由肝素衍生的多糖混合物、其製備方法以及含有它們的藥物組合物的製作方法

2023-06-16 02:17:16

專利名稱：由肝素衍生的多糖混合物、其製備方法以及含有它們的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及由肝素衍生得到的多糖混合物、它們的製備方法以及含有它們的藥物組合物。
肝素是一種動物源的硫酸化粘多糖混合物，這種混合物主要因其抗凝血和抗血栓形成性能而得到應用。
然而，肝素本身的缺陷制約著其應用。特別是它的高抗凝血活性(抗IIa活性)可能引起出血。
人們曾提出通過肝素酯的鹼解聚作用來得到低分子量肝素(EP40144)；但是，這些產物還是具有高的抗IIa活性。
在US 6 384 021中，也曾描述過極低分子量的肝素。然而，在其中的實施例中測得的抗Xa活性都沒有超過120IU，並且測得的抗Xa/抗IIa比是15-50。
在WO 0208295中，採用與US 6384021不同的方法製備出極低分子量的肝素，這些肝素的活性是100-150IU，並且在一些應用實施例中測定的抗Xa/抗IIa比也是非常高的。
儘管如此，人們仍需要提高這類藥物的抗Xa活性，尤其是使其活性達到150IU/mg以上，以及提高抗Xa/抗IIa比，因此，需要研製新的肝素衍生物製備方法。
因此，本發明的一個目的是通過改進現有技術中描述的方法、特別是通過控制這種解聚步驟時的水百分數，從而來提高抗Xa活性與抗Xa/抗IIa比。由此得到的肝素具有極好的抗血栓形成活性，其抗Xa活性也與肝素的抗Xa活性相近，同時還減少了出血危險性，而且抗IIa活性也非常低。同時，本發明產品的半衰期顯著高於肝素的半衰期。
因此，本發明的目的是一些由肝素衍生得到的新多糖混合物，它們對活化因子X(因子Xa)和活化因子II(因子IIa)的選擇性活性優於肝素。
應該理解到，可以將平均分子量1500-3000道爾頓的多糖混合物稱之低聚糖。
因此，本發明的目的是這些硫酸化低聚糖混合物，它們具有組成肝素的多糖的一般結構，還具有下述特徵-它們的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性是120-200IU/mg，抗IIa活性小於10IU/mg，抗Xa活性/抗IIa活性的比大於30，-組成這些混合物的低聚糖含有2-26個糖單元，在一個末端有4，5-不飽和糖醛酸2-O-硫酸酯單元，並且含有下式的六糖ΔIIa-IIs-Is 在本發明描述的低聚糖混合物中含有的六糖ΔIIa-IIs-Is是一種對ATIII具有高親合性的序列，其特徵在於抗Xa活性高於740U/mg。
本發明中描述的低聚糖混合物呈鹼金屬或鹼土金屬鹽形式。
對於鹼金屬或鹼土金屬鹽，優選鈉、鉀、鈣和鎂鹽。
可以採用高壓液相色譜法，使用串聯雙柱，例如以商品名TSK G3000XL和TSK G2000 XL銷售的高壓液相色譜儀，測定平均分子量。採用折光計進行檢測。使用的洗脫劑是硝酸鋰，流速是0.6ml/min。採用瓊脂糖-聚丙烯醯胺凝膠層析法(IBF)分餾依諾肝素(AVENTIS)製得的標準品校正這種系統。根據Barrowcliffe等人，《Thromb.Res.》，12，27-36(1977-78)或D.A.Lane等人，《Thromb.Res.》，12，257-271(1977-78)描述的方法進行製備。採用GPC6軟體(Perkin Elmer)計算這些結果。
根據Teien等人，《Thromb.Res.》，10，399-410(1977)描述的發色底物醯胺解方法，使用低分子量肝素的第一個國際標準作為標準測定了抗Xa活性。
採用Anderson L.O.等人，《(Thromb.Res.》，15，531-541(1979)描述的技術，使用低分子量肝素的第一個國際標準作為標準測定了抗IIa活性。
優選六糖餾分佔低聚糖混合物的15-25％。
優選在低聚糖混合物的六糖餾分中，本發明的混合物含有8-15％六糖ΔIIa-IIs-Is。
採用高壓液相層析法，使用TSK G3000 XL和TSK G2000 XL柱，或者通過製備性分離六糖餾分，可以分析測定六糖餾分的百分數。在這種情況下，使用聚丙烯醯胺瓊脂糖類凝膠填充柱，例如從市場上購買商標Ultrogel ACA202R(Biosepra)的填充柱，對這種混合物進行層析分離。用碳酸氫鈉溶液洗脫這種混合物。優選地，這種碳酸氫鈉溶液是0.1-1mol/l溶液。更優選地，用濃度1mol/l的碳酸氫鈉溶液進行這種分離。採用UV光譜法(254nm)進行檢測。分餾後，六糖餾分的碳酸氫鈉溶液用冰乙酸進行中和。這種溶液然後在減壓下濃縮達到乙酸鈉濃度高於30重量％。然後加入3-5個體積的甲醇沉澱該六糖餾分。這種六糖餾分再使用3號燒結玻璃過濾器進行過濾回收。得到的六糖混合物可以採用HPLC(高效液相色譜)進行分析，測定六糖ΔIIa-IIs-Is的含量。根據本技術領域的技術人員採用的技術(M.Hook，I.Bjork，J.Hopwood and U.Lindahl，《F.E.B.S letters》，vol 656(1)(1976))，採用製備性HPLC色譜法或採用親合色譜法，使用抗凝血酶III瓊脂糖柱，可以分離六糖ΔIIa-IIs-Is。
特別優選本發明的混合物的抗Xa活性是150-200IU/mg。
優選本發明的混合物的抗IIa活性小於5IU/mg，特別優選是0.5-3.5IU/mg。下面描述的這些應用實施例證明當採用該方法優選特徵時，本發明的混合物的抗IIa活性是1.1-1.6IU/mg。
優選這些混合物的抗Xa活性/抗IIa活性比高於50，特別優選高於100。
優選本發明混合物的平均分子量是2000-3000道爾頓，特別優選平均分子量是2400-2650道爾頓。
因此，本發明的目的非常特別地是如前面定義的這些混合物，其抗Xa活性是150-200IU/mg，抗IIa活性是0.5-3.5IU/mg，平均分子量是2400-2650道爾頓。
優選地使用pKa大於20的強有機鹼(優選地具有類似於例如根據R.Schwesinger等人，《Angew.Chem.Int.Ed.Engl.》26，1167-1169(1987)，R.Schwesinger等人，《Angew.Chem.》105，1420(1993)定義的膦腈類的性質)，在有機介質中，通過肝素苄酯季銨鹽的解聚作用，再將解聚的肝素苄酯季銨鹽轉化成鈉鹽，這些殘留酯進行皂化和任選地純化，這樣可以製備出本發明的低聚糖混合物。本發明方法重複了如在WO 0208295中所述方法的主要步驟，同時增加一個基本特徵，這種特徵能夠使所得到的本發明低聚糖混合物具有前面描述的物理化學特徵和活性。
事實上，為了得到本發明的特定低聚糖混合物，需要在解聚步驟時，通過非常精確控制在這種混合物中的水含量來控制這種鹼的選擇性。
事實上，本發明方法的特徵在於在解聚作用時控制這種鹼的高選擇性。本發明能夠使這種肝素解聚，同時最大限度地保持這些對ATIII親合性的序列，例如本發明中描述的六糖ΔIIa-IIs-Is。該方法的這個關鍵步驟確保能夠得到本發明的多糖。
所述方法的這個特徵使得這種平均分子量的低聚糖混合物有出乎意料的抗Xa活性(平均分子量2000-3000道爾頓時，活性為150IU/mg＜抗Xa＜200IU/mg)。這種選擇性是由於膦腈鹼具有非常特別的物理化學特徵所致，pKa大於20並且具有非常高的空間位阻和弱的親核性。
這種反應介質是無水的時，這種效果充分表現出來了。相反地，反應介質中的水含量增加時，觀察到解聚作用的選擇性急劇降低。保持對ATIII親合性的序列降低了，其結果是抗Xa活性大大降低。在少量水的存在下，膦腈鹼變成質子化了，而這些反應物質變成季銨氫氧化物。在這種情況下，失去了非常高的空間位阻和弱的親核性，於是嚴重影響了所得產品的質量。採用控制水含量進行解聚作用試驗時，可以明顯觀察到這種效果。
下表匯集了水含量對解聚作用選擇性的影響(在這些試驗中只是改變這個參數根據本技術領域的技術人員已知的標準，試劑的化學計算量、稀釋度與溫度保持不變。使用的鹼是膦腈鹼2-叔-丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯(phosphorine))。
為了獲得最佳選擇性和最大保持對ATIII親合性序列，以肝素苄酯，苄乙銨(benzethonium)鹽計，使用1摩爾當量膦腈鹼時，優選的是在水含量小於0.6％、非常優選在小於0.3％條件下實施這個步驟。
因此，非常特別地，本發明的目的是根據本技術領域的技術人員已知的方法得到的肝素苄酯季銨鹽解聚作用步驟，其特徵在於使用特別在含有0.6％以下水的二氯甲烷溶液中的膦腈類鹼。優選水的百分數應該低於0.3％，特別優選低於0.2％。
最好強鹼/酯摩爾比是0.2-5，優選是0.6-2，特別優選0.8-1.2。因此，使用等摩爾比為本發明優選的實施方案。
可以使用本技術領域的技術人員已知的其它非質子溶劑，例如THF或DMF。
這些肝素苄酯季銨鹽優選地是苄乙銨、鯨蠟基吡啶鎓或鯨蠟基三甲基銨鹽。
這些膦腈族鹼優選地具有下式
式中R1-R7相同或不同，代表烷基。
在前式中，所述烷基含有1-6個直鏈或支鏈碳原子。
因此，本發明的目的是一種製備本發明低聚糖混合物的方法，該方法包括下述步驟a)通過苯索氯銨的作用，使肝素鈉鹽交換(transalification)，b)通過苄基氯的作用，使苄乙銨肝素鹽酯化，c)將得到的苄酯鹽交換成季銨鹽，d)採用前面定義的方法，使肝素苄酯季銨鹽解聚，e)將季銨鹽轉化成鈉鹽，f)通過一種鹼，例如氫氧化鈉的作用，任選地皂化這種肝素，g)特別地通過一種氧化劑，例如過氧化氫的作用，任選地純化。
