一種適用於多種食物中有機磷酸酯阻燃劑含量檢測的方法與流程
2023-06-17 09:19:11
本發明屬於有機磷酸酯阻燃劑的分析檢測領域，涉及一種適用於不同食物基質的多種有機磷酸酯阻燃劑同時快速測定的方法。
背景技術：
有機磷酸酯阻燃劑（organophosphateflameretardants，opfrs）具有良好的阻燃性能，且兼有增塑、潤滑等多種功能，用途十分廣泛。隨著全球阻燃劑市場的不斷擴大，以及滷系阻燃劑（如多溴二苯醚類等）因環境安全性等原因被限制使用，opfrs作為一種優秀的替代品，其社會需求和產量均呈快速增長趨勢。我國是opfrs生產大國，年產能已超10萬噸，而且使用量也在快速增長。絕大多數opfrs以添加劑形式在不同材料（家具、建材、紡織品以及電子產品等）中使用，導致其在生產和使用過程中容易向周圍環境釋放。opfrs的這種持續性排放已經造成了其在各種環境介質（大氣、灰塵、水體等）中的廣泛殘留。部分opfrs具有強烈生物效應，具有潛在人體健康威脅。
食物在生產、儲存、加工等過程中不可避免地受到食物接觸材料和環境介質中的opfrs汙染。早在上世紀80年代，就有學者發現食物中tnbp、tphp和tehp的殘留，並評估了人群的膳食暴露量。然而直至目前，仍僅有少量研究調查了opfrs在魚類、家禽、母乳等有限的人類食物樣品中的殘留。制約食物中opfrs分析的另一個原因是缺乏可靠、靈敏的分析方法。如上述魚類、禽類中opfrs研究採用了微波輔助萃取（mae）-凝膠滲透色譜（gpc）/固相萃取（spe）兩步淨化，gc-ms檢測的方法；母乳樣品採用了加速溶劑萃取（ase）-gpc/柱層析淨化，uhplc-ms/ms檢測，然而這些方法，一般僅適用於特定的樣品種類，且均需耗費大量溶劑且處理時間長，同時萃取時可能引入大量脂肪、蛋白等生物大分子，需額外的淨化步驟（gpc等）來降低基質效應的幹擾。食物樣品種類多，基質複雜，一般前處理手段難以完全排除基質效應對樣品痕量opfrs檢測的幹擾，且通常一種前處理方法也難以滿足對不同樣品基質的處理要求。
anastassiades等於2003年開發了經典的quechers方法，樣品經均質後，用乙腈基質分散萃取溶劑，採用n-丙基乙二胺（psa）等吸附劑去除絕大部分幹擾物，並通過離心去除淨化，具有快速（quick）、簡單（easy）、廉價（cheap）、高效（effective）、可靠（rugged）、安全（safe）的特點。該方法問世以來，被眾多學者改進推廣，已成功應用於農產品等生物介質中農藥以及多種汙染物殘留的分析。該方法受不同食物樣品基質影響較小，且採用乙腈為萃取劑能有效降低脂肪等大分子的共萃出，簡化後續淨化步驟，且樣品處理設備簡單、溶劑用量少、快速。然而目前仍沒有該方法在食物樣品中opfrs的應用研究報導。本方法基於quechers方法原理，建立了一種滿足多種食物基質的前處理方法，並利用uplc-ms/ms的強大定性定量功能，實現了10種常用opfrs的多殘留快速檢測。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種適用於不同食物基質的opfrs多殘留快速檢測方法，以彌補現有技術應用範圍窄、溶劑消耗量大、基質幹擾嚴重、靈敏度低等方面的不足。
本發明採用超聲輔助萃取樣品中的目標物，操作簡單快捷、溶劑使用量少；無水mgso4+psa+c18的分散固相萃取淨化，能夠有效去除基質中的幹擾物質；uplc-ms/ms具有較快的分析速度，較低的檢測限和高選擇性和靈敏度，適用於痕量汙染物的檢測。
本發明採用的技術方案如下：
一種適用於不同食物基質的opfrs多殘留快速檢測方法，包括以下步驟：
（1）食物樣品處理：取食物樣品，勻漿；
（2）提取：取勻漿樣品到離心管中，加入內標混合液，平衡；加入提取溶劑，渦旋混勻，超聲萃取；
（3）淨化：於步驟（2）離心管中加入無水nacl和無水mgso4，渦旋混勻，離心，取上清液至新離心管，加入基質分散固相萃取劑以及無水mgso4，渦旋混勻，離心，取上清液氮吹濃縮，用醇溶劑替換並定容，最後過濾膜，所得樣品液待測定；
（4）配置基質匹配內標標準工作溶液：將空白食物混合樣品按上述步驟(1)至(3)處理，用所得樣品基質溶液配置opfrs內標標準工作溶液，用醇定容並過濾；
（5）樣品檢測：
採用超高效液相色譜-串聯四級杆質譜測定步驟(3)、(4)所得溶液中的opfrs。
優選地，步驟（1）食物樣品處理：取適量洗淨陰乾的新鮮食物樣品可食用部分置於玻璃試管中，用勻漿機充分勻漿；
