二核苷-5'，5'-焦磷酸酯的製作方法

2023-06-08 18:20:56

專利名稱：：二核苷-5'，5'-焦磷酸酯的製作方法
技術領域：
：本發明涉及式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯其中符號A和B各自獨立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′二-脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團；符號X各自獨立地代表氧或硫；符號R和R1各自獨立地代表氫或從1至10個碳原子的烷基基團；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學上可接受的陽離子的鹼的加成鹽。本發明還包括製備式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的方法，將它們包藏在生物載體特別是紅細胞中從而將上述化合物導向特定部位或參與病理學疾病如腫瘤或病毒感染的發展或引起這些疾病如腫瘤或病毒感染的細胞群的方法，以及含有包藏式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的所述生物載體，特別是紅細胞的組合物。包藏生物活性分子的紅細胞膜化學修飾是一種向靶細胞傳遞生理活性形式的被包藏分子的有利方法。參見，例如-DeFloraA.etal.「作為載體和生物反應器的工程化紅細胞」，免疫學年，Basel，Karger，(1993)，第7卷，168-174。-TonettiM.等人，「負載阿黴素的自體紅細胞的肝導向」歐洲癌症研究雜誌，(1991)，第27卷，No.7,947-948。-ZocchiE.等人，「作為釋放抗贅生物藥物5-氟-2』-脫氧尿苷的人和鼠源紅細胞」，生物科學進展，(1991)，第8卷，Pergamon出版社plc.51-57。-DeFloraA.等人，「被囊性5-氟-2』-脫氧尿苷-5』-單磷酸在人體紅細胞中向抗贅生物藥物5-氟-2』-脫氧尿苷的轉化」。美國國家學術科學彙編，(1988)，第85卷，3145-3149。-DeFloraA.等人，「載體紅細胞技術一種用於診斷和治療的多用途工具」，診斷學中的生物技術，Elsevier科學出版社B.V.，(1985)，223-236。上述文章和出版物引用了本領域中進一步的文獻。下列專利文獻也公開了將生物活性物質，特別是磷酸化化合物包藏在轉化紅細胞中的方法和適於其用途的組合物，以及誘導動物產生的細胞，尤其是紅細胞選擇性地挑出其它細胞並與之融合的方法國際專利申請公開號92/22306，美國專利號4,931,276，美國專利號4,652,449以及歐洲專利申請公開號298280。在本說明書和權利要求書中，「非天然存在核苷的5′-C′基團」一詞是指通過除去戊糖基團中5′位置上的羥基從非天然存在的核苷衍生的基團。「符號X各自獨立地代表氧或硫」一語是指每個符號X可以代表氧或硫原子，而與其它假設的含義無關。根據本發明的優選實施方案，所有符號X代表氧或者其中只有一或兩個代表硫而其它代表氧。在後一種情況下，最優選的式(I)化合物是其中代表硫的符號X通過雙鍵與磷原子直接相連或者是基團XR或(和)XR1的一部分的那些化合物。術語「生物學上可接受的陽離子」是指適用於藥學實際的陽離子並且包括那些對式(I)化合物的生物載體無毒並適合於將其包藏到所述載體的過程的陽離子。當符號R和/或R1獨立地代表氫時，式(1)化合物可以與提供生物學上可接受的陽離子的鹼形成加成鹽。可以用式(I)的化合物代表這樣的鹽，其中基團XR和/或XR1中的符號X代表陰離子形式的氧和/或硫原子(即O-和/或S-)並且符號R和/或R1代表生物學上可接受的陽離子。藥學實際應用中可接受的陽離子是從鹼或鹼土金屬如鈉、鉀和鎂，銨，以及脂肪族、脂環族和芳香族胺如甲胺、二甲胺、三乙醇胺、呱啶、哌嗪、N-甲基哌啶、N-甲基哌嗪、嗎啉和甲基吡啶衍生的陽離子。適於藥學實際應用以及包藏過程的生物學上可接受的陽離子是，例如，Na+和K+。術語「從1至10個碳原子的烷基基團」是指直鏈或支鏈烷基殘基，其可選擇性地含有不飽和和/或一或兩個選自羥基、巰基、氯、碘、氟、溴、氨基、(C1-C4)烷基氨基、二-(C1-C4)烷基氨基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)烷硫基的取代基。優選地，上述術語是指1至4個碳原子的烷基基團如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、和2-甲基丙基，其可選擇性地含有一或兩個如上所述的取代基。進一步優選的本發明化合物組包括其中符號A、B和X如上述規定而符號R和R1各自獨立地代表氫或上述(C1-C4)烷基的那些式(I)化合物。這一組優選的化合物還包括其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學上可接受的陽離子如Na+、K+、和其它上面提到的陽離子的鹼的加成鹽。最優選的本發明化合物組是其中符號A和B如上述規定，所有符號X代表氧而R和R1代表氫的式(I)的那些衍生物及它們與生物學上可接受的陽離子如Na+或K+的鹽。可以說明本發明的某些具體的式(I)二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的實例具體表示於下列表I中。表1AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB表1(續)AB其中A和B至少一個代表從5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷衍生的5′-C′基團的上述式(I)二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯可用作抗腫瘤治療藥和其中A和B至少一個代表選自下列非天然存在的核苷的5′-C′基團的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯可用作抗病毒治療藥，特別是抗逆轉錄病毒感染如HIV感染，這些非天然存在的核苷是胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷，以及腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷。根據上述特性，含有兩種類型上述5′-′C′基團的二核苷可以用作抗腫瘤和抗病毒藥。製備二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的方法是按照已在本領域描述過的方法進行的。參見例如A.M.Michelson，「通過陽離子交換進行核苷酸酐的合成」，於生物化學生物物理學報，(1964)，91，1-13。按照該方法，式(II)的磷酸核苷其中A、X和R具有如上的同樣含義，其通過與活化劑如焦磷酸四苯基酯或氯基磷酸二苯基酯(diphenylphosphochloridate)反應在磷酸部分的XH基團上活化，形成上述磷酸核苷的活化磷酸酯。然後將活化磷酸酯與式(III)的磷酸核苷反應其中B、X和R1具有如上的同樣含義，通過活化的磷酸二苯基酯部分的替代從活化的磷酸酯形成式(I)化合物。用於製備本發明的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的方法的其它例子可以從US4855304引用的文獻中獲得，US4855304公開了一些適用於抑制植物病毒複製的二核苷焦磷酸酯和焦磷酸酯類似物。國際專利申請公開號WO91/00867描述了具有生物活性包括抗病毒活性的5′-二磷酸己糖核苷。在本發明有代表性的實施方案中，基本上在A.M.Michelson所述的條件下進行上述反應途徑，即，先將式(II)的磷酸核苷或其鹽(如鈉、鋰、或鋇鹽)轉化成與受阻叔胺鹼如三正丁基胺或三正辛基胺、或與受阻季銨鹼如甲基-三-正辛基氫氧化銨的相應鹽。通常通過將磷酸核苷或其鹽(優選鈉鹽)洗脫流過吡啶鎓型的離子交換(強陽離子)樹脂經過吡啶鎓中間體的形成進行這一轉化。該步驟的主要目的是消除鈉或其它礦物陽離子。