下面反應流程圖說明本發明
一般地講，在溫度15-25℃下，使用乙酸鈉醇溶液，優選使用10％(重量/體積)乙酸鈉甲醇溶液處理這種反應介質，將解聚的肝素苄酯季銨鹽轉化成鈉鹽(步驟e)。加入乙酸鹽的重量當量優選地是加入這種解聚反應中的肝素苄酯季銨鹽量的三倍。
一般而言，在溫度0-20℃，優選在0-10℃下，在含水介質中，使用鹼金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰進行皂化反應(步驟f)。通常使用1-5摩爾當量的鹼金屬氫氧化物。優選在1-2摩爾當量的鹼金屬氫氧化物存在下進行皂化反應。
可以採用任何已知的純化解聚肝素的方法(例如EP 0037319B1)任選地純化這個最後產物(步驟g)。優選地，在一種含水介質中，在溫度10-50℃下使用過氧化氫進行這種純化。優選地，在20-40℃下進行這種操作。
按照下述反應流程可以製備這種肝素苄酯季銨鹽a)使用苯索氯銨轉化肝素鈉，以得到苄乙銨肝素鹽(鹽交換)，b)使用苄基氯，通過用乙酸鈉醇溶液處理，使前面得到的苄乙銨鹽酯化，以得到肝素苄酯鈉鹽，c)將肝素苄酯鈉鹽鹽交換成季銨鹽，優選地苄乙銨、鯨蠟基吡啶鎓或鯨蠟基三甲基銨鹽。
在溫度15-25℃下，通過過量苯索氯銨與肝素鈉的作用進行步驟a)的反應。有利地，鹽/肝素鈉摩爾比是3-4。
使用的原料肝素優選地是豬肝素。按照專利FR2663639描述的方法，可以預先對這種豬肝素進行純化，以降低其硫酸皮膚素含量。
在溫度25-45℃，優選地30-40℃下，優選地在含氯有機溶劑(例如氯仿或二氯甲烷)中進行步驟b)的酯化反應。然後，在一種醇(例如甲醇)中，使用10重量％乙酸鈉進行沉澱，回收呈苄乙銨鹽形式的酯，該鹽是鈉鹽。每個體積的反應介質通常使用1-1.2個體積的醇。調節苄基氯的量和反應時間，以達到酯化度50-100％，優選地70-90％。優選地，每1重量份肝素苄乙銨鹽使用0.5-1.5重量份苄基氯。同樣地，反應時間優選10-35小時。
在含水介質中，在溫度10-25℃下，使用氯化季銨，優選使用苯索氯銨、氯化鯨蠟吡啶鎓或鯨蠟基三甲基氯化銨進行步驟c)的鹽交換。有利地，氯化季銨/肝素苄酯鈉鹽摩爾比是2-3。
呈鈉鹽形式的本發明混合物可以轉化成另外的鹼金屬或鹼土金屬鹽。採用專利FR 73 13 580描述的方法，可以任選地實現從一種鹽到另一種鹽的轉化。
本發明的混合物無毒，因此可以用作藥品。
本發明的低聚糖混合物可以用作抗血栓形成劑。特別地，它們用於治療或預防靜脈和動脈血栓形成、深靜脈栓塞、肺血管梗塞、不穩定型心絞痛、心肌梗塞、心肌缺血、外周動脈梗阻疾病和心房纖顫。它們還用於預防和治療平滑肌細胞增生、動脈粥樣硬化和動脈硬化症，通過調節血管生成和生長因子用於治療和預防癌，以及用於治療和預防糖尿病症，例如糖尿病性視網膜病和腎病。
本發明還涉及含有一種式(I)混合物作為活性組分的藥物組合物，任選地還含有一種或多種惰性賦形劑。
這些藥物組合物例如是可以採用皮下或靜脈內注射方式用藥的溶液。它們還可以通過肺部(吸入)或通過口服用藥。
其劑量可隨病人的年齡、體重和健康狀況而改變。成人肌內或皮下用藥劑量通常是每天20-100mg。
下面實施例說明本發明，而不是限制本發明。
實施例A製備肝素苄酯苄乙銨鹽苄乙銨肝素鹽將25g苯索氯銨在125ml水中的溶液添加到10g肝素鈉鹽在100ml水中的溶液裡，該產物經過濾後，用水洗滌與乾燥。
肝素苄酯(鈉鹽)將16ml苄基氯添加到20g肝素苄乙銨鹽在80ml二氯甲烷中的溶液中。該溶液在溫度30℃下加熱12小時。然後添加108ml10％乙酸鈉甲醇溶液，混合物經過濾後，用甲醇洗滌與乾燥。這樣得到7.6g肝素苄酯，呈鈉鹽形式，它的酯化度是77％。
肝素苄酯(苄乙銨鹽)將36g(0.0549mol)肝素苄酯(鈉鹽)和540ml蒸餾水加到2升三角燒瓶A中。在溫度約20℃下均化後，得到了淡黃色溶液。在磁攪拌下，在1升三角燒瓶B中製備了64.45g(0.1438mol)苯索氯銨和450ml水的溶液。在攪拌下，在約35分鐘內將三角燒瓶B中的溶液倒入在三角燒瓶A中的溶液裡。觀察到已生成大量的白色沉澱物。用200ml蒸餾水漂洗三角燒瓶B，再將洗滌水加到三角燒瓶A中。然後停止攪拌，再使這種懸浮液沉澱12小時。這個時間一過，就除去上清液的透明部分並棄去。再將560ml水添加到沉降的沉澱物(漿體狀)中，該混合物攪拌20分鐘。使這種沉澱物再沉降約30分鐘。除去上清液並棄去(560ml)。使用約560ml蒸餾水洗滌沉降沉澱物，這個洗滌操作重複進行兩次。在最後的洗滌操作中，這種沉澱物呈懸浮液狀，再用3號燒結玻璃過濾器過濾。這種濾餅然後洗滌4次，每次200ml蒸餾水。這種白色溼固體經脫水後，在減壓下(2.7kPa)與溫度約60℃下乾燥。乾燥12小時後，得到87.5g肝素苄基酯，為苄乙銨鹽。其產率是94.9％。
實施例B六糖ATIII(ΔIIa-IIs-Is)的描述 在D2O中的質子譜，500MHz，T＝298K，δ，以ppm表示1.97(3H，s)，3.18(1H，dd，10和3Hz)，3.30(1H，t，8Hz)，3.37(1H，dd，10和3Hz)，3.60(2H，m)，3.65-3.85(6H，m)，3.87(2H，m)，3.95(1H，d，8Hz)，4.03(1H，d，8Hz)，4.05-4.13(4H，m)，4.16-4.45(8H，m)，4.52(1H，d，8Hz)，4.67(1H，m)，5.06(1H，d，6Hz)，5.10(1H，d，3Hz)，5.33(1H，d，4Hz)，5.36(1H，d，3Hz)，5.46(1H，d，3Hz)，5.72(1H，d，4Hz)。
4-脫氧-α-L-蘇型-吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙醯氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺醯氨基-3，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺醯氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖糖十鈉鹽。
實施例1-7和12說明了水含量對該聚合反應的選擇性和對所得產物的抗Xa和抗IIa活性的影響。
實施例8-10說明了鹼當量數對所得產物的抗Xa和抗IIa活性的影響(使用水含量0.1％)實施例11說明了使用除2-叔-丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯之外的膦腈鹼使用叔-丁基亞氨基三(吡咯烷-1-基)膦。
實施例1解聚作用並轉化成鈉鹽(0.1％水)在三角燒瓶A中放入70ml二氯甲烷。在攪拌下緩慢加入10g(0.006mol)如實施例A描述得到的肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。將反應介質的水含量調節到0.1％。該溶液在氮氣下加熱到40℃。在完全溶解後，該溶液冷卻到溫度約20℃，然後添加1.75ml(0.006mol)2-叔-丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。得到的混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備出30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解後，將5g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌下，在1分30秒內將三角燒瓶A中的反應混合物倒入溫度約5℃的乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析1小時30分鐘。分離上清液清澈部分，並棄去(220ml)。然後將220ml甲醇添加到這種沉降的沉澱物中，再攪拌5分鐘。再使這種沉澱物再沉降約1小時20分鐘。分離並棄去這種上清液(250ml)。然後將250ml甲醇添加到這種沉降的沉澱物中，混合物攪拌5分鐘。懸浮液中的沉澱物然後用3號燒結玻璃過濾器過濾。得到的濾餅再用100ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到2.51g在硅藻土(5g)中的解聚肝素鈉鹽。其產率是64％。
皂化作用將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗製解聚肝素鈉鹽和17ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入0.4ml(0.004mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入3g氯化鈉。溶解後，將21ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入44ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5℃下沉降45分鐘。然後分離並棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使這種沉澱物再沉降約20分鐘。分離並棄去上清液(80ml)。往沉降沉澱物添加80ml甲醇，再攪拌5分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到1.31g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是66％。