優選地，步驟（2）提取：準確移取1.0-2.0g上述步驟（1）獲得的勻漿樣品於具塞玻璃離心管中，加入10-25ng內標混合液，平衡15-30min；加入4-5ml0.5%甲酸-乙腈溶液，渦旋混勻1min，超聲萃取15-30min；
優選地，步驟（3）淨化：於步驟(2)離心管中加入400-500mg無水nacl和400-500mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min-1離心5min，取上清液至新離心管，加入基質分散固相萃取劑psa30-60mg和c1820-40mg以及200-400mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min-1離心5min，取上清液氮吹濃縮，用甲醇溶劑替換並定容至0.5ml，最後過0.22μm濾膜，所得樣品液待測定；
優選地，步驟（4）配置基質匹配內標標準工作溶液：將空白食物混合樣品按上述步驟（1）至（3）處理，用所得樣品基質溶液配置opfrs內標標準工作溶液，甲醇定容並過濾；標準工作溶液中各目標物系列濃度範圍在0.1-100ng·ml-1，各標準工作溶液中內標標準物濃度相同，為20-50ng·ml-1；
優選地，步驟（5）樣品檢測：採用超高效液相色譜-串聯四級杆質譜測定步驟（3）、（4）所得溶液中的opfrs。
優選地，步驟（1）所述食物包括魚肉、畜禽肉、蔬菜、穀物、牛奶、雞蛋、豆腐的一種或多種的混合。
優選地，所述opfrs包括tmp、tep、tcep、tcpp、tdcpp、tphp、tnbp、tbep、tcrp、tehp中的一種或多種的混合，更優選地，所述opfrs同時包括tmp、tep、tcep、tcpp、tdcpp、tphp、tnbp、tbep、tcrp、tehp。
優選地，步驟（2）中有機溶劑中添加適量的酸，所述的酸為有機酸，選自甲酸、乙酸、三氟乙酸等，所述的有機溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈等。
優選地，步驟（3）中分散固相萃取劑為同時包含psa、c18；更優選地，步驟（3）中無水nacl、無水mgso4、分散固相萃取劑psa、c18的用量分別為400-500mg，400-500mg，30-60mg，20-40mg。
優選地，步驟（3）中樣品轉移時，用1-2ml0.5%甲酸-乙腈溶液潤洗原容器，潤洗液離心取上清液合併到新容器。
優選地，步驟（3）中濃縮樣品時氮吹至近幹，剩餘樣品液體積50-100μl時進行溶劑替換。
優選地，步驟（4）中混合食物樣品由與步驟（1）中等量的魚肉、畜禽肉、蔬菜、穀物、牛奶、雞蛋、豆腐的一種或多種的混合充分勻漿而成，優選地，選自由等量魚肉、雞肉、豬肉、蔬菜、牛奶充分勻漿而成的。
優選地，步驟（4）中基質匹配內標標準工作溶液中目標化合物濃度系列在0.1-100ng·ml-1，內標物濃度與步驟（2）添加量一致，在20-50ng·ml-1。
優選地，步驟（5）中目標物檢測方法包括定性檢測和定量檢測；
優選地，定性檢測：檢測步驟（3）得到的樣品液中目標化合物，若目標物總離子流色譜峰保留時間與基質標準工作溶液中一致，且定性、定量離子對均在此保留時間檢出，則判斷檢出該目標化合物。
優選地，定量檢測：檢測步驟（4）得到的各濃度基質匹配內標工作液，以基質標準工作液中各濃度目標物與各自內標物定量離子對色譜峰面積比值對其相應濃度進行回歸分析，得到內標標準工作曲線；將在相同條件下測得的步驟（3）樣品液中目標物與各自內標物定量離子對色譜峰面積比值代入標準曲線，得到樣品液中目標物含量，然後根據樣品液所代表的試樣質量及回收率計算得到樣品中目標物含量。
優選地，步驟（5）檢測條件為：
色譜參數：
色譜柱：watersbehc18柱（2.1mm×100mm×1.7μm）；
柱溫：40℃；
進樣量：2μl；
流動相：a：超純水+0.1%甲酸，b：乙腈+0.1%甲酸；
流速：0.3ml·min-1；
表1：梯度洗脫程序
質譜參數：
離子源：電噴霧電離，正電離模式（esi+）；
質譜檢測方式：多反應選擇離子監測（mrm）；
毛細管電壓：3.5kv；
脫溶劑氣：氮氣，流速800l·h-1，溫度為350℃；
碰撞氣：氬氣；
表2各opfrs的定性離子對、定量離子對、碰撞能量
本發明具有如下優點：