然後將吡啶鎓鹽與含等摩爾量受阻叔胺鹼的甲醇溶液一起保溫，然後減壓乾燥生成與受阻叔胺鹼的鹽。然後在不幹擾反應物的過量酸受體(每摩爾活化劑1.2至2摩爾)如脂肪族叔胺(如三正丁胺)或雜環叔胺(如N-甲基哌啶、N-甲基吡咯烷)的存在下使式(II)磷酸核苷的鹽與過量(每摩爾磷酸核苷1.5至2.5摩爾)活化劑(如氯基磷酸二苯基酯或焦磷酸四苯基酯)接觸。一般通過使用惰性非質子傳遞有機溶劑如環醚(如二噁烷)或其混合物作為溶劑的無水條件下在室溫進行活化反應。在某些情況下，建議加入其它溶解力高的惰性有機溶劑(如二甲基甲醯胺)以提高反應物濃度，從而提高反應速度。在上述條件下，活化的磷酸酯的形成通常在2至5小時內完成。然後在惰性有機非質子傳遞溶劑如吡啶、六甲基磷醯胺二甲基甲醯胺或其混合物的存在下使活化的磷酸酯和磷酸核苷(III)與受阻叔胺鹼或氫氧化季銨(如前面例舉的那些)的鹽反應。反應一般在20℃和35℃之間的溫度範圍進行，在15至30小時期間內完成。一般通過在減壓下蒸發溶劑，然後付諸常用的純化步驟，包括色譜法，來回收反應粗品。例如，對於其中R和/或R1是氫的式(I)化合物的純化步驟，將粗產物懸浮於水中，用鹼金屬氫氧化物水溶液調節pH值至8後，用不與水相混合的非質子傳遞有機溶劑如乙醚萃取該溶液。通過聯合柱色譜法(如用凝膠過濾柱並以水作洗脫劑)和HPLC法(如用直鏈烴官能化的矽膠反相柱並以於水中的甲醇線性梯度洗脫，或者用強陰離子交換樹脂並以於水中的氯化鋰線性梯度洗脫)對含二核苷焦磷酸酯的水相進行進一步純化。本發明的式(I)二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯通常是穩定的化合物，特別是在與生物學上可接受的陽離子的鹽如鈉或鉀鹽的形式下分離時很穩定。因此，儘管當R和/或R1表示氫時，它們可以游離酸的形式得以分離和表徵，(例如，通過將鹽的水溶液載於H+型離子交換樹脂上並用水或甲醇和水的混合物洗脫樹脂)，但優選以鹽的形式保存或使用，最優選為生物學上可接受的陽離子的鹽。可以按照標準方法從相應的非磷酸化核苷製備非天然存在的磷酸核苷的原料。現有技術中所述的這樣的非磷酸化前體的例子是胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(AZT)，腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(DDA)，5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷(FDU)，胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(DDC)，尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(AZDDU)，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(DDI)，以及鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(DDG)。參見下列文獻LeveneP.A.，生物化學雜誌，(1929)，第83卷，793；Davoli等人，化學學會雜誌，(1948)，967；HowardG.A.等人，化學學會雜誌，(1947)，1052；RobinsM.J.等人，美國化學學會雜誌(1971)，9320，5277；ChuC.K.等人，有機化學雜誌(1989)，54，2217；CollaL.等人，歐洲醫學化學治療雜誌，(1985)，No.4,295。在大多數情況下上述前體也是可商購的(例如從SIGMA化學公司，St.Louis，MO，美國，購買)。將非磷酸化的前體轉化成相應的磷酸化化合物的方法也是現有技術已知的。一個典型的製備核苷單磷酸酯的步驟包括在縮合劑如二環己基碳化二亞胺的存在下於室溫使核苷與磷酸氰乙基酯在無水吡啶中的溶液相接觸。通常可以在與鹼或鹼土金屬的鹽如鈉、鋰或鋇鹽的形式下回收和純化最終產物。在某些情況下，核苷單磷酸酯是可以商購的(例如5-氟-2′-脫氧尿嘧啶-5′-單磷酸酯，SIGMA化學公司，St.Louis，MO，美國)。具有抗病毒(包括抗HIV)和/或抗腫瘤活性的式(I)化合物可用作藥物組合物的活性成分。為了證實某些代表本發明的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的抗-HIV活性，在HTLV-1轉化的細胞素MT-4上進行了體外實驗，MT-4對HIV感染高度敏感並可被HIV感染。用HIV誘導的細胞病變的抑制作為終點。該試驗的步驟基本上如R.Pauwels等人所述「用於檢測抗HIV化合物的基於四唑鎓的快速自動比色檢查法」，病毒學方法雜誌，20，(1988)，309-321。下列表II顯示了二-(胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷)-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯(二-AZT-5′，5′，P1，P2-焦磷酸酯)的50％有效濃度(IC.50)和50％細胞毒濃度(CC50)。用胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(AZT)作為對照化合物。表II抗-HIV體外活性本發明的化合物特別適於用作前藥而被細胞攜帶到特定的細胞群，化合物在這裡可被迅速地體內轉化成活性形式。紅細胞提供了作為藥物或前藥的生物載體的極難得的機會，這是因為(a)其代謝非常簡單，因此具有相對有限的可與包藏的藥物或前藥相互作用的酶系列，(b)其可到達身體的各個部位，並可作為生物反應器按照被控制的動力學將包藏的藥物或前藥轉化成活性形式，該動力學可以根據所涉及的酶的性質來設計，以及(c)其適於相對簡單的修飾，該悠飾可以提供對富含血細胞的組織或器官的位點特異性導向。我們知道某些核苷藥物的活性形式是磷酸化衍生物。具體地說，一般認為三磷酸化衍生物是通過具有抗-HIV活性的脫氧核苷抑制病毒複製的形式。但是，三磷酸化的脫氧核苷不適用於臨床，因為它們不能通過細胞膜。因此，抗-HIV脫氧核苷作用效果的一個重要因素是它們如何能容易地進入靶細胞並通過細胞內酶進行磷酸化。無論怎樣，我們知道核苷不僅可以進行細胞內磷酸化而且將核苷轉化成治療活性較低或根本無活性的化合物。細胞內酶還可以促進其它反應。如果這些反應的速率與磷酸化過程的速率差不多一樣，那麼核苷的治療效果則被降低。這些問題非常重要，因為某些靶細胞(如巨噬細胞)磷酸化酶水平較低，因此給予所述被感染細胞磷酸化形式的抗病毒核苷可以在病毒抑制方面明顯優越於一般的給藥途徑。本發明的一個目的是開發二核苷-5′，5′-P1，P2焦磷酸酯的性能，該化合物被包藏於紅血細胞中並被特異地帶到靶細胞，在這裡可以通過酶途徑裂解焦磷酸酯鍵生成兩個核苷酸。包含有磷酸化基團的兩個核苷酸以適當的化學形式實現所需生物功能或者迅速轉化成三磷酸化衍生物的活性形式，基本上沒有失活。二核苷焦磷酸酯比相應的單磷酸酯更適合包藏和導向技術，這是因為一旦它們被引入紅細胞則其更加穩定，並且在包藏和前藥位點特異性傳遞之間的時間裡從紅血細胞膜擴散出來的速率較低。這些特徵更適於設計將核苷從其載體釋放出來的動力學。二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的另一個優點是其可以通過焦磷酸酯鍵結合不同的核苷對。這些核苷對顯示互補或協同作用，並將兩個核苷引入載體，傳遞到特定的靶細胞並在每一個步驟中同時以所希望的活性形式釋放。被包埋的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的典型靶細胞是巨噬細胞或者肝臟或脾臟身體部位。將所使用的紅細胞導向網狀內皮系統的方法已有描述，例如，ZocchiE.等人，在「載體紅細胞的肝或脾導向鼠體模型」中，生物技術和應用生物化學(1987)，9，423-434以及在上面提到的TonettiM.等人的論文中有述。這些方法使靶細胞或身體部位能識別生物載體並與它們反應，從而引起位點特異性和受藥代動力學控制的藥物釋放。