純化將1.3g前面得到的粗製解聚肝素和13ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.07ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時，然後該混合物添加1N HCl進行中和，接著加入2g氯化鈉。該溶液然後用0.45μm膜過濾，再倒入14ml甲醇。該溶液然後冷卻到10℃，攪拌約15分鐘。然後添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析約15分鐘。然後分離並棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約25分鐘。分離並棄去上清液(50ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉澱物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到1.13g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是87％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2600道爾頓抗Xa活性177IU/mg抗IIa活性1.5IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比118
實施例2解聚作用並轉化成鈉鹽(0.2％水)將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下與在氮氣壓力下，緩慢加入如實施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。將反應介質的水含量調節到0.2％。完全溶解後，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解後，將5g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5℃下，將三角燒瓶A中的反應混合物在1分30秒內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析2小時。分離並棄去上清液的清澈部分(220ml)。將220ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使這種沉澱物再沉降約2時。分離並棄去上清液(230ml)。將230ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉澱物。得到的濾餅然後用150ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到2.63g在硅藻土(5g)中的粗製解聚肝素。其產率是67％。
皂化作用將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗製解聚肝素鈉鹽和18ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入0.4ml(0.004mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入2g氯化鈉。將14ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5℃下沉降45分鐘。然後分離並棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。往沉降沉澱物添加80ml甲醇，再攪拌5分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥48小時後，得到2.3g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是65％。
純化將1.4g前面得到的粗製解聚肝素和15ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.07ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約40℃下攪拌約2小時，然後該混合物冷卻到溫度20℃，再添加1N HCl進行中和。往該反應介質加入2g氯化鈉。該溶液然後用0.45μm膜過濾，再倒入14ml甲醇。該溶液然後冷卻到10℃，攪拌約15分鐘。這時添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析約15分鐘。然後分離並棄去上清液(40ml)。將40ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約20分鐘。分離並棄去上清液(50ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉澱物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到1.2g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是86％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2650道爾頓抗Xa活性161IU/mg抗IIa活性1.4IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比115實施例3解聚作用並轉化成鈉鹽(0.3％水)將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下與在氮氣壓力下，加入如實施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。將反應介質的水含量調節到0.3％。完全溶解後，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解後，將5g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5℃下，將三角燒瓶A中的反應混合物在1分30秒內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析1小時10分鐘。分離並棄去上清液的清澈部分(220ml)。將220ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉澱物。得到的濾餅然後用100ml甲醇洗滌。溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到2.57g在硅藻土(5g)中的粗製解聚肝素鈉鹽。其產率是66％。
皂化作用將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗製解聚肝素鈉鹽和18ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入0.4ml(0.004mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入3g氯化鈉。將15ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析1小時。然後分離並棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度40℃下乾燥。乾燥48小時後，得到1.42g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是62％。
