乳酸桿菌改善玩賞動物食物中賴氨酸的吸收的用途

2023-06-09 02:55:16

乳酸桿菌改善玩賞動物食物中賴氨酸的吸收的用途
【專利摘要】本發明涉及非致病性、刺激賴氨酸吸收的乳酸桿菌菌株的選擇和用途；優選路氏乳酸桿菌菌株，例如路氏乳酸桿菌菌株ATCCPTA-6127。本發明還包括使用這種菌株例如用於改善玩賞動物的皮毛和爪的質量的產品和方法。
【專利說明】乳酸桿菌改善玩賞動物食物中賴氨酸的吸收的用途 發明領域
[0001] 本發明涉及非致病性、刺激賴氨酸吸收的乳酸桿菌菌株的選擇和用途，和使用這 種菌株用於改善玩賞動物的皮毛和爪的質量的產品和方法。

【背景技術】
[0002] 1908年，俄國生物學家Eli Metchnikoff確信某些保加利亞和俄國公民長 壽在於消費大量發酵乳產品（1)。這些食物中的關鍵生物隨後被鑑定為嗜酸乳桿菌 (lactobacillus acidophilus)--種乳酸生產細菌（2)。該乳酸生產細菌由此因它們生產 乳酸的能力而被命名。然而，生產乳酸僅僅是由這個細菌集合得到的諸多益處之一。
[0003] 基於Metchnikoff和其他人的工作，科學家們發展了益生微生物的想法，直接將 活的乳酸生產細菌和酵母飼餵動物以改善它們的健康和特性。所觀察到的益處可能由以下 原因引起的：1)競爭消化道中的附著部位，2)競爭必需的營養物質，3)產生抗微生物的物 質，4)增加有益細菌的生長和5)刺激免疫系統（3)。
[0004] 一些致病菌通過破壞小腸內壁而降低動物吸收營養物質的能力（4)。研究表明乳 酸生產細菌附著於小腸並產生防止致病生物結合腸壁的物質（5)。此外，有益細菌的附著可 以增加小腸的吸收表面積並提高酶活性，使動物吸收更多營養物質（8,6)。
[0005] 促進健康和致病的細菌的生長都需要某些營養物質。乳酸生產細菌可以利用維生 素、胺基酸或也另外支持有害細菌的生長的其他營養物質（7)。
[0006] 相當多的研究集中於直接飼餵微生物培養物產生抑制致病生物的物質的能力。乳 酸、乙酸和甲酸降低腸內pH以產生不適合有害生物的環境（4)。乳酸生產細菌還分泌過氧 化氫，產生不利於需氧微生物的條件（8)。
[0007] 已經鑑定了兩組抗微生物物質，低分子量的抗微生物物質，例如路氏乳酸桿菌產 生的無蛋白菌質（reuterin);和細菌素。細菌素是微生物產生的物質，抑制通常遺傳上相 關的細菌的生長（4)。細菌素是多肽且蛋白酶破壞他們的抑制特性，而無蛋白菌質是一種廣 譜抗微生物物質，不是多肽且它的抗微生物活性不受蛋白酶影響。
[0008] 研究已證明了乳酸生產細菌抑制大腸桿菌（E. coli)、鼠傷寒沙門氏桿菌 (Salmonella typhimurium)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)和產氣莢膜梭菌 (Clostridiumperfingens)的能力。減少引起腹瀉的生物在新生和幼年動物中尤為重要。
[0009] 然而對伴生動物中的益生菌研究很少。最近的一項研究（9)調查了嗜酸乳桿菌 DSM 13241在犬中的應用。根據它的生長特徵、對病原體的抗微生物活性和在腸模型中的存 活率選擇這個菌株。飼餵健康狗導致糞便中可回收乳酸桿菌數量顯著增加，梭菌屬數量伴 隨減少。研究人員做出結論飼餵益生菌劑引起腸微生物學和全身效應方面的積極改變，提 示免疫系統刺激，如在人類消耗乳酸桿菌種屬後在他們中觀察到的（10)。
