弓形蟲免疫金標快速檢測試劑及製備方法
2023-06-16 07:13:21 2
專利名稱：：弓形蟲免疫金標快速檢測試劑及製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測抗體的免疫膠體金試劑及該試劑的製備方法。
背景技術：
：現有檢測弓形蟲抗體的方法主要有酶聯免疫吸附和間接血凝法，這兩種方法都有缺陷和不足。酶聯免疫吸附法的缺點是需要專門的儀器設備如酶標儀來配合使用；試劑需要低溫保存；檢測操作人員需要經過專業培訓；操作過程相對複雜，檢測所需時間比較長；檢測所需費用較高，不能實現單人(頭、只)份檢測；不利於在基層單位進行推廣使用。間接血凝法除上述缺點外還存在的缺陷是靈敏度低，容易出現漏檢的情況。中國發明專利申請CN1431513A和CN1431514A分別公開了一種"檢測弓形蟲抗體IgM免疫膠體金試劑及製備方法"和一種"檢測弓形蟲抗體IgG免疫膠體金試劑及製備方法"，它們都存在以下的不足(1)弓形蟲特異性表面膜抗原和單克隆抗體的製備工藝繁瑣；(2)試劑檢測範圍受到限制，只能檢測人的弓形蟲病；(3)該試劑不能同時檢測抗弓形蟲IgG和IgM。
發明內容本發明的目的是為了克服當前技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種不需要特定儀器設備輔助的檢測試劑，同時可檢測人和各種動物的弓形蟲抗體IgG及IgM，並且能有效地降低檢測成本，減輕檢測人員的負擔。本發明同時提供該試劑的製備方法。本發明採取以下技術方案解決其所要解決的技術問題檢測抗弓形蟲抗體免疫金標快速檢測試劑包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，其特徵在於結合墊包被了帶有弓形蟲代謝分泌抗原的膠體金結合物，硝酸纖維素膜上以線形包被了弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體。該試劑的製備方法如下(l)製備弓形蟲代謝分泌抗原2025克體重小鼠每隻按lxl5lxl06弓形蟲速殖子腹腔接種，經34日，小鼠出現精神沉鬱、不食、被毛粗亂等症狀時，脫頸致死小白鼠，浸泡於7075%酒精內體表消毒；每隻小鼠用23毫升PH7.20.15mol/LPBS緩衝液洗腹收集蟲體；將所收集的腹腔液以30004000rpm離心3040分，收集上清液；將上清液在-15。C-7(TC放置2448小時，凍融化開後再次以30004000rpm離心3040分鐘，離心23次，收集上清液；上清液即為弓形蟲代謝分泌抗原。(2)製備抗弓形蟲抗體用弓形蟲抗原免疫羊，瓊擴檢測達1:3264時採集免疫羊血清，用飽和硫酸法粗提取羊抗弓形蟲抗體，再用凝膠層析法純化羊抗弓形蟲抗體；(3)製備膠體金用檸檬酸三鈉將氯金酸還原成4060納米的膠體金顆粒；(4)製備弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物將膠體金與弓形蟲代謝分泌抗原按1:0.02(ml/mg)比例攪拌混勻，使之形成穩定的複合物，通過純化濃縮形成弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物；(5)將弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體以線形包被在硝酸纖維膜的檢測區和滯控區，充分乾燥。檢測時，從鋁箔袋中取出檢測試劑條(板)，按MARK線下箭頭所示的方向將試劑條浸入樣本溶液中，液面不得超過MARK線，1520秒後取出，平放在操作臺上；如果是試劑板從鋁箔袋中取出檢測試劑板，平放在操作臺上，往加樣孔中滴加三滴(約樣品溶液(血清)；315分鐘內即可判斷結果，30分鐘後判斷的結果無效。判斷標準檢測區、質控區均出現紅色條帶者為陽性結果；檢測區無條帶、質控區出現紅色條帶者為陰性結果；檢測區、質控區均未出現紅色條帶出現，則產品為無效。本發明的積極效果在於(1)應用範圍廣，可檢測人和各種動物的弓形蟲抗體；(2)快捷迅速，全過程只需30分鐘；(3)靈敏準確，敏感性和準確性高於間接血凝試劑，與ELISA試劑結果相同，結果受外因影響較小，可在養殖場現場進行檢測；(4)操作簡單，不需要任何特殊儀器和設備，檢測人員無需專業培訓，適合在基層推廣應用；(5)價格低廉，價格是ELISA試劑的三分之二；(6)保存和運輸方便，一般保存於4°C冰箱即可；(7)安全穩定，膠體金、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯均無毒性，絕對不會造成環境汙染。表l弓形蟲金標試紙條特異性試驗tableseeoriginaldocumentpage4tableseeoriginaldocumentpage5從表1可以看出，用同一批次金標試紙條分別檢測豬衣原體陽性血清、豬瘟陽性血清、豬傳染性胸膜肺炎陽性血清各50、46、38份，結果全為陰性，無交叉反應，證實該試紙條特異性良好。