純化將1.4g前面得到的粗製解聚肝素和14ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.07ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入2g氯化鈉。溶解後，溶液再用0.45μm膜過濾，再倒入14ml甲醇。該濾液然後冷卻到10℃，攪拌15分鐘。這時添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析約40分鐘。然後分離並棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉澱物(漿體狀)中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約25分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉澱物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到1.24g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是89％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2400道爾頓抗Xa活性132IU/mg抗IIa活性1.4IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比94實施例4解聚作用並轉化成鈉鹽(0.4％水)將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。將反應介質的水含量調節到0.4％。該溶液在氮氣下於30℃下加熱。完全溶解後，再降到溫度約20℃，然後添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解後，將5g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5℃下，將三角燒瓶A中的反應混合物在1分30秒內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析2小時。分離並棄去上清液的清澈部分(80ml)。將80ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。將沉澱物再沉降約1小時。分離上清液並棄去(80ml)。將80ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液中的沉澱物。得到的濾餅然後用150ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到3.25g在硅藻土(5g)中的粗製解聚肝素鈉鹽。產率是83％。
皂化作用將3.1g(0.0018mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗製解聚肝素鈉鹽和21ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次6ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入0.7ml(0.007mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入4g氯化鈉。將28ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入72ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析1小時。然後分離並棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。再使這種沉澱物再沉降約20分鐘。然後分離並棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥48小時後，得到1.9g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是67％。
純化將1.9g前面得到的粗製解聚肝素和19ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.1ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入2g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再倒入14ml甲醇，攪拌15分鐘。這時添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析15分鐘。然後分離並棄去上清液(40ml)。將40ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約20分鐘。分離並棄去上清液(50ml)。將500ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約20分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾沉澱物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥72小時後，得到1.56g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是82％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2350道爾頓抗Xa活性122IU/mg抗IIa活性1.3IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比94實施例5解聚作用並轉化成鈉鹽(0.57％水)將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。將反應介質的水含量調節到0.57％。完全溶解後，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解後，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三角燒瓶A中的反應混合物在1分30秒內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離並棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使這種沉澱物再沉降約1小時。分離並棄去上清液(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液。得到的濾餅然後用200ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到6.66g在硅藻土(10g)中的粗製解聚肝素鈉鹽。產率是85％。
皂化作用將6.66g(0.0101mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗製解聚肝素鈉鹽和47ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5℃下加入1.1ml(0.011mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入9.5g氯化鈉。將66ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入171ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5℃下傾析3/4小時。然後分離並棄去上清液(160ml)。將160ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。再使這種沉澱物再沉降約20分鐘。然後分離並棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到4.53g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是74％。
純化將4.53g前面得到的粗製解聚肝素和45ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.25ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入5.5g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入38ml甲醇。該溶液然後升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加100ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液傾析20分鐘。然後分離並棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約25分鐘。分離並棄去上清液(100ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到3.7g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是82％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2200道爾頓抗Xa活性120IU/mg抗IIa活性1.4IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比86實施例6解聚作用並轉化成鈉鹽(1.8％水)將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。將反應介質的水含量調節到1.8％。完全溶解後，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解後，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三角燒瓶A中的反應混合物在1分30秒內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離並棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使這種沉澱物再沉降約1小時。分離並棄去上清液(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅然後用200ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約50℃下乾燥。乾燥18小時後，得到7.54g在硅藻土(10g)中的粗製解聚肝素鈉鹽。產率是96％。