[0010] 像狗、貓、紹（Mustela vison)和藍狐（Alopex Iagopus)屬於食肉目哺乳動物。食 肉動物適合於相對濃縮和很易消化的飲食，其特點是胃和相對短且簡單的腸道。貂缺少盲 腸且消化道短，結腸中細菌活性非常有限。狗和狐具有一個小容量的盲腸和一個非囊狀的 結腸，但是一些細菌發酵在盲腸和結腸進行（11)。
[0011] 蛋白對於身體組織的生長、修復和維持是至關重要的。它形成酶和抗體的基礎。 對於動物和鳥類，很多蛋白被用作製造皮毛、羽毛和爪的能量，主要是a-角蛋白。a-角 蛋白由長的a螺旋多肽組成，這些多肽彼此旋繞形成三股螺旋。通常對於毛皮動物，含硫 胺基酸通常被認為是最有限制作用的胺基酸（12)。製造毛皮、羽毛和爪的蛋白只能來自飲 食。飲食必須供給充足的胺基酸以滿足必需胺基酸的需要，足夠過量的胺基酸供給製造非 必需胺基酸的氮。飲食中額外的蛋白不能儲存並將轉變成脂肪或被腎臟排洩出去。
[0012] 賴氨酸是必需胺基酸，因此不能通過轉氨基作用合成。它有助於通過產生肉毒鹼 使脂肪變得對身體有用，從身體去除毒素，製造皮毛、羽毛和骨頭。高水平增加對精氨酸的 需要。賴氨酸在完整蛋白中高度不穩定。它與葡萄糖反應，並且在溫暖和潮溼環境下反應 加快。對幼年豬和家禽的研究發現賴氨酸是對生長最有限制作用的胺基酸（例如Boisen et al. , 2000 ; (13,14)。
[0013] 甲硫氨酸和半胱氨酸是營養胺基酸，並且是基本胺基酸中最具活性的胺基酸。它 們用於製造這種重要的分子，如肉毒鹼（用於運輸脂肪酸）、肌酸、煙酸、聚胺和嘌呤（用於 產生尿酸）。它們還用於製造皮毛和羽毛。半胱氨酸可以從甲硫氨酸合成，因此它被分類為 非必需胺基酸。然而，半胱氨酸及其氧化產物胱氨酸可以滿足總含硫胺基酸的大約百分之 五十的需要，這樣可以降低對甲硫氨酸的需要。甲硫氨酸不能從半胱氨酸合成，因此它是必 需胺基酸。在缺乏胱氨酸的情況下，甲硫氨酸可以滿足對含硫胺基酸的全部需要。一些研 究已經發現甲硫氨酸是對貂的毛髮生長和皮毛質量最具限制作用的胺基酸（15,16,17,18， 19,20,21)〇
[0014] 在大多數家庭寵物中，健康的皮和毛通常表明動物身體健康。因為皮和毛問題在 家庭寵物中是普遍的，已經進行很多研究提供修復皮和毛狀況變質的飲食，由此提供基本 水平的健康皮和毛，如下文所述。
[0015] 研究表明補充鋅及亞油酸的全面且均衡的商業狗糧可以使狗的皮和毛狀況顯著 和實質性提高。與接受標準飲食的對照組相比時，狗在皮毛光澤度和皮毛大小方面表現出 顯著的改善。專利EP0987961B1中也描述了這個方法。
[0016] 營養可能影響皮膚屏障功能。國際專利申請W00207531A1公開了含抗微生物的脂 肪酸的飲食脂類在製備用於改善或維持皮膚健康和/或皮毛質量的食品組合物中的用途。
[0017] 在Kerminen-Hakkio的研究（21)中，紹中蛋白質量粗劣使毛皮長度平均降低4cm。 在優質、高水平蛋白組觀察到最好的總體皮毛質量。作者做出結論增加飲食中蛋白水平不 能完全彌補必需胺基酸供給的缺乏。
[0018] 有些情況下，仍應添加非必需胺基酸以確保最佳的可利用量。我們發現可利用的 甲硫氨酸應該與貓和狗的食物中也存在的賴氨酸保持平衡，以改善皮毛和爪的生長和質 量。一個更好地利用來自食物的賴氨酸的值得稱讚的方法不是僅僅飼餵更多，而是尋找改 善它吸收的方法。