表2弓形蟲金標試紙條敏感性試驗tableseeoriginaldocumentpage5從表2可以看出，用同一批次金標試紙條檢測288份豬血清並以ELISA、IHA法進行平行檢測。金標試紙條、ELISA、IHA法陽性檢出率分別為48%(138/288)、48%(138/288)39.6%(114/288)。證實試紙條的敏感性明顯高於IHA法而和ELISA相同。具體實施方式實施例1(1)製備弓形蟲代謝分泌抗原2006年3月3日以lxl(T6弓形蟲速殖子/只，腹腔接種20-25克體重小鼠20隻，3月5日，小鼠出現了精神沉鬱、被毛粗亂等症狀，將小白鼠脫頸致死，浸泡於75%酒精內進行體表消毒。每隻小鼠用2毫升PH7.20.15mol/LPBS緩衝液洗腹收集蟲體，共收集腹腔液45ml,將所收集的腹腔液以每分鐘3000轉的速度離心40分鐘，收集上清液，上清液置-2(TC冰箱內，3月7日從冰箱取出上清，融化後再以每分鐘4000轉的速度離心3次，每次離心30分鐘，收集上清液，檢測上清液蛋白含量為21.37mg/ml，上清液即為弓形蟲代謝分泌抗原，置—15°C冰箱內備用。(2)製備弓形蟲抗體2006年3月23日用弓形蟲代謝分泌抗原疫苗皮下免疫羊，半個月後用弓形蟲速殖子lxl0'6/只腹腔加強免疫，再經過7天後採集血清進行瓊擴檢測，效價為l:16，又用弓形蟲速殖子bd(T7/只腹腔加強免疫，再經過7天後採集血清進行瓊擴檢測，效價為l:64，採集免疫羊血100ml，分離血清40ml,血清分別用50%、33%、33%的飽和硫酸銨提取羊抗弓形蟲抗體，粗提的羊抗弓形蟲抗體經S印hacrylS-300服凝膠層析法純化。純化的羊抗弓形蟲抗體用蛋白檢測儀檢測蛋白含量，蛋白含量為15mg/ml。置一15t:冰箱內備用。(3)製備膠體金及弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物2006年5月13日取HAuCl在lg，用1000ml三蒸餾水將HAuCh配成0.lg/L的溶液，煮沸後加新配製的10g/L檸檬酸三鈉7.5ml;繼續煮沸5min，直至溶液變成葡萄酒紅色，冷卻後用0.2mol/LK2C03將金溶膠pH值調至8.9左右，將1000ml金溶膠加入弓形蟲代謝分泌抗原20mg混勻，置超淨臺磁力攪拌20min，4。C靜置30min，然後1000ml加入牛血清白蛋白2400mg，繼續攪拌5min，最後加入100g/L氯化鈉水溶液100ml,使其終濃度為10g/L;混勻，以2000r/rain，4。C離心10min，棄沉澱，10000r/min重複離心3060min，將沉澱復溶於80ml金稀釋液中形成膠體金與弓形蟲代謝分泌抗原結合物，冷藏備用。(4)將弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體以線形包被在硝酸纖維膜的檢測區和滯控區，充分乾燥2006年5月28日，取金標弓形蟲代謝分泌抗原均勻浸透無紡布，37"溫箱烘乾過夜；硝酸纖維膜分別用0.01mol/LpH7.4PBS稀釋成2g/L的弓形蟲代謝分泌抗原和3g/L抗弓形蟲抗體包被成兩條線即檢測線和滯控線，37'C溫箱烘乾過夜，再用含10g/L小牛血清的PBS，37。C封閉30min，再用0.Olmol/LpH7.4PBS漂洗3次，乾燥後依次將樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維膜、吸水濾紙和不乾膠保護層粘貼在PVC板上，在手持端粘貼彩色手柄紙，在進樣端粘貼標有MAX線的塑料紙，用斬切機切成0.3X8cm的試劑條，即製成檢測抗弓形蟲抗體免疫金標快速檢測試劑。實施例2(1)製備弓形蟲代謝分泌抗原2006年4月13日以lxl(T5弓形蟲速殖子/只，腹腔接種20-25克體重小鼠20隻，4月17日，小鼠出現了精神沉鬱、被毛粗亂等症狀，將小白鼠脫頸致死，浸泡於70%酒精內進行體表消毒。每隻小鼠用2-3毫升PH7.2PBS緩衝液洗腹收集蟲體。共收集腹腔液45ml，將所收集的腹腔液以每分鐘4000轉的速度離心30分鐘，收集上清，上清置-2CrC冰箱內，4月18日從冰箱取出上清，融化後再以每分鐘3000轉的速度離心2次，每次離心40分鐘，收集上清，檢測上清蛋白含量為18.26mg/ml。上清即為弓形蟲代謝分泌抗原。(2)製備弓形蟲抗體2006年5月3日用弓形蟲代謝分泌抗原疫苗皮下免疫羊，半個月後用弓形蟲速殖子lxl(T6/只腹腔加強免疫，再經過7天後採集少量血清進行瓊擴檢測，效價為l:16，又用弓形蟲速殖子lxl(T7/只腹腔加強免疫，再經過7天後採集少量血清進行瓊擴檢測，效價為1:64，採集免疫羊血100ml，分離血清40ml，血清分別用50%、33%、33%的飽和硫酸銨提取羊抗弓形蟲抗體，粗提的羊抗弓形蟲抗體經S印hacrylS-300HR凝膠層析法純化。純化的羊抗弓形蟲抗體用蛋白檢測儀檢測蛋白含量，蛋白含量為15mg/ml，置一15'C冰箱內備用。