皂化作用將7.54g(0.0101mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗製解聚肝素鈉鹽和53ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1.25ml(0.012mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用IN HCl進行中和，再加入10.5g氯化鈉。將70ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入190ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降3/4小時。然後分離並棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。再使這種沉澱物再沉降約20分鐘。然後分離並棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度50℃下乾燥。乾燥18小時後，得到5.53g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是80％。
純化將5.53g前面得到的粗製解聚肝素和55ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.31ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入7g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入49ml甲醇。該溶液然後升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加126ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然後分離並棄去上清液(105ml)。將105ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約25分鐘。分離並棄去上清液(110ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約55℃下乾燥。乾燥18小時後，得到4.53g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是82％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2600道爾頓抗Xa活性105IU/mg抗IIa活性3.1IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比34實施例7解聚作用並轉化成鈉鹽(2.5％水)將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。將反應介質的水含量調節到2.5％。完全溶解後，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解後，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三角燒瓶A中的反應混合物在1分30秒內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析1小時。分離並棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使這種沉澱物再沉降約30分鐘。分離並棄去上清液(400ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅然後用200ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約50℃下乾燥。乾燥18小時後，得到7.78g在硅藻土(10g)中的粗製解聚肝素鈉鹽。產率是99.6％。
皂化作用將7.78g(0.0119mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗製解聚肝素鈉鹽和79ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號燒結玻璃過濾器過濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1.3ml(0.012mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入10g氯化鈉。將60ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入190ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降3/4小時。然後分離並棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。再使這種沉澱物再沉降約20分鐘。然後分離並棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度50℃下乾燥。乾燥18小時後，得到5.87g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是82％。
純化將5.87g前面得到的粗製解聚肝素和59ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.34ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入7g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入49ml甲醇。該溶液然後升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加126ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然後分離並棄去上清液(105ml)。將105ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約25分鐘。分離並棄去上清液(110ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約55℃下乾燥。乾燥18小時後，得到5.21g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是89％。
如此得到的解聚肝素特徵如下
平均分子量3550道爾頓抗Xa活性99IU/mg抗IIa活性13.4IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比7.4實施例8解聚作用並轉化成鈉鹽(0.5當量鹼)將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。在溫度約30℃下完全溶解，再降到溫度約20℃後，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三角燒瓶A中的反應混合物倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌1小時後，使這種懸浮液傾析2小時。分離並棄去上清液的清澈部分(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。使這種沉澱物再沉降約18小時。分離並棄去上清液(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。分離並棄去上清液的清澈部分(400ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅然後用甲醇洗滌兩次，每次100ml。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約60℃下乾燥。乾燥後，得到5.7g粗製解聚肝素鈉鹽。產率是73％。