將抗腫瘤藥和前藥包藏於適宜的生物載體如紅細胞中，已被認為是一種完成選擇性器官導向使對治療反應和毒性均有陽性作用的治療劑緩慢釋放出來的有效方法(ZocchiE.等人，在美國國家學術科學彙編(1989)，第86卷，2040-2044)。將5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯前藥包藏到紅血細胞中的一個實施例(參見DePloraA.等人，美國國家學術科學彙編(1988)，第85卷，3145-3149)。表明為了達到對活性非磷酸化藥物釋放的藥代動力學上有用的控制，需要共同包藏等摩爾量的其它三磷酸核苷。同時夾帶其它核苷酸會引起生物相容性及選擇的核苷前藥與伴隨的三磷酸核苷之間的相互反應問題。本發明提供的一個優點在於可以製備不需要同時夾帶其它三磷酸核苷的5-尿嘧啶前藥而完成適當的藥代動力學控制一個表現出有用的藥代動力學特徵的本發明前藥的代表性實例是含有兩個通過焦磷酸酯鍵相連的5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-[二-(5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷)-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯]，核糖核苷單位的二核苷-5′，5′-焦磷酸酯，該焦磷酸酯相對於相應的單磷酸酯表現出較低的脫磷酸化速率。將代表本發明的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯包藏到人紅血細胞中的典型實例是通過低滲透析和等滲釋放法用二-AZT-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯進行的(DeFloraA.等人，美國國家學術科學彙編(1988)，第85卷，3145-3149)。所用的兩步法包括首先的透析步驟，在輕度旋轉下於4℃將經洗滌和包裝的紅細胞(80％血細胞比容)對70倍體積的溶血緩衝液(5mMNa2HPO4添加4mMMgCl2，pH7.2，26mOsm)透析35分鐘。該步驟之後在透析袋中加入10-15M二-AZT-5′，5′-，P1，P2-焦磷酸酯並在同樣條件下再透析15分鐘。然後通過將紅細胞在4℃對添加了10mM葡萄糖和腺苷的pH7.4、310mOsm的磷酸鹽-鹽水緩衝液透析40分鐘而使其重封。然後用冰冷的NaCl水溶液(0.9％體積/體積)充分洗滌載帶的紅細胞並在37℃於10％血細胞比容的自體血漿中溫育。用下列方法以連續的時間間隔測定血漿和紅血細胞中二核苷焦磷酸酯及其代謝產物的濃度。在不同的時間，取出1ml保溫混合物的等分試樣。從血漿中分離紅細胞後，分別萃取這兩部分。將100微升包裝的紅血細胞(RBC)加在100微升水中，然後在劇烈振蕩下加入68微升3.7M高氯酸(PCA)。將樣品離心並用30微升3M碳酸鉀中和上清液，然後將樣品離心以除去形成的沉澱。用50微升3.7MPCT處理150微升血漿部分，用27微升3M碳酸鉀中和120微升的上清液並離心。將每種萃取液5微升注射到配備有HPODSHypersil4.6×60mm3微米粒經柱子的HP1090儀(Hew/ett-Packard，PaloAlto，加拿大)中。溶劑程序是一線性梯度，從100％緩中液A(0.1MKH2PO4加5mM氫氧化叔丁銨(TBA)，pH4.9)開始，在30分鐘後增加到100％的緩衝液B(0.1MKH2PO4加5mM)TBA，在40％(體積/體積)的甲醇水中，pH4.9)；將100％緩衝液B維持到50分鐘。流速為0.4ml/分鐘，用設置在265nM的分克克度計監測洗脫出來的化合物。各種化合物的保留時間是(用分鐘表示)AZT，17；AZT-單磷酸酯，21；二-AZT-焦磷酸酯，33。下面的表III和IV記載了上述測定的結果。表III二-AZT-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯及其代謝物在人血紅細胞中的濃度，以nmol/ml表示表IV二-AZT-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯及其代謝物在人血漿中的濃度，以nm/ml表示上面的數據表明人紅血細胞中二-AZT-5′，5′，P1，P2-焦磷酸酯濃度達到的值符合目前實踐中的治療要求，並且藥物從紅細胞中釋放出來的速率很低。上述特徵使含有抗-HIV有效量的磷酸二核苷前藥的工程紅細胞特別適用於治療目的。實際上我們知道可以對人紅細胞進行適當修飾以包藏核苷藥物並給予特定的導向性質，並且這樣的修飾除了選擇性導向特徵外並不改變紅細胞的生理行為(國際專利申請公開號WO92/22306)。根據B.L.Robbins等人在抗微生物劑和化學治療，第38卷，No.1，(1994)115-121中報導的數據；我們估算了當將其導向HIV-感染的細胞如巨噬細胞時相應於治療有效作用的紅細胞中二核苷焦磷酸酯的濃度。實際上，這些作者指出，在用AZT有效治療下的HZV感染患者中，外用血單核細胞(PBMCs)內AZT三磷酸酯的細胞內濃度的範圍是從5×10-15mol/106細胞至9×10-14mol/106細胞。當至少一個含表III中所示濃度值的二核苷焦磷酸酯的紅細胞(相當於約2×10-10mol/106細胞至4×10-10mol/106細胞)被PBMCs(例如單核細胞或巨噬細胞)捕獲時這些值明顯增加。如上所述，本發明的二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯可以用作口服或胃腸外途經給藥的藥物組合物的活性成分，或者可以用作包藏到生物載體中的活性藥物或前藥，這些生物載體被導向特定的身體部位(如肝/脾)和/或細胞群(如單細胞/巨噬細胞)。當二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯被用作口服或胃腸外給藥的藥物組合物的活性成分時，所述組合物通常含有有效治療量的二核苷焦磷酸酯以及惰性載體和/或稀釋劑。例如，在口服給藥的液體藥組合物中，水，優選滅菌水，可以用作載體和/或稀釋劑。口服給藥的固體藥物組合物可以含有粘合劑、崩解劑和潤滑劑、例如，白明膠、黃蓍膠或微晶纖維素可以用作粘合劑，藻酸或玉米澱粉可以用作崩解劑；硬脂酸鎂或鈣可以用作潤滑劑。某些固體形式，如膠囊，可以含有液體載體，例如脂油。對於胃腸外給藥形式，優選的載體和/或稀釋劑可以是生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水。口服和胃腸外給藥的液體藥物組合物還可以包括其它相容性成分，如溶劑、防腐劑、和/或輔料，比如聚乙二醇、丙二醇或甘油作為溶劑，羥苯甲酸甲酯作為抗菌劑。抗壞血酸或二硫化鈉作為抗氧化劑，乙二胺四乙酸作為螯合劑，乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽作為緩衝劑。另外，不破壞二核苷焦磷酸酯所需作用的其它活性成分也可被摻入藥物製劑。通常口服或胃腸外藥物組合物在患者體內應該能夠提供0.1至3.0μM範圍的血清濃度。但是，可以使用在該範圍之外的劑量，這被理解為必須根據疾病的類型和嚴重程度、被治療患者的狀態以及所用的特定二核苷焦磷酸酯來調整每日劑量。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等等可以用作口服給藥的固體劑型，而溶液、懸液、配劑和糖漿是優先選用的液體劑型。胃腸外製劑通常包括用於皮下注射或靜脈給藥的溶液。單位劑型通常可以含有10至500mg的二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯，這一表示具有純粹的舉例性質，對本發明的範圍沒有任何限制。當本發明的二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯用作包藏在適宜生物載體中的藥物或前藥時，含有這樣的二核苷焦磷酸酯的藥物組合物優選含有轉化紅細胞。修飾這些轉化紅細胞的表面使其可被生物體細胞特異性識別，包含於這些紅細胞中的二核苷焦磷酸酯在生物體中將被整合。