(3)製備膠體金及弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物2006年6月13日取HAuCl40.lg，用1000ml三蒸餾水將HAuCL配成0.lg/L的溶液，煮沸後加新配製的10g/L檸檬酸三鈉lml;繼續煮沸5min，直至溶液變成葡萄酒紅色，冷卻後用0.2mol/LK2C03將金溶膠pH值調至8.9左右，將1000ml金溶膠加入弓形蟲代謝分泌抗原20mg混勾，置超淨臺磁力攪拌20min，4。C靜置30min，然後1000ml加入牛血清白蛋白2400mg，繼續攪拌5min。最後加入100g/L氯化鈉水溶液100ml，使其終濃度為10g/L;混勻，以2000r/min，4。C離心10min，棄沉澱，10000r/min重複離心3060min，將沉澱復溶於80ml金稀釋液中形成弓形蟲代謝分泌抗原膠體金結合物，冷藏備用。(4)將弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體以線形包被在硝酸纖維膜的檢測區和滯控區，充分乾燥2006年6月28日，取金標弓形蟲代謝分泌抗原均勻浸透無紡布，37'C溫箱烘乾過夜；硝酸纖維膜分別用0.01mol/LpH7.4PBS稀釋成2g/L的弓形蟲代謝分泌抗原和3g/L抗弓形蟲抗體包被成兩條線即檢測線和滯控線，37'C溫箱烘乾過夜，再用含10g/L小牛血清的PBS，37。C封閉30min，再用0.Olmol/LpH7.4PBS漂洗3次，乾燥後依次將樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維膜、吸水濾紙和不乾膠保護層粘貼在PVC板上，在手持端粘貼彩色手柄紙，在進樣端粘貼標有MAX線的塑料紙，用斬切機切成0.3X8cm的試劑條，即製成檢測抗弓形蟲抗體免疫金標快速檢測試劑。權利要求1、一種弓形蟲免疫金標快速檢測試劑，該試劑包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，其特徵在於上述結合墊包被了帶有弓形蟲代謝分泌抗原的膠體金結合物，上述硝酸纖維素膜上以線形包被了弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體。2、根據權利要求l所述的弓形蟲免疫金標快速檢測試劑的製備方法，其特徵在於按下述方法製備a、製備弓形蟲代謝分泌抗原2025克體重小鼠每隻按lxl0slxl(T弓形蟲速殖子腹腔接種，經34日，小鼠出現精神沉鬱、不食、被毛粗亂等症狀時，脫頸致死小白鼠，浸泡於7075%酒精內體表消毒；每隻小鼠用2-3毫升PH7.20.15mol/LPBS緩衝液洗腹收集蟲體；將所收集的腹腔液以30004000rpm離心3040分種，收集上清液；將上清液在-2(TC溫度下放置2448小時，凍融化開後再次以30004000rpm離心3040分鐘，離心23次，收集上清液；上清液即為弓形蟲代謝分泌抗原；b、製備抗弓形蟲抗體用弓形蟲抗原免疫羊，瓊擴檢測達l:3264時，採集免疫羊血清，用飽和硫酸法粗提取羊抗弓形蟲抗體，再用凝膠層析法純化羊抗弓形蟲抗體；c、製備膠體金用檸檬酸三鈉將氯金酸還原成4060納米的膠體金顆粒；d、製備弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物將膠體金與弓形蟲代謝分泌抗原按1:0.02(ml/mg)比例攪拌混勻，使之形成穩定的複合物，通過純化濃縮形成弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物；e、將弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體以線形包被在硝酸纖維膜的檢測區和滯控區，充分乾燥。全文摘要一種檢測抗弓形蟲抗體的免疫金標快速檢測試劑及製備方法，在PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，其結合墊包被了帶有弓形蟲代謝分泌抗原的膠體金結合物，硝酸纖維素膜上以線形包被了弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體。通過製備弓形蟲代謝分泌抗原、製備抗弓形蟲抗體、製備膠體金、製備弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物工藝，最後將弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體以線形包被在檢測區和滯控區製成本試劑。本發明特異性強、敏感性高、簡易快速、價格低廉，適合現場檢測，全過程只需20分鐘，操作人員無需專業培訓，按說明書即可完成操作。文檔編號G01N33/544GK101169413SQ200610104848公開日2008年4月30日申請日期2006年10月29日優先權日2006年10月29日發明者張德林,才學鵬,李學瑞,王豔華申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所