皂化作用將5.7g(0.0086mol)前面得到的粗製解聚肝素鈉鹽和53ml水放到100ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入0.93ml(0.009mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入6g氯化鈉。將42ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入108ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降30分鐘。然後分離並棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。再使這種沉澱物再沉降約30分鐘。然後分離並棄去上清液(170ml)。將170ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種溼固體經脫水後在減壓與溫度60℃下乾燥。乾燥後，得到3.5g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是67.4％。
純化將3.5g前面得到的粗製解聚肝素和35ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.6±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.18ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入3.6g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入27ml甲醇。該溶液然後升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加65ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然後分離並棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。使沉澱物再沉降約30分鐘。分離並棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的白色濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種溼固體經脫水後，在減壓與溫度約60℃下乾燥。乾燥後，得到2.8g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是80％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2900道爾頓抗Xa活性146.1IU/mg抗IIa活性5.1IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比28.6實施例9解聚作用並轉化成鈉鹽(0.6當量鹼)將280ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的40g(0.024mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。在溫度約30℃下完全溶解，再降到溫度約20℃後，添加4.2ml(0.014mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三頸瓶A中的一半反應混合物倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌1小時後，使這種懸浮液傾析。分離並棄去上清液的清澈部分(310ml)。將310ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌1小時。使這種沉澱物再沉降約18小時。分離並棄去上清液(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌1小時。分離並棄去上清液(300ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅然後用甲醇洗滌兩次，每次100ml。淡黃色溼固體經脫水後在減壓與溫度約60℃下乾燥。乾燥後，得到6g粗製解聚肝素鈉鹽。產率是77％。
皂化作用將6g(0.0091mol)前面得到的粗製解聚肝素鈉鹽和56ml水放到250ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1ml(0.010mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入6.4g氯化鈉。將45ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入115ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降30分鐘。然後分離並棄去上清液(170ml)。將170ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。再使這種沉澱物再沉降約30分鐘。然後分離並棄去上清液(140ml)。將140ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種溼固體經脫水後在減壓與溫度60℃下乾燥。乾燥後，得到3.6g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是65.3％。
純化將3.5g前面得到的粗製解聚肝素和35ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.6±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.18ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入3.5g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入25ml甲醇。該溶液然後升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加63ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然後分離並棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。使沉澱物再沉降幾分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的白色濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種溼固體經脫水後，在減壓與溫度約60℃下乾燥。乾燥後，得到2.5g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是71.4％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2600道爾頓抗Xa活性150.5IU/mg抗IIa活性3.2IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比47實施例10解聚作用並轉化成鈉鹽(0.8當量鹼)將70ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。在溫度約30℃下完全溶解，再降到溫度約20℃後，添加1.38ml(0.004mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備30g無水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三頸瓶A中的反應混合物在1分鐘15秒內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析1小時。分離並棄去上清液的清澈部分(190ml)。將190ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使這種沉澱物再沉降約30分鐘。分離並棄去上清液(190ml)。將190ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。分離並棄去上清液(190ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅然後用150ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到3.05g粗製解聚肝素鈉鹽。產率是80％。