例如，歐洲專利申請公開號517986描述了一種完成被人或動物病原性RNA-型病毒宿主細胞的所述特異性識別的典型途徑，這一途徑主要是基於在包藏二核苷焦磷酸酯之前或之後紅細胞的表面蛋白和/或跨膜蛋白與可被吞噬細胞(例如淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞)識別的特異性抗體結合，該吞噬細胞連續地吞噬紅細胞。按照優選的實施方案，載帶二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯後，首先用表面或跨膜蛋白的可逆群集劑處理紅細胞，然後用共價連接的交聯劑處理，最後在自體血漿中溫育以結合IgG分子。這些紅細胞通過它們的受體被人巨噬細胞識別，然後以約每個巨噬細胞一個紅細胞的比率被吞噬。下面的實驗詳細描述了載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細胞到人巨噬細胞的導向。使人紅細胞進行上述的載帶二-AZT-焦磷酸酯的步驟，然後修飾紅細胞以提高巨噬細胞對它們的識別，這一步驟詳細描述於EP-A-517986中。如表V所示，發現載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細胞表現出約1,500IgG分子/細胞，並且比未處理過的紅細胞被更有效地吞噬。通過將50μlRBC與100μl5mMHEPES在含4％(重量/體積)牛血清白蛋白和0.1mCi放射性標證的蛋白質A(比活力30mCi蛋白質)的pH7.4的PBS中測定了結合的IgG/細胞的數量。將樣品在室溫保溫30分鐘，然後洗滌4次，在Beckman5500γ-計數器中計數結合的放射活性。如M.Magnani等人的論文中所述在體外測定載帶藥物的紅細胞的細胞吞噬「磷酸化形式的抗逆轉錄病毒核苷類似物導向巨噬細胞體外和體內研究(1992)，美國國家學術科學彙編，896477-6481。」表V巨噬細胞對載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細胞的識別N.D.未檢出還估算了通過載體紅細胞向巨噬細胞傳遞的二-AZT-焦磷酸酯的量及其在巨噬細胞中的穩定性。如上所述使人紅細胞以0.4μmol/mlRBC的濃度載帶二-AZT-焦磷酸酯，然後將其進行修飾以提高巨噬細胞對它們的識別。以每個巨噬細胞100個RBC的比率向巨噬細胞中加入修飾過的紅細胞併吞噬24小時。用RP-MI1640介質充分洗滌未消化的RBC(3次)並用0.9％(重量/體積)氯化銨洗滌一次。然後在RBC細胞吞噬後的0和24、48或72小時時製備巨噬細胞高氯酸提取液，用K2CO3中和。然後中和提取液，通過用IsoluteTMC8柱(得自國際吸著劑技術公司，英國)按照廠方說明並用甲醇作為洗脫劑進行二-ATZ-焦磷酸酯的固相萃取。如上所述用HPLC分析提取液。二-AZT-焦磷酸酯在人巨噬細胞中的穩定性的結果示於圖1中。還進行了在被貓免疫缺陷型病毒(FIV)感染的貓單核細胞衍生的巨噬細胞上載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細胞的抗病毒活性的測定。按M.Magnani等人對人單核細胞衍生的巨噬細胞的報導培養了貓單核細胞衍生物巨噬細胞「磷酸化形式的抗逆轉錄病毒核苷類似物導向巨噬細胞體外和體內研究(1992)，美國國家學術科學彙編，896477-6481。經15小時以每個巨噬細胞100個RBC的比率加入載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細胞。載帶藥物的紅細胞的二-AZT-焦磷酸酯含量是)0.4μmol/mlRBC。充分洗滌除去未消化的紅細胞」。作為對照用「無載」紅細胞(即以同樣步驟處理紅細胞但不加入二-AZT-焦磷酸酯處理巨噬細胞培養物。如M.Bendinelli等人論文中所述用330i.d./孔的貓免疫缺陷性病毒(pisaM-2)感染接受載帶二-AZT-焦磷酸酯的RBC、「無載」RBC或未加入RBC的巨噬細胞培養物「貓免疫缺陷性病毒和用於AIDS研究的模型以及重要的貓病原體，(1995)，臨床微生物學評論，887-112。感染8小時後，充分洗滌(6次)細胞培養物以除去任何與巨噬細胞結合的病毒顆粒。然後將細胞培養物在37℃、5％CO2中保持3天，分離它們的全部DNA。用標準技術獲得來自巨噬細胞的DNA分離物，該技術包括於37℃用8M脲、0.3MNaCl、10mMTrisHcl，pH7.5溶解細胞60分鐘。用苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1體積/體積/體積)萃取，用乙醇沉澱DNA。通過在兩個階段擴增病毒p24gag基因的498個鹼基對進行FIV原病毒DNA的分析。擴增的第一階段使用了下列引物相應於病毒序列中核苷酸1025-1044的5』-GG(ATATCCTATTCAAACAG-3』(有義)(SEQIDNo1)以及相應於核苷酸1680-1699的5』-CC-TATATTTTACGTTGAGAA-3』(反義)(SEQIDNo2)。對於擴增的第二步驟所用的引物為相應於病毒序列核苷酸1141-1160的5』-TATGGTTTACTGCCTTCTCT-3』(有義)(序列IDNo3)以及相應於核苷酸1619-1638的5』-GAATTCG-GTCTTTCATGGGA-3』(反義)(SEQIDNo4)。在Perkin-Elmer循環變溫加熱器中進行的PCR是在終體積為50μl的含168ng基因組DNA、50mllKCl、10mMTricHCl、pH8.3、1.5mMMgCl2、0.005％Tween-20、0.005％NP-40、0.001％白明膠、150nM每種引物及5uReplithermDNA聚合酶(Epicentre技術公司，Madison，威斯康星州，美國)的溶液中完成的。將含有第一對引物的反應混合物在94℃變性1分鐘，在50℃退火1分鐘，在72℃延伸2分鐘，最後在72℃延伸15分鐘，如此循環40次。然後將如此擴增的混合物10μl與第二對引物在完全同樣的條件下再次擴增。通過在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳分析PCR產物，將其轉移到尼龍膜上並與克隆到TA-克隆質粒(Invitrogen公司，SamDiego，加利福尼亞，美國)中的498個鹼基對的p24gag基團探針雜交。作為內部對照，用下列引物擴增貓己糖激酶基因相應於人己糖激酶I型cDNA中核苷酸2198-2219的5』-ACATG-GAGTGGGGGGCCTTTGG-3』(有義)(SEQIDNo5)。以及相應於核苷酸2328-2349的5』-GTTGCGGACGATTTCACCCAGG-3』(反義)(SEQIDNo6)。用FIV己糖激酶探針檢測。結果示於圖2。在用鼠免疫缺陷病毒感染的鼠巨噬細胞上進一步測定了載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細胞的抗病毒活性。從C57BL/6小鼠的腹膜腔獲得鼠巨噬細胞，如Rossi等人論文中所述進行培養「利用二脫氧胞苷和二脫氧胞苷5』-三磷酸來抑制鼠體逆轉錄病毒誘發性免疫缺陷性疾病」，(1993)，J.AIDS，61179-1186。對於FIV的載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細胞及感染如文中所述，但有下列改進按照標準方法(D.E.Yetter等人「鼠體逆轉錄病毒誘導性免疫缺陷性疾病(MAIDS)所需要的功能性T-淋巴細胞」，(1987)，實驗醫學雜誌，1651737-1742)從SC-1細胞以不含細胞的上清液製備鼠免疫缺陷病毒(LP-BM5)。按照下列步驟進行病毒DNA的PCR分析。用下列寡核苷酸引物擴增缺陷性病毒基因組(BM5d)5』-引物，相應於病毒序列中核苷酸1456-1473的5』-AACCTTCCTC-CTCTGCCA-3』(有義)，以及3』引物，相應於BM5d基因組的核苷酸1579-1596的5』-ACCACCTCCTGGGCTTTC-3』(反義)。第二對寡核苷酸引物用於擴增203個鹼基對的小鼠G6PD基因。這種擴增作為內部對照(自身標準)估算小鼠基因組中相對的BM5d整合。