培育快速生長轉基因動物的方法
2023-06-17 04:09:46 2
專利名稱：培育快速生長轉基因動物的方法
技術領域：
本發明涉及動物育種，特別涉及應用基因工程技術研製快速生長動物養殖品種的方法。
魚類育種是漁業生產中的重要環節，高產、優質、抗逆養殖品種的研製和培養是加速漁業發展的有力保障。傳統的魚類品種選育是一個漫長的過程，加之物種遺傳壁壘和育種資源的限制，已不能滿足日益增長的社會需求。1982年，應用基因轉移技術，將生長激素基因導入小鼠受精卵，獲得快速生長的轉基因小鼠，該研究成果預示了基因工程育種的巨大潛力(Palmiter,R.et al,1982,Nature 300,611615)。但在豬、牛、羊等畜牧養殖品種轉移外源生長激素基因，未能得到預期的生長性狀改善(Westhusin,M.1997,NatureGenetics 17.4-5)。我們將人生長激素基因導入鯉魚受精卵，研製出世界首例快速生長的轉基因魚(Zhu,Z.et al,1985,Z.angew.Ichthyol.1,31-34)。除了個別的轉生長激素基因鮭魚實驗外(Delvin,R.H.et al,1994,Nature,371,209-210)，其它各種轉生長激素基因魚的快速生長效應均沒有預期的顯著。這一出乎預想的結果有多方面的原因。一方面，生物的生長是一個複雜的過程，受到多種基因產物影響，生長激素只是其中之一；另一方面，生長的調節要求相關基因表達和在時空上的協同作用。通過轉移單一生長激素基因的方法，以求改良動物生長性狀的目的是難以實現的。
生長激素(GH)和胰島素樣生長因子(IGF)是調節脊椎動物生長的兩個重要因子。已有的研究證實，生長激素刺激動物肝臟等靶器官細胞產生胰島素樣生長因子，後者促進蛋白質合成及骨骼肌生長；體內生長激素或胰島素樣生長因子的含量對生長激素基因的表達均起調控作用。因此，生長激素和胰島素樣生長因子是調節生長的兩個協同因子。
本發明採用外源生長激素基因和胰島素樣生長因子基因同步轉移方法，將兩個基因導入魚受精卵中，通過兩者表達產物的協同作用，大大促進轉基因魚個體的生長，由此篩選和培育快速生長的魚類養殖新品系，以達到應用於漁業生產的目的。
為實現本發明的目的，其技術方案是基於魚類生長的多因子調節特點，以及生長激素和胰島素樣生長因子在魚類生長調節中的協同作用。採用DNA體外重組技術，將魚類的生長激素基因和胰島素樣生長因子基因分別與魚類的基因表達強啟動子拼接，構建「全魚」重組基因轉移載體。將兩種「全魚」重組基因轉移載體同步導入魚受精卵，使之整合到由此發育而成的受體魚染色體基因組中。在強啟動子的驅動下，外源生長激素基因和胰島素樣生長因子基因得以有效表達，並協同發揮作用。應用多聚酶鏈反應(PCR)技術和逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)技術，鑑定外源基因穩定整合併有效表達的陽性轉基因魚群體。在此基礎上，篩選具顯著快速生長性狀的轉基因魚，培育繁殖，建立快速生長的轉基因魚新品系。
有益效果1、「全魚」生長激素重組基因和「全魚」胰島素樣生長因子重組基因整合到魚染色體基因組中，並有效表達。在兩種魚類生長調節重要因子的協同作用下，轉基因魚可獲得顯著的快速生長效應。我們對黃河鯉受精卵同步轉移「全魚」生長激素重組基因和「全魚」胰島素樣生長因子重組基因，轉基因黃河鯉最大個體體重是對照魚平均體重的3.4倍(魚苗生長118天，最大實驗魚2750g，最大對照魚1414g)。
2、在同等條件下，轉生長激素基因魚更有效地利用餌料，特別是更有效地利用低蛋白質餌料，具有更高的蛋白質合成能力。魚體乾物質和蛋白質含量分別提高1.6％和3.3％，而脂肪含量降低8.5％。
3、穩定整合在魚染色體中的外源基因可通過生殖腺系細胞傳遞給後代。
附圖
「全魚」生長激素重組基因轉移載體pCAgcGH和「全魚」胰島素樣生長因子重組基因轉移載體pCAsIGFc示意圖，CA為鯉魚肌動蛋白基因啟動子調控順序，gcGH為草魚生長激素結構基因部分，sIGF-Ic為鮭魚胰島素樣生長因子-I的cDNA。
實施例即本發明的方法與步驟1、基因轉移載體構建轉移載體基因元件包括本實驗室克隆的鯉魚6-肌動蛋白基因啟動子(CA)和草魚生長激素基因(gcGH)，以及引進的鮭魚胰島素樣生長因子基因-I的cDNA,(sIGF-Ic)。質粒載體為pUC118。採用PCR技術將gcGH和sIGF-Ic分別與CA精確連接，構建「全魚」重組基因轉移載體pCAgcGH和pCAsIGFc。見附圖。
2、外源基因轉移用限制性內切酶EcoRⅠ將重組基因轉移載體線性化，用胰蛋白酶消化去除黃河鯉魚受精卵卵膜，採用顯微注射方法，在第一次卵裂前將混合外源基因同時導入受精卵動物極，導入基因劑量5×105拷貝/卵，導入基因的受精卵及去卵膜的受精卵在實驗室無菌環境中孵化。
3、轉基因魚鑑定篩選轉基因魚經室外魚池飼養，進行個體標記。取尾鰭DNA，採用PCR技術檢測外源基因gcGH和sIGF-I的整合；製備肝臟RNA，採用RT-PCR技術檢測外源基因gcGH和sIGF-I的表達，鑑定轉基因陽性魚，篩選快速生長轉基因陽性魚，培育繁殖，進而建立快速生長轉基因魚品系。
4、轉基因魚營養及代謝測定用三種等能的合成鯉魚餌料(分別含40％、30％和20％的蛋白質及相應的30％、40％和50％的碳水化合物)飽和投餵魚8周，測定魚的體重、餌料吸收、消化率和軀體組成的變化。
權利要求
應用基因轉移技術的一種培育快速生長轉基因動物的方法，其特徵是將外源生長激素基因和胰島素樣生長因子基因分別與基因表達強啟動子拼接，構建重組基因轉移載體，以此兩種重組基因轉移載體同步導入受體動物受清卵，使之整合到由此發育而成的受體動物染色體基因組中，經鑑定篩選培育出快速生長的轉基因動物群體。
全文摘要
生物的生長是一個複雜的過程,受到多種基因產物影響,因此,通過轉移單一生長激素基因的方法,難以實現動物生長性狀的改良目的。本發明採用協同基因同步轉移方法,將脊椎動物生長調節中的兩個重要因子－生長激素和胰島素樣生長因子的重組基因同時導入受體動物受精卵中,外源基因在染色體中的整合、表達,在其產物的協同作用下,促進轉基因動物個體的生長。
文檔編號C12N15/63GK1217384SQ9710930
公開日1999年5月26日 申請日期1997年11月17日 優先權日1997年11月17日
發明者朱作言, 汪亞平, 崔宗斌, 張甫英, 陳尚萍 申請人:中國科學院水生生物研究所