皂化作用將3.05g(0.0048mol)前面得到的粗製解聚肝素鈉鹽和21ml水放到100ml三角燒瓶中。該溶液用3號燒結玻璃過濾器過濾，用水漂洗兩次，每次6ml。得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入0.6ml(0.006mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入4g氯化鈉。將28ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入72ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降30分鐘。然後分離並棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。再使這種沉澱物再沉降約30分鐘。然後分離並棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌30分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度40℃下乾燥。乾燥後，得到1.6g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是57％。
純化將1.6g前面得到的粗製解聚肝素和16ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.6±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.08ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入2g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入14ml甲醇。該溶液然後升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加36ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然後分離並棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約30分鐘。分離並棄去上清液(50ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥後，得到1.25g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是78％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2400道爾頓抗Xa活性154.3IU/mg抗IIa活性1.6IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比96.4實施例11解聚作用並轉化成鈉鹽將140ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。在溫度約40℃下完全溶解，再降到溫度約20℃後，添加3.5ml(0.011mol)叔丁基亞氨基-三(吡咯烷-1-基)膦。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在完全溶解後，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三頸瓶A中的反應混合物在1分鐘30秒內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離並棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使這種沉澱物再沉降約1小時20分鐘。分離並棄去上清液(250ml)。將250ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅然後用200ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥後，得到5.39g粗製解聚肝素鈉鹽。產率是69％。
皂化作用將5g(0.0076mol)前面得到的粗製解聚肝素(苄酯，鈉鹽)和35ml水放到50ml三角燒瓶中。該溶液用3號燒結玻璃過濾器過濾，用水漂洗兩次，每次10ml。得到的濾液裝入250ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1ml(0.01mol)30％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌2小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入6g氯化鈉。將42ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入104ml甲醇，接著攪拌15分鐘。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降1小時。然後分離並棄去上清液(140ml)。將140ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。再使這種沉澱物再沉降約45分鐘。然後分離並棄去上清液(160ml)。將160ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的濾餅再用100ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥後，得到2.7g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是59％。
純化將2.6g前面得到的粗製解聚肝素和25ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.15ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入3g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入21ml甲醇。該溶液然後升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加54ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然後分離並棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約20分鐘。分離並棄去上清液(50ml)。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到2.35g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是90％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2400道爾頓抗Xa活性167.5IU/mg抗IIa活性1.1IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比152實施例12解聚作用並轉化成鈉鹽(0.05％水)將140ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素苄酯(酯化度75％，苄乙銨鹽)。往該反應介質添加20g 4A分子篩，將水含量調節到0.05％，同時緩慢攪拌48小時。在惰性氣氛下將其上清液轉移到三頸瓶A中。在完全溶解後，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環己烯。這種混合物在溫度約20℃下攪拌24小時。在這個時間，在三角燒瓶B中製備60g無水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在完全溶解後，將10g Hyflo supercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4℃下，將三頸瓶A中的反應混合物在2分鐘內倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘後，使這種懸浮液傾析1小時。分離並棄去上清液的清澈部分(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌15分鐘。使這種沉澱物再沉降約1小時。分離並棄去上清液(450ml)。將450ml甲醇添加到沉降沉澱物中，攪拌15分鐘。然後用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液。得到的濾餅然後用200ml甲醇洗滌。淡黃色溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約50℃下乾燥。乾燥16小時後，得到5.36g在硅藻土(10g)中的粗製解聚肝素鈉鹽。產率是68.6％。