用於該擴增的核苷酸引物是5』-引物，5』-TGTTCTTCAAC-CCCGAGGAT-3』(有義)和3』-引物，5』-AAGACGTCCAGGAT-GAGGTGATC-3』(反義)。此處所用的四種引物描述於G.Brandi等人的論文中「在LP-BM5鼠體誘發性免疫缺陷性疾病模型中長期施用2』，3』-二脫氧尿苷的功效和毒性」，(1995)，抗病毒化學和化學治療，6，153-161。在Perkin-Elmer循環變溫加熱器中進行的PCR是在終體積為25μl的含0.229μg基因組DNA，相當於約114,000個細胞、50mMKCl、10mMTris-HCl、pH8.3、1mMMgCl2、0.05％吐溫-20、0.005％NP-40、0.001％白明膠、四種三磷酸脫氧核糖核苷中的每一種150μM、每種引物20pmol以及2.5UReplitherDNA聚合酶(Epicontre技術公司，Madison，威斯康星州，美國)的溶液中完成的。將反應混合物在95℃變性30秒，在58℃退火30秒，在72℃延伸30秒，最後在72℃延伸10分鐘，如此循環37次。通過在2.5％瓊脂糖凝膠上電泳分析PCR產物，轉移到尼龍膜上並與32P-標記的D30或G6PD探針雜交。用得自Bio-Rad(Bio-Rad實驗室，Hercules，加利福尼亞，美國)的隨機引物DNA-標記試劑盒標記DNA探針。結果示於圖3。含有夾帶本發明的二核苷焦磷酸酯的修飾後的紅細胞的藥物組合物通常是以等滲溶液，如注射用生理鹽水或葡萄糖等滲溶液的形式存在，或者以可用於靜脈內或腹膜內給藥的注射用溶液的臨時配製製劑形式存在。這些藥物組合物通常含有的紅細胞的量為優選從2至8ml，二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯的量為約0.5至約10mM。本發明被包藏的二核苷焦磷酸酯的給藥劑量為約0.5至約80μg二核苷焦磷酸酯/每十克體重的患者，應該理解，給出的這些數值是說明性的，而對本發明的範圍不構成任何限制。——圖1顯示了二-AZT-焦磷酸酯在人巨噬細胞中的穩定性。——圖2顯示了通過分析巨噬細胞中的FIV原病毒DNA測定的載帶雙-AZT-焦磷酸酯的紅細胞對抗FIV(PisaM-2)感染的貓單細胞-衍生的巨噬細胞的抗病毒活性。——圖3顯示了通過分析缺陷性病毒基因組(Bμ5d)DNA測定的載帶雙-ATZ-焦磷酸酯的紅細胞對抗被鼠免疫缺陷病毒(LP-BM5)感染的鼠巨噬細胞的抗病毒活性。實施例1次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯的製備。將100mg(0.4毫摩爾)次黃嘌呤2′，3′-二脫氧-D-核糖糖苷加入於1ml磷酸三乙酯中的0.11ml(1.2毫摩爾)磷醯氯中，並將混合物於-5℃攪拌2小時。用10ml冰冷的乙醚萃取混合物4次，然後在0℃於2000轉/分離心5分鐘。除去乙醚後，將殘餘物於0℃懸浮在5ml水中，並立即用冷的1NNaOH中和。將混合物在冰浴上放置10分鐘並將pH值調節至7。真空乾燥後，將殘餘物溶於25ml甲醇中。將溶液加在含35g懸浮於乙醚中的矽膠的柱子上。通過如下洗脫柱子獲得了純化的標題化合物(流速3ml/分鐘)150ml乙醚，150ml乙醚∶甲醇60∶40(體積/體積)的混合物，為了洗去所有雜質，最後，用約300ml甲醇洗脫純化的產物。總過程產率為85％。用Hewlett-Packard5989A儀器記錄的質譜表明相應於標題化合物[M-1]-離子的分子離子在m/z315.2。實施例2胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯的製備。將240mg(1mmol)胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(AZT)溶於2ml1M磷酸氰乙基酯在吡啶中的溶液中，30℃真空乾燥。將殘餘物懸浮於19ml無水吡啶中，然後於30℃真空乾燥，兩次。加入9.6ml無水吡啶和1.15g二環己基碳化二亞胺後，將混合物於25℃攪拌48小時。然後，加入2.8ml水並將溶液於25℃再攪拌30分鐘，最後於30℃真空乾燥。將殘餘物懸浮於9.6ml水中，過濾並在濾器上用9.6ml水再次洗滌。然後，在合併的濾液中加入19.6ml1NNaOH並使混合物回流加熱40分鐘。將溶液冷卻至25℃，經過用15gDowex_50(H+)離子交換樹脂填充的柱子洗脫除去鈉陽離子。用飽和Ba(OH)2溶液調節洗脫液的pH值至7.5以沉澱磷酸鹽陰離子。離心後，在30℃真空下使上清液減少至較小體積(30ml)，再次離心除去殘餘的無機磷酸鹽。在4℃向混合物中加入二倍體積的乙醇以沉澱標題化合物的鋇鹽。最後用丙酮和乙醚洗滌沉澱並在緩和的氮氣流下乾燥。將標題化合物的鋇鹽懸浮於5ml水中並與2gDowex_50(H+)離子交換樹脂的混合。然後將混合物加在含2gDowex_50(H+)離子交換樹脂的柱子上。用30ml甲醇∶水的1∶1(體積/體積)混合物洗脫柱子，最後用1NNaOH中和洗脫液，然後將含AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽的溶液冷凍乾燥，給出產率為70％的標題產物的鈉鹽。用Hewlett-Packard5989A儀器記錄的質譜表明相應於標題化合物[M-1]-離子的分子離子在m/z346.50。實施例3胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′，5′-P1-P2-焦磷酸酯的製備。a)次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯的活化將50mg(0.016mmol)次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯溶於2ml水和1ml甲醇的混合物中，然後將溶液經過1gDowex_50W-X8(吡啶翁型)離子交換樹脂洗脫。用20ml50％甲醇水溶液洗滌柱子並將溶液真空乾燥。將殘餘物懸浮於0.22ml三正辛基胺於1.6ml甲醇的溶液中，然後，攪拌30分鐘，最後在30℃真空乾燥。將所得殘餘物懸浮於1mlN，N-二甲基甲醯胺中並於30℃真空乾燥。這一步驟重複三次。將所得產物加入2.24ml二惡烷、0.096ml氯基磷酸二苯酯和0.137ml三丁基胺的溶液，並將混合物於25℃攪拌3小時。然後將其在旋轉蒸發器中乾燥，在強烈振蕩下向殘餘物中加入16ml乙醚。使混合物在冰上放置30分鐘，然後於1000轉/分鐘離心5分鐘。除去乙醚，將殘餘物溶於0.96ml二惡烷中並於室溫真空乾燥，產物按原樣用於繼續的步驟c)中。b)ATZ-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽將120mg(0.35mmol)AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽溶於2ml水和2ml甲醇中，並使溶液經過1gDowex_50W-X8(吡啶翁型)離子交換樹脂用20ml50％甲醇水溶液洗脫，在旋轉蒸發器中乾燥。然後，向殘餘產物中加入0.49ml三正辛基胺和3.5ml甲醇，攪拌混合物30分鐘，最後在30℃真空乾燥。將殘餘物再懸浮於1.75mlN，N-二甲基甲醯胺中並於30℃減壓(5mm汞柱)乾燥。這一步驟重複三次，得到的產物按原樣用於繼續的步驟c)中。c)反應將步驟a)的活化的次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯溶於0.9ml無水吡啶中，將混合物加入步驟b)的AZT-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽中。之後，向混合物中加入0.16ml六甲基磷醯胺，再在旋轉蒸發器中乾燥。然後加入0.2ml無水吡啶，在25℃攪拌混合物24小時，將殘餘物懸浮於5ml水中並用1NNaOH調節pH值至8，用5ml乙醚萃取溶液3次。分離含上述標題產物的水層並按照下列步驟d)純化產物。d)純化將從步驟c)得到的水溶液的0.5ml等分試樣加在Sephadex_G10柱(55×1.3cm)上並以0.25ml/分鐘的流速用水洗脫。用裝備了反相柱(C18μBondapack_，10μm粒徑)的HPLC儀進一步純化含標題化合物的部分。