（1）本發明採用改進quechers方法對食物樣品進行前處理，一方面以乙腈為基礎萃取劑，降低基質幹擾物的共萃取，同時使用psa和c18兩種分散萃取吸附劑，有效去除不同性質的幹擾雜質，大大提高了方法靈敏度；另一方面大大降低方法溶劑使用量少、操作簡單、快速、重現性好，適合大通量的食物opfrs殘留快速分析要求。方法基質效應在92.3-116.1%（除三苯甲基磷酸酯為65.9%），平均回收率78.6-127.3%，相對標準偏差3.1-9.7%。
（2）本發明採用超高效液相色譜-串聯四級杆質譜對目標物進行定性定量分析，在11min內實現10種opfrs及其內標物同時快速分析，比普通液相色譜和氣相色譜-質譜大大縮短了分析時間，適合大通量的食物檢測，定性、定量更加準確。方法定量限為0.05-0.42ng·g-1。
（3）本發明可同時滿足魚肉類、畜禽肉類、蔬菜類、穀物類、蛋奶類等不同類型的食物分析。
附圖說明
圖1為由等量魚肉、雞肉、豬肉、蔬菜、牛奶充分勻漿而成的混合食物基質匹配內標標準溶液10種opfrs（10ng·ml-1）總離子流色譜圖
圖2為由等量魚肉、雞肉、豬肉、蔬菜、牛奶充分勻漿而成的混合食物基質匹配內標標準溶液7種內標（20ng·ml-1）總離子流色譜圖
圖3為實施例雞肉樣品中實測10種opfrs總離子流色譜圖
圖4為實施例雞肉樣品中7種基質添加內標（添加濃度20ng·ml-1）總離子流色譜圖
圖5為實施例青菜樣品中實測10種opfrs總離子流色譜圖
圖6為實施例青菜樣品檢測內標標準溶液7種基質添加內標（添加濃度20ng·ml-1）總離子流色譜圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限定本發明的範圍。
儀器和試劑
（1）儀器
超高效液相色譜（acquity，美國waters公司），電噴霧電離（esi）串聯三重四極杆質譜（xevotq-s，美國waters公司）；氮吹濃縮儀（n-evap-12，美國organomation公司）；t10高速分散機（德國ika公司）；低速離心機（centrifuge5430，德國eppendorf公司）；分析天平（220g/0.1mg，me204，瑞士mettler-toledo公司）。
（2）試劑
使用溶劑均為lc-ms級。純甲醇購自美國fisherscientific，乙腈和二氯甲烷（dichloromethane，dcm）購自j.t.baker公司。甲酸（99%）購自百靈威。填料psa購自美國agilent公司，c18購自美國welch公司，分析純無水mgso4、nacl均用乙腈洗滌、晾乾，無水mgso4及nacl450℃烘烤4h以去除可能殘留的有機物。
opfrs標準品分別購自德國dr.ehrenstorfer公司和美國accustandard公司。內標標準品分別購自美國cambridgeisotopelaboratories和sigma-aldrich。
標準品分別用乙腈配製質量濃度為1-2mg·ml-1的儲備液，於-20℃保存。配製混合標準溶液和低濃度單標時用甲醇稀釋。
實施例1
本實施例著重於分析方法基質效應、加標回收率和製作標準工作曲線。
步驟（1）：混合樣品處理
取等量魚肉、雞肉、豬肉、青菜、牛奶各10g，混合後充分勻漿；
步驟（2）：提取
準確稱取勻漿液1.0g於10ml具塞玻璃離心管，分別編號為a1-a7，b1-b7，其中a1-a7分別添加50μl不同濃度（1、5、10、50、100、500、1000ng·ml-1）標準物質混合溶液和20μl內標混合溶液（1000ng·ml-1），a1-a7和b1-b7均加入4ml0.5%甲酸-乙腈，渦旋混勻1min，超聲萃取10-15min。另取10ml離心管，編號c1-c7，加入4ml含0.5%甲酸的乙腈，渦旋混勻1min，超聲萃取10-15min。
步驟（3）：淨化
a1-a7，b1-b7和c1-c7中均加入400mg無水nacl和400mg無水mgso4，渦旋混勻1min。在3000r·min-1下離心5min，取上清液至相應編號的新離心管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗後，再次離心取上清液，合併兩次上清液。在所有樣品上清液中加入50mgpsa，30mgc18，200mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min-1離心5min後取上清液至相應編號的玻璃氮吹管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗後，再次離心取上清液，合併兩次上清液，氮吹濃縮至近幹，a1-a7樣品用甲醇復溶至0.5ml，b1-b7和c1-c7樣品分別加入50μl不同濃度（1、5、10、50、100、500、1000ng·ml-1）標準物質混合溶液和20μl內標混合溶液（1000ng·ml-1），用甲醇定容至0.5ml。所有樣品過0.22μm濾膜，所得樣品液待測定。