皂化作用將5.36g(0.00817mol)前面得到的粗製解聚肝素鈉鹽和50ml水放到50ml三角燒瓶中。該懸浮液用3號燒結玻璃過濾器過濾，用水漂洗四次，每次15ml。得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4℃下加入1.01ml(0.0122mol)35％氫氧化鈉溶液。加完後，該混合物攪拌3小時。這種溶液用1N HCl進行中和，再加入11g氯化鈉。將77ml甲醇添加到反應介質中。攪拌15分鐘後，加入200ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4℃下沉降1小時。然後分離並棄去上清液(240ml)。將240ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌10分鐘。再使這種沉澱物再沉降約30分鐘。然後分離並棄去上清液(225ml)。將225ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌10分鐘。用3號燒結玻璃過濾器過濾懸浮液。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種溼固體經脫水後在減壓(6kPa)與溫度約40℃下乾燥。乾燥18小時後，得到2.65g粗製解聚肝素(鈉鹽)。產率是53.7％。
純化將2.65g前面得到的粗製解聚肝素和26.5ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40℃。加入1N氫氧化鈉將其pH調節到9.7±0.1。反應介質使用0.45μm膜進行過濾，再添加0.25ml 30％過氧化氫水溶液。在溫度約20℃下攪拌約2小時後，往該混合物添加1N HCl進行中和，然後加入3g氯化鈉。這種溶液用0.45μm膜過濾，再在溫度約10℃下倒入21ml甲醇。該溶液然後升到20℃，攪拌15分鐘。這時添加54ml甲醇，接著攪拌1小時。這時停止攪拌，使這種懸浮液沉降45分鐘。然後分離並棄去上清液(46ml)。將46ml甲醇添加到這種沉降沉澱物中，攪拌5分鐘。使沉澱物再沉降約30分鐘。分離並棄去上清液(50ml)。然後用4號燒結玻璃過濾器過濾呈懸浮狀的沉澱物。得到的白色濾餅再用兩份甲醇洗滌，每份10ml。這種溼固體經脫水後，在減壓(6kPa)與溫度約50℃下乾燥。乾燥18小時後，得到2.363g純解聚肝素(鈉鹽)。其產率是89.1％。
如此得到的解聚肝素特徵如下平均分子量2500道爾頓抗Xa活性192IU/mg抗IIa活性1.3IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比148
權利要求
1.硫酸化低聚糖混合物，它們具有組成肝素的多糖的一般結構，還具有下述特徵-它們的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性是120-200IU/mg，抗IIa活性小於10IU/mg，抗Xa活性/抗IIa活性的比大於30，這些混合物的組分低聚糖-含有2-26個糖單元，-在其中一個末端有4，5-不飽和糖醛酸2-O-硫酸酯單元，-含有下式的六糖ΔIIa-IIs-Is 並且這些低聚糖混合物呈鹼金屬或鹼土金屬鹽形式。
2.根據權利要求所述1的低聚糖混合物，其特徵在於鹼金屬或鹼土金屬鹽選自鈉、鉀、鈣和鎂鹽。
3.根據權利要求1或2所述的低聚糖混合物，其特徵在於它含有六糖餾分，這種餾分佔低聚糖混合物的15-25％。
4.根據權利要求3所述的低聚糖混合物，其特徵在於在低聚糖混合物的六糖餾分中，含有8-15％的六糖ΔIIa-IIs-Is。
5.根據權利要求1-4中任一項權利要求所述的低聚糖混合物，其特徵在於它的抗Xa活性是150-200IU/mg。
6.根據權利要求1-5中任一項權利要求所述的低聚糖混合物，其特徵在於它的抗IIa活性小於5IU/mg，特別是0.5-3.5IU/mg。
7.根據權利要求1-6中任一項權利要求所述的低聚糖混合物，其特徵在於它的抗Xa活性/抗IIa活性比大於50，特別是大於100。
8.根據權利要求1-7中任一項權利要求所述的低聚糖混合物，其特徵在於它的平均分子量是2000-3000道爾頓，特別是2400-2650道爾頓。
9.根據權利要求1-8中任一項權利要求所述的低聚糖混合物，其特徵在於它的抗Xa活性是150-200IU/mg，抗IIa活性是0.5-3.5IU/mg，而平均分子量是2400-2650道爾頓。
10.一種製備根據權利要求1-9中任一項權利要求所述低聚糖混合物的方法，在製備過程中，在一種有機介質中，在一種pKa大於20的強有機鹼存在下，對肝素苄酯季銨鹽進行解聚，其特徵在於使用的有機鹼為膦腈族鹼，特別是含有水百分數小於0.6％的膦腈族鹼的二氯甲烷溶液。
11.根據權利要求10所述的製備權利要求1所述低聚糖混合物的方法，其特徵在於水含量小於0.3％，優選小於0.2％。
12.根據權利要求10或11所述的製備方法，其特徵在於肝素苄酯季銨鹽是苄乙銨、鯨蠟基吡啶鎓或鯨蠟基三甲基銨鹽。
13.根據權利要求10或11所述的製備方法，其特徵在於膦腈族鹼是下式的鹼 式中R1-R7是相同或不同的，它們代表含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基。
14.根據權利要求10或11所述的製備方法，其特徵在於強鹼/酯的摩爾比是0.2-5，優選0.6-2。
15.使用肝素製備權利要求1-9中任一項權利要求所述低聚糖的方法，其中進行下述操作a)通過苯索氯銨的作用，使肝素鈉鹽交換，b)通過苄基氯的作用，使苄乙銨肝素鹽酯化，c)將得到的苄酯鹽交換成季銨鹽，d)採用權利要求10或11的方法，使肝素苄酯季銨鹽解聚，e)將季銨鹽轉化成鈉鹽，f)通過一種鹼，例如氫氧化鈉的作用，任選地皂化所述肝素，g)特別地通過一種氧化劑，例如過氧化氫的作用，任選地純化。
16.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於在溫度約15-25℃與鹽/肝素鈉摩爾比3-4的條件下，通過過量苯索氯銨與肝素鈉的作用進行步驟a)的反應。
17.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於在含氯有機溶劑中，在溫度25-45℃、優選30-40℃下進行步驟b)的酯化反應，所述的含氯有機溶劑例如是氯仿或二氯甲烷，然後使用10重量％乙酸鈉醇溶液沉澱回收呈鈉鹽形式的酯，所述的醇例如是甲醇，所述醇的濃度是每個體積的反應介質為1-1.2個體積的醇。
18.根據權利要求15或17所述的方法，其特徵在於肝素苄酯季銨鹽的酯化度是50-100％，優選70-90％。
19.根據權利要求15、17或18所述的方法，其特徵在於每1重量份肝素苄乙銨鹽使用0.5-1.5重量份苄基氯，反應時間應是10-35小時。
20.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於在一種含水介質中，在溫度10-25℃下，使用氯化季銨，優選地使用苯索氯銨、氯化鯨蠟吡啶鎓或鯨蠟基三甲基氯化銨進行步驟c)的鹽交換。
21.根據權利要求20所述的方法，其特徵在於氯化季銨/肝素苄酯鈉鹽的摩爾比是2-3。
22.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於在溫度15-25℃下，使用乙酸鈉醇溶液，優選地使用10％乙酸鈉甲醇溶液(重量/體積)處理反應介質，使解聚的肝素苄酯季銨鹽轉化成鈉鹽(步驟e)。
23.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於在一種含水介質中，在溫度0-20℃、優選0-10℃下，使用鹼金屬氫氧化物進行該皂化作用(步驟f)，所述的鹼金屬氫氧化物例如是氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰。
24.根據權利要求23所述的方法，其特徵在於使用1-5摩爾當量鹼金屬氫氧化物，優選1-2摩爾當量氫氧化鈉。
25.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於在一種含水介質中，在溫度10-50℃、優選20-40℃下，使用過氧化氫進行所述純化(步驟g)。
26.根據權利要求1-9中任一項權利要求所述的低聚糖作為藥物。
27.根據權利要求1-9中任一項權利要求所述的低聚糖作為具有抗血栓形成活性的藥物。
28.根據權利要求26或27所述的藥物，它們用於治療或預防靜脈和動脈血栓形成、深靜脈栓塞、肺血管梗塞、不穩定型心絞痛、心肌梗塞、心肌缺血、外周動脈梗阻疾病和心房纖顫、平滑肌細胞增生、動脈粥樣硬化病和動脈硬化症，通過調節血管生成和生長因子用於治療和預防癌，以及用於治療和預防糖尿病症，例如糖尿病性視網膜病和腎病。
29.一種藥物組合物，它含有至少一種如權利要求26限定的藥物和一種或多種藥用惰性賦形劑或載體或添加劑。
30.根據權利要求29所述的藥物組合物，其特徵在於它是採用皮下或靜脈內注射方法給藥的溶液。
31.根據權利要求29所述的藥物組合物，其特徵在於它是通過肺部吸入方法給藥的製劑。
32.根據權利要求29所述的藥物組合物，其特徵在於它是通過口服方法給藥的製劑。
33.如權利要求1-9中任一項權利要求所限定的多糖混合物，它們可以採用權利要求15所限定的方法得到。
全文摘要
本發明涉及由肝素衍生的多糖混合物，它們的平均分子量是1500－3000道爾頓，抗Xa活性/抗IIa活性的比大於30。本發明還涉及它們的製備方法和含有它們的藥物組合物。
文檔編號A61K31/726GK1798771SQ200380100992
公開日2006年7月5日 申請日期2003年10月8日 優先權日2002年10月10日
發明者V·比貝爾羅維科, L·格龍達爾, P·穆裡耶, C·維斯科夫 申請人:安萬特醫藥股份有限公司