溶劑程序是在30分鐘內以流速1.5ml/分鐘甲醇在水中的線性梯度從0至30％(體積/體積)。在這些條件下，上述標題化合物表現出的保留時間(Rt)約為7分鐘。合併表現出上述Rt值的部分，加樣至2g離子交換樹脂(Dowex_50W-X8，H+型)上並用20ml水洗脫。將洗脫液冷凍乾燥給出產率為35％的上述標題產物。用Hewlett-Packard5989A記錄的質譜表現出相應於標題化合物的[M-1]-離子的分子離子在m/z644。在pH4.940％(體積/體積)甲醇於水的磷酸鹽緩中液中紫外吸收光譜在252nm表現出最大吸收，在270nm有一肩峰。實施例4二-(胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷)-5′-5′-P1-P2-焦磷酸酯的製備a).AZT-5′-單磷酸酯的活化將100mg(0.26mmol)AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽溶於30ml水和2ml甲醇的混合物中，然後將溶液經過1gDowex_50W-X8(吡啶翁型)離子交換樹脂用20ml50％甲醇水溶液洗脫，然後在室溫真空乾燥，將殘餘物懸浮於0.45ml三正辛基胺和3.2ml甲醇的混合液中並在25℃攪拌30分鐘，然後，將其在室溫真空乾燥。將殘餘物溶於2mlN，N-二甲基甲醯胺中並減壓(5mm汞柱)乾燥。這一步驟重複三次。然後，向殘餘物中加入4.48ml二惡烷、0.2ml氯基磷酸二苯酯和0.27ml三正丁基胺，在25℃攪拌3小時後，將混合物於30℃減壓(5mm汞柱)乾燥，然後，在強烈振蕩下向殘餘物中加入16ml己烷。並將混合物在冰上放置30分鐘，然後於1000轉/分鐘離心5分鐘。將殘餘物溶於2.0ml二惡烷中並真空乾燥，回收的產物按原樣用於繼續的步驟c)中。b)AZT-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽將100mg(0.26mmol)AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽溶於3ml水和2ml50％甲醇水溶液的混合物中，將溶液載於含1gDowex_50W-X8(吡啶翁型)離子交換樹脂的柱子上並用20ml50％甲醇水溶液洗脫，將洗脫液真空乾燥。然後，向殘餘物中加入0.45ml三正辛基胺和3.2ml甲醇，使混合物在25℃攪拌30分鐘，，最後在室溫真空乾燥。將殘餘物懸浮於2mlN，N-二甲基甲醯胺中並減壓(5mm汞柱)乾燥。這一步驟重複三次，得到的產物按原樣用於繼續的步驟c)中。c)反應將步驟a)的活化的AZT-5′-單磷酸酯溶於1.8ml無水吡啶中，並將溶液與0.32ml六甲基磷醯胺一起加至步驟b)的AZT-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽中。室溫真空乾燥後，將殘餘物懸浮於6ml水中，用1NNaOH調節pH值至8，用6ml乙醚萃取混合物3次。離心分離含上述標題產物的水層，回收產物，並按照下列步驟d)純化。d)純化將從上面的步驟c)中得到的水溶液用反相HPLC柱純化。將水溶液的1ml等分試樣加在Bio-sil_C18Hl90-10柱(Biorad)(250×10mm，10μm粒徑)上，並用如下所述的乙醇於水中的線性梯度洗脫洗脫上述標題化合物，Rt為11分鐘。合併表現出上述Rt值的部分，加樣至2g離子交換樹脂(Dowex_50W-X8，H+型)上並用30ml甲醇∶水50∶50(體積/體積)的混合物洗脫。將洗脫液冷凍乾燥給出產率為35％的上述標題產物。用Howlett-Packard5989A儀器記錄的質譜表現出相應於上述標題化合物的[M-1]-離子的分子離子在m/z675.9。在pH4.9，40％(體積/體積)甲醇於水的磷酸鹽緩衝液中紫外吸收光譜在265nm處表現出最大吸收。在D2O中，在VarianGemini分光光度計上，在20℃至30℃的溫度範圍在200MHz記錄的1H-NMR譜表現出的最明顯的化學位移在(δppm)1.639(-CH3)，2.225(-O-CH2)，3.943(寬1′-CH-和2′-CH2)，4.275(3′-CH)，5.955(4′-CH)，7.439(芳香族質子6-CH)。實施例55-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷，胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的製備a)AZT-5′-單磷酸酯的活化將70mg(0.182mmol)AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽按照實施例4步驟a)中所述的同樣步驟進行活化，並將產物按原樣用於下列步驟c)中。b)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽按照實施例4步驟b)中所述的同樣步驟將100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽轉化成相應的三正辛基銨鹽，並將產物按原樣用於下列步驟c)中。c)反應將步驟a)的活化的AZT-5′-單磷酸酯溶於1ml無水吡啶中並將溶液和0.2ml六甲基磷醯胺一起加入步驟b)的5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽中。真空乾燥後，向殘餘物中加入0.2ml無水吡啶，並將混合物在室溫下攪拌24小時。在30℃於旋轉蒸發器中蒸去溶劑後，將殘餘物懸浮於5.3ml水中，通過加入1NNaOH調節pH值至8，用5ml乙醚萃取混合物3次。分離含上述標題產物的水層，回收產物並按照下列步驟d)進行純化。d)純化將從步驟c)中得到的水溶液加在含有2g事先用5mMHCl處理的Dowex_1-X8(C1-型)離子交換樹脂的柱子上。流速為0.4ml/分鐘。用10ml5mMHCl洗滌柱子，然後使用流速為0.5ml/分鐘的在5mMHCl中從0至600mM的LiCl線性梯度洗脫。收集並合併含標題產物的部分，並通過加入1MLiCl調節pH值至6.5。然後在30℃於旋轉蒸發器中將溶液濃縮至體積為4ml。用反相HPLC柱(μBondapack_C18，250×10mm，10μm粒徑)以流速為4ml/分鐘的水洗脫，上樣量為500μl，通過HPLC進一步純化濃縮液。將回收的部分冷凍乾燥，產生25mg標題產物的鋰鹽。按照實施例4步驟d)的最後一部分所述的同樣步驟以實際的定量產率將該產物轉化成標題的游離酸化合物。用Hewlett-Packard5989A儀器記錄的質譜表現出相應於標題化合物的[M-1]-離子的分子離子在m/z653。實施例6二-(5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷)-5′5′-P1，P2-焦磷酸酯的製備a)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯的活化按照實施例4步驟a)中所述的同樣步驟活化100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽。b)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽按照實施例4步驟b)中所述的同樣步驟將100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽轉化成相應的三正辛基銨鹽；並將產物按原樣用於下列步驟c)中。c)反應將步驟a)的活化的5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽溶於1ml無水吡啶中並將溶液和0.2ml六甲基磷醯胺一起加入步驟b)的5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯三正辛基銨鈉鹽中。真空乾燥後，向殘餘物中加入0.2ml無水吡啶，並將混合物在室溫下攪拌24小時。在30℃於旋轉蒸發器中蒸去溶劑後，將殘餘物懸浮於6ml水中，通過加入1NNaOH調節pH值至8，用6ml乙醚萃取混合物3次。