[0019] 眾所周知含乳酸桿菌（LAB)的飼料能促進生長，這是因為其通常能改善營養物質 的吸收。在今天的現代動物育種中，很多國家已經使用含益生微生物的飼料添加劑以催肥 動物。動物消耗LAB時，它們移植於消化道並開始產生消化澱粉（澱粉酶）、蛋白（蛋白 酶）、脂肪（脂肪酶）的酶。這些酶有助於將飼料中複合有機化合物分解為低分子化合物。 這些動物可以更好利用這些低分子化合物。它們的食慾改善，飼料轉化率更好和生產性能 改善。LAB在動物飼養中的應用還有助於免疫防禦病原體。LAB將碳水化合物分解為乳酸， 乳酸降低消化道內容物的PH，形成極其不利於病原體微生物的環境。
[0020] 我們驚訝地發現食物或胃腸道中存在的不同LAB菌株可以不同地輔助胺基酸的 吸收，尤其是賴氨酸。而且這種差異可以測定，從而使得選擇會最大量改善賴氨酸吸收的特 定乳酸桿菌菌株是可能的。
[0021] 已經證明Caco-2細胞系統是對營養物質[肽和胺基酸（23, 24, 25, 26)]和藥物產 品（27, 24)的腸上皮滲透性研究都合適的模型系統。Twaites 1996年進行的研究描述了腸 內Caco-2細胞運輸二鹼胺基酸賴氨酸的能力（28)。
[0022] 然而對乳酸桿菌促進或增加玩賞動物中來自飲食的胺基酸吸收很少研究。
[0023] 使用限定的四種不同細菌（莢膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus)、食酸 產喊菌（Alcaligenes acidovorans)、短芽抱桿菌（Bacillus brevis)和堅強芽抱桿菌 (Bacillus firmus))的混合物,和天然氣作為碳源和能源,經由連續細菌發酵產生的細菌蛋 白膳食（BPM)是一種新的高蛋白飼料成分。使用藍狐作為模型動物進行研究，擴展對BPM 作為狗糧成分的認識。動物通常顯示出很好的生長，但是沒有數據顯示皮毛質量改善（7)。
[0024] 專利WO 01/17365A1描述了改善和保養寵物皮毛系統的方法，其中營養劑可以是 前生物或任何益生微生物。該 申請人:提及益生菌類的十七種不同細菌，和將近三十種益生 微生物的具體實例。凝結芽抱桿菌（Bacillus coagulans)Lacris_S菌株（SANKYO LIFETECH CO. , LTD, Hongo, Bunkyo-ku，Tokyo, Japan)是唯一描述的特定菌株，沒有提及優選菌株的 選擇，也沒有任何基於LAB菌株刺激賴氨酸吸收的能力。
[0025] 儘管為了動物皮毛和羽毛更好而使用益生菌是本領域已知的，但是以前沒有認識 到不同的益生菌株改善動物，例如狗或貓的皮毛和爪的質量的能力差異，和這種能力與益 生菌株對動物腸道吸收賴氨酸的影響有關。
[0026] 因此本發明的一個目的是通過分析它們直接促進或改善動物吸收賴氨酸的能力 來選擇這種更合適的菌株，和將該選擇出的菌株用於動物飼料或添加劑中，例如以改善狗 或貓的皮毛和爪質量的應用。路氏乳酸桿菌的一個新菌株ATCC PTA-6127顯示出刺激皮毛 動物中的賴氨酸吸收和這個特性引起皮毛和爪質量改善。
[0027] 由下列公開內容和所附權利要求，其他目的和優點將更加明顯。


【發明內容】

[0028] 本發明涉及非致病性、刺激賴氨酸吸收的乳酸桿菌菌株的選擇和用途，和使用這 種菌株用於治療和預防玩賞動物的皮毛和爪的質量的產品和方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1條線圖顯示了 7. OX 107cfu/ml不同的LAB菌株對Caco-2腸細胞吸收賴氨 酸的影響。所用菌株是路氏乳酸桿菌ATCC PTA-6127、路氏乳酸桿菌1068、路氏乳酸桿菌 SD2112和凝結芽孢桿菌Lacris-S菌株。

