆抗體或其製劑在製備抗B細胞淋巴瘤的 藥物中的用途。
11.權利要求10的用途，其中B細胞淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤。
12.權利要求11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤為低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。
13.權利要求10的用途，其中B細胞淋巴瘤為慢性淋巴性白血病。
全文摘要
本發明公開了一種具有高親和力的抗CD20單克隆抗體和其在製備抗腫瘤藥物中的用途。所述抗體包括C2B8重鏈可變區和/或輕鏈可變區的下述任何一個或多個胺基酸位點上的胺基酸取代。這些突變抗體與Rituximab相比具有更高的親和力活性，抗體特異性增強，對腫瘤的殺傷效果也顯著提高。
文檔編號C07K16/28GK102030826SQ20091005795
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月25日 優先權日2009年9月25日
發明者侯盛, 李博華, 王皓, 趙磊, 郭亞軍 申請人:上海抗體藥物國家工程研究中心有限公司