分離含上述標題產物的水層，回收產物並按照下列步驟d)進行純化。d)純化將從步驟c)中得到的水溶液加在含有2g事先用5mMHCl處理的Dowex_1-X8(C1-型)離子交換樹脂的柱子上。流速為0.4ml/分鐘。用10ml5mMHCl洗滌柱子，然後使用流速為0.4ml/分鐘的在5mMHCl中從0至600mM的LiCl線性梯度洗脫。收集並合併含上述標題產物的部分，並通過加入1MLiCl調節pH值至6.5。然後在30℃於旋轉蒸發器中將溶液濃縮至體積為2ml，然後在冰中通過加入2倍體積的乙醇∶丙醇1∶4(體積/體積)混合物沉澱化合物，最後用丙酮和乙醚洗滌沉澱的化合物，用緩和的氮氣氣流乾燥，得到上述標題化合物的鋰鹽，按照實施例3步驟d)最後一部分中所述的同樣步驟將其轉化為游離酸。產率30％。用Hewlett-Packard5989A儀器記錄的質譜表現出相應於標題化合物的[M-1]-離子的分子離子在m/z653。在40％(體積/體積)甲醇水的pH4.9磷酸鹽緩衝液中的紫外吸收光譜在269nm處表現出最大吸收。序列表(1)一般信息(I)申請人(A)名稱GRUPPOLEPETITS.P.A.(B)街道ViaR.Lepetit34(C)城市GERENZANO(VA)(E)國別義大利(F)郵編(ZIP)I-21040(II)發明名稱二核苷-5′，5′-焦磷酸酯(III)序列數目6(IV)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentinRelease#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQIDNO1的信息(I)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「合成寡核苷酸」(IV)反義否(XI)序列描述SEQIDNO1GGCATATCCTATTCAAACAG20(2)SEQIDNo2的信息(I)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「合成寡核苷酸」(IV)反義否(XI)序列描述SEQIDNO2CCTATATTTTACGTTGAGAA20(2)SEQIDNo3的信息(I)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「合成寡核苷酸」(IV)反義是(XI)序列描述SEQIDNO3TATGGTTTACTGCCTTCTCT20(2)SEQIDNo4的信息(I)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「合成寡核苷酸」(IV)反義是(XI)序列描述SEQIDNO4GAATTCGGTCTTTCATGGGA20(2)SEQIDNo5的信息(I)序列特徵(A)長度22個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/dess＝「合成寡核苷酸」(IV)反義否(XI)序列描述SEQIDNO5ACATGGAGTGGGGGGCCTTTGG22(2)SEQIDNo6的信息(I)序列特徵(A)長度22個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/dess＝「合成寡核苷酸」(IV)反義是(XI)序列描述SEQIDNO6GTTGCGGACGATTTCACCCAGG2權利要求1.式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯其中符號A和B各自獨立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團；符號X各自獨立地代表氧或硫；符號R和R1各自獨立地代表氫或從1至10個碳原子的烷基基團；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學上可接受的陽離子的鹼的加成鹽。2.權利要求1的二核苷，其中符號A代表選自下列非天然存在的核苷的5′-C′-基團胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷，尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷以及鳥嘧呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷；符號B代表選自下列非天然存在核苷的5′-C′基團胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷，胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷以及鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷；選自通過雙鍵與磷原子直接相連的那些化合物以及是基團XR和XR1的一部分的那些化合物的一個或兩個符號X代表氧或硫並且其它的符號X分別代表氧；符號R和R1各自獨立地代表氫或1至4個碳原子的烷基基團；以及其中R和/或R1代表氫的化合物與提供生物學上可接受的陽離子，優選鈉和鉀離子，的鹼的加成鹽。3.如權利要求2的化合物，其中所有符號X代表氧，R和R1均代表氫，及其與生物學上可接受的陽離子，優選Na+或K+，的鹼的鹽。4.權利要求2的化合物，其中每個符號A和B代表下列組合的非天然存在的核苷的5′-C′基團1)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷2)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷3)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷4)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷5)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷6)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B)次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷7)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷8)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3-二脫氧-D-核苷9)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B腺嘧呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷10)A腺嘧呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B腺嘧呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷11)A次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷12)A次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷13)A次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷14)A胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷15)A腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷16)A尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷17)A鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B鳥嘌呤-2′-，3′-二脫氧-D-核苷18)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷19)A尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷20)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷21)A尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷；每個符號X代表氧；每個符號R和R1代表氫；及其與提供生物學上可接受的陽離子，優選鈉或鉀離子，的鹼的加成鹽。