步驟（3）：檢測
樣品檢測方法參數同發明內容說明。
步驟（4）：標準曲線繪製
將樣品系列a1-a7，b1-b7及c1-c7均以各目標化合物與相應內標物定量離子對的色譜峰面積比為縱坐標，目標物濃度為橫坐標，繪製標準曲線，其中曲線b為標準物質工作曲線，各曲線相關係數r2分別為a：0.985-0.999，b：0.996-0.999，c：0.993-0.999。
步驟（5）：方法基質效應、加標回收率、方法定量限的計算
根據各響應曲線的斜率，可以分別計算方法基質效應（matrixeffect，me）、絕對回收率（absoluterecovery，ra）、相對回收率（relativerecovery，rr）：
公式1
公式2
公式3
其中slopea、slopeb、slopec分別為樣品a、樣品b和樣品c得到經內標校正的相對響應曲線的斜率。
質譜儀器檢測限（instrumentdetectionlimits，idls）計算方法為：連續測定5次進樣的不同濃度（c：0.5、1、5ng·ml-1）溶劑加標樣品的儀器絕對響應值平均值和相對標準偏差（relativestandarddeviation，rsd），檢測限計算公式為：
公式4
其中為響應值在99%置信區間，自由度為5情況下的t檢驗分布區間值。取不同加標濃度計算值的最小值作為idl。並根據idl和相應的相對回收率計算得到方法定量限（methodquantificationlimits,mqls）。計算公式為：
公式5
本實施例中各opfrs方法基質效應、加標回收率、儀器檢測限和方法定量限如表3。
表3方法基質效應、回收率及檢測限
實施例2
本實施例為本發明應用於雞肉中的opfrs檢測。
步驟（1）：雞肉樣品處理
取洗淨後雞胸肉5g，充分勻漿；
步驟（2）：提取
準確稱取雞肉勻漿液1.0g共3份分別於10ml具塞玻璃離心管中，分別添加20μl內標混合溶液（1000ng·ml-1），加入4ml0.5%甲酸-乙腈，渦旋混勻1min，超聲萃取10-15min。
步驟（3）：淨化
平行樣品中均加入300mg無水nacl和300mg無水mgso4，渦旋混勻1min。在3000r·min-1下離心5min，取上清液至相應新離心管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗後，再次離心取上清液，合併兩次上清液。上清液中加入40mgpsa，40mgc18，200mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min-1離心5min後取上清液至相應編號的玻璃氮吹管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗後，再次離心取上清液，合併兩次上清液，氮吹濃縮至近幹，樣品用甲醇復溶至0.5ml，樣品過0.22μm濾膜，所得樣品液待測定。
步驟（4）：檢測
樣品檢測方法參數同發明內容說明。
實施例3
本實施例為本發明應用於青菜中的opfrs檢測。
步驟（1）：青菜樣品處理
取洗淨後青菜5g，充分勻漿；
步驟（2）：提取
準確稱取1青菜勻漿液1.0g共3份分別於10ml具塞玻璃離心管中，分別添加20μl內標混合溶液（1000ng·ml-1），加入4ml0.5%甲酸-乙腈，渦旋混勻1min，超聲萃取10-15min。
步驟（3）：淨化
平行樣品中均加入300mg無水nacl和400mg無水mgso4，渦旋混勻1min。在3000r·min-1下離心5min，取上清液至相應新離心管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗後，再次離心取上清液，合併兩次上清液。上清液中加入50mgpsa，30mgc18，200mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min-1離心5min後取上清液至相應的玻璃氮吹管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗後，再次離心取上清液，合併兩次上清液，氮吹濃縮至近幹，樣品用甲醇復溶至0.5ml，樣品過0.22μm濾膜，所得樣品液待測定。
步驟（4）：檢測
樣品檢測方法參數同發明內容說明。