【具體實施方式】
[0030] 本發明涉及非致病性、刺激賴氨酸吸收的乳酸桿菌菌株的選擇和用途，和使用這 種菌株用於治療和預防玩賞動物的皮毛和爪的質量的產品和方法。
[0031] 本發明的一個目的是通過分析它們直接促進或改善動物吸收賴氨酸的能力來選 擇最好的合適菌株，和將該選擇出的菌株用於動物飼料或添加劑中，例如以改善狗或貓的 皮毛和爪質量的應用。路氏乳酸桿菌的一個新菌株（ATCC PTA-6127)顯示出刺激皮毛動物 中的賴氨酸吸收和這個特性引起皮毛和爪質量改善。這個菌株根據布達佩斯條約於2004 年7月22日保藏在美國典型培養物保藏中心（Manassas，VA)。
[0032] 本發明的產品可以是飼料或片劑或膠囊或其他製劑等劑型，和製備本領域已知的 下述產品的標準方法，包括所選擇的LAB培養物。
[0033] 儘管這裡陳述了某些代表性的實施方案，但是本領域技術人員會很容易地認識到 可以進行改動而不背離本發明的精神或範圍。
[0034] 實施例1 ?細胞培養物的製備
[0035] Caco-2 細胞（ATCC 號：HTB-37, Manassas，VA，USA)如（Thwaites et al.，1993a ; 1993b)所述進行培養。細胞單層製備如下：高密度（4. 4-5. 0° -IO5細胞/cm2)接種在12或 24. 5mm直徑組織培養插片上[Transwell聚碳酸酯濾膜（Costar)]。細胞單層維持在37°C, 含5% CO2的溼潤空氣下。顯微術估測細胞融合併測定跨上皮電阻。
[0036] 接種後18-25天和飼餵後18-24小時進行放射性同位素標記的賴氨酸流通量測 定。
[0037] 實施例2.選擇刺激腸吸收賴氨酸的路氏乳酸桿菌菌株的方法
[0038] Caco-2細胞單層用500ml改良的Krebs緩衝液（其組分（全部為mmol/1)，NaCl 140, KCl 5. 4, CaCl22. 8, MgSO4L 2, NaH2PO4O. 3, KH2PO4O. 3, HEPES 10,葡萄糖 10 (用 Tris 鹼 調pH至7.4, 37°C ))洗滌4次，或適當時，用不含Na+的Krebs緩衝液（如上，除了用膽鹼 Cl替換NaCl和NaH2PO4，並放置於含2ml預熱（37°C )的不含Na+的Krebs緩衝液的6孔板 (Life Technologies)。等分的新鮮Krebs緩衝液或不含Na+的Krebs緩衝液置於容器中。 使用追蹤濃度（〇. 2microCi/ml)的放射性同位素標記的賴氨酸（(3H)Amersham)。然後上皮 層與各種待測試的LAB孵育；路氏乳酸桿菌ATCC PTA-6127、路氏乳酸桿菌1068、路氏乳酸 桿菌SD2112和凝結芽孢桿菌Lacris-S菌株以7. 0xl07cfu/ml的濃度在37°C孵育6小時。 每60分鐘從基礎溶液中取200微升樣品測定跨上皮運輸。用閃爍計數法測定放射性同位 素標記。結果參見圖1。
[0039] 實施例3.含所選擇菌株的飼料產品的製備
[0040] 在這個實施例中，為了將菌株添加到商品中，通常基於良好的生長特性和實施例2 中在先提及的選擇中的有利結果來選擇路氏乳酸桿菌"Shiny" (ATCC PTA-6127)。使用工業 上培養乳桿菌的標準方法來培養路氏乳酸桿菌Shiny菌株並將其凍幹。
[0041] 飼料混合物由玉米、玉米麩質、雞和魚粉、鹽、維生素和礦物質組成。將飼料混合物 裝入預調節器並潤溼。離開預調節器的潤溼飼料接著被裝入擠壓機-蒸煮器並膠質化。離 開擠壓機的膠質化基質通過模具衝壓並壓出。離開模具壓頭的壓出物切成適於飼餵給狗的 塊，在大約140°C乾燥大約20分鐘並冷卻形成球丸。球丸的水活度大約為0. 6。
[0042] 球丸用包含動物脂肪的包被基質噴霧。在動物脂肪凝結之前，通過乾燥噴霧以IO7 CFU/克產品的水平應用益生菌路氏乳酸桿菌"Shiny"(ATCC PTA-6127)，以便其附著於或部 分滲入脂肪層中。37°C保存8周的結果表明微生物顯示出極好的穩定性且在正常條件下保 存一年後可能仍是穩定的。
[0043] 實施例4.狗試驗
[0044] 使用45隻比格犬進行試驗。試驗開始之前，給狗飼餵與實施例3中飲食相當的 標準乾燥飲食一周。在試驗開始之前，立即通過實施例5描述的評價小組評價參與的狗的 皮毛狀況。將狗分為三組，每組15隻狗。一組狗飼餵覆蓋有路氏乳酸桿菌"Shiny"（ATCC PTA-6127)的乾燥球丸，另一組狗飼餵覆蓋有路氏乳酸桿菌菌株1068的乾燥球丸和第三組 繼續飼餵標準飲食，由此提供對照飲食。所有的組自由攝取食物和水。12周後，再次評價 每隻狗的皮毛狀況。飼餵覆蓋有路氏乳酸桿菌"Shiny"的球丸的狗比飼餵覆蓋有路氏乳酸 桿菌1068菌株的球丸的狗和對照組的狗具有明顯更光亮的外觀並且沒有顯示出明顯的皮 屑。
[0045] 實施例5.爪和皮毛的生長特性
[0046] 技術熟練的趾甲美容師對實施例4中的狗爪進行打分，兩位有經驗的專門研究比 格犬品種的狗形象裁判對皮毛進行打分。試驗之前，根據皮毛和爪的質量將狗平均分布在 各組之中。12周後，評價趾甲被切割生長時對抗裂開的質量並以五個水平的等級進行打分， 1是低劣和5是極好。評價皮毛的總體質量、皮屑、皮毛長度和光澤度，等級範圍從1 (最差） 至5 (最好）。

【權利要求】
1. 一種路氏乳桿菌菌株在改善伴生動物的皮毛和爪質量的應用，所述應用包括選擇非 致病性、刺激賴氨酸吸收的路氏乳桿菌菌株，和給動物提供含有所選擇菌株的生物學上純 培養物的產品。
2. 根據權利要求1所述的應用，其中，所述路氏乳桿菌菌株為路氏乳酸桿菌1068、路氏 乳酸桿菌SD2112。
3. -種用於改善玩賞動物的皮毛和爪質量的產品，所述產品包括： a) -種根據權利要求1或2所選擇的路氏乳酸桿菌菌株的生物學上純培養物；和b) - 種飼料混合物，其中所述飼料混合物覆蓋有包被基質，隨後被所選擇菌株的生物學上純培 養物的噴霧乾燥覆蓋。
4. 根據權利要求3所述的產品，其中，所述飼料混合物被製成球丸。
5. 根據權利要求3所述的產品，其中，所述路氏乳桿菌菌株為路氏乳酸桿菌1068、路氏 乳酸桿菌SD2112。
6. 根據權利要求3所述的產品，其中，所述飼料混合物包含玉米、玉米麩質、雞和魚粉、 鹽、維生素和礦物質。
7. 根據權利要求3所述的產品，其中，所述包被基質包含動物脂肪。
8. 根據權利要求7所述的產品，其中，在動物脂肪凝結之前，通過噴霧乾燥以IO7CFU/ 克產品的水平應用生物學上純培養物，以便其附著於或部分滲入脂肪層中。
9. 根據權利要求3所述的產品，其中，所述產品的劑型選自由球丸、片劑和膠囊組成的 組。
【文檔編號】A23K1/16GK104206706SQ201410340998
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2008年2月29日 優先權日:2007年3月2日
【發明者】埃蒙·康諾利布·莫爾斯泰姆 申請人:生命大地女神有