5.權利要求4的化合物，其中I)A代表非天然存在的核苷胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′基團而B代表非天然存在的核苷次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′基團；II)每個符號A和B代表非天然存在的核苷胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2，′3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′-基團；或者III)A代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷的5′-C′基團，而B代表非天然存在核苷胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′基團；或者IV)每個符號A和B代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷的5′-C′基團；每個符號X代表氧；每個符號R和R1代表氫；及其鈉鹽和鉀鹽。6.權利要求5的化合物，其中每個符號A和B代表非天然存在核苷胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′基團；每個符號X代表氧；每個符號R和R1代表氫；及其它們的鈉和鉀鹽。7.權利要求1至6任何一項中的化合物作為藥物的用途。8.權利要求1至4任何一項中的化合物，其中至少一個符號A和B代表選自下列非天然存在的核苷的5′-C′基團胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，尿嘌呤-3′-疊氮基-2′，3-二脫氧-D-核苷鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷其作為抗病毒劑的用途，特別是對抗逆轉錄病毒感染如貓和鼠免疫缺陷性病毒感染和HZV感染。9.權利要求6的化合物作為抗病毒劑的用途，特別是對抗逆轉錄病毒感染如貓和鼠免疫缺陷性病毒感染和HIV感染。10.權利要求1至4任何一項中的化合物，其中至少一個符號A和B代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷的5′-C′-基團，其作為抗腫瘤劑的用途。11.權利要求5I)、II)和III)項的任何化合物用於生產抗-HIV劑的用途。12.權利要求6的化合物用於生產抗-HIV劑的用途。13.權利要求5III)項的任何化合物用於生產抗腫瘤劑的用途。14.一種含有式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的藥物組合物其中符號A和B各自獨立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團；符號X各自獨立地代表氧或硫；符號R和R1各自獨立地代表氫或從1至10個碳原子的烷基基團；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學上可接受的陽離子的鹼的加成鹽。15.權利要求1至6的任何一項中的化合物用於生產抗腫瘤和/或抗病毒感染的治療劑的用途，其特徵在於所述化合物被包藏在生物載體中。16.根據權利要求15的用途，其中的生物載體是轉化紅細胞。17.一種含有包含式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的轉化紅細胞的組合物其中符號A和B各自獨立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團；符號X各自獨立地代表氧或硫；符號R和R1各自獨立地代表氫或從1至10個碳原子的烷基基團；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學上可接受的陽離子的鹼的加成鹽。18.一種製備式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2焦磷酸酯的方法其中符號A和B各自獨立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團；符號X各自獨立地代表氧或硫；符號R和R1各自獨立地代表氫或從1至10個碳原子的烷基基團；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學上可接受的陽離子的鹼的加成鹽。該方法包括活化式(II)的磷酸核苷的XH基團其中A，X和R具有與上面相同的含義，以形成活化的磷酸酯並將該活化的磷酸酯與式(III)的酸核苷與受阻叔胺鹼的鹽反應其中B、X和R1具有與上面相同的含義。19.根據權利要求18的方法，其中通過與焦磷酸酯四苯基或磷酸一醯氯二苯基酯反應活化式(II)的磷酸核苷的XH基團。20.根據權利要求18和19中任何一項的方法，其中式(III)的磷酸核苷與受阻叔胺鹼的鹽是與三正丁基胺、三正辛基胺或甲基-三正辛基氫氧化銨的鹽。21.根據權利要求18、19和20中任何一項的方法，其中活化的式(II)磷酸核苷和式(III)的磷酸核苷與受阻叔胺的鹽的反應是在不幹擾反應物的過量酸受體，優選脂肪族叔胺或雜環叔胺存在下進行的。22.根據權利要求18、19、20和21中任何一項的方法，其中活化的式(II)的磷酸核苷與式(III)的磷酸核苷的鹽的反應是在室溫下在惰性有機溶劑優選二噁烷的存在下進行的，可選擇地還存在溶解力高的其它惰性有機溶劑，優選二甲基甲醯胺。23.一種將權利要求1至6中任何一項的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯包藏到紅細胞中的方法，其特徵在於將紅細胞(I)在溶血性緩衝液中透析，(II)在同樣的透析條件下與二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯接觸，(III)通過針對比所述溶胞產物高滲的磷酸鹽緩中液透析進行重封，並且(IV)充分洗滌重封后的紅細胞。24.含權利要求1至6中任何一項的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的轉化紅細胞的組合物，進一步的特徵在於修飾了這種轉化紅細胞的表面，從而可被人或動物病原性逆轉錄病毒的宿主細胞特異性識別。25.製備權利要求24的組合物的方法，其特徵在於如下處理含二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的紅細胞(I)先用表面蛋白或跨膜蛋白的可逆群集劑處理，(II)然後用共價連接交聯劑處理，最後，(III)在自體血漿中溫育以結合IgG分子。全文摘要本發明描述了選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′，5′-焦磷酸酯，以及它們的生產和作為抗腫瘤和抗逆轉錄病毒感染，包括HIV感染的治療劑的用途。化合物可以作為藥物組合物的活性發生成分或作為包藏在生物載體如轉化紅細胞中的前藥來給藥，從而導向引起病理學疾病產生的特定細胞群。文檔編號C07H21/00GK1154112SQ95194159公開日1997年7月9日申請日期1995年7月10日優先權日1995年7月10日發明者A·德·費羅拉,U·本納蒂,M·基維尼申請人:格魯波萊佩蒂特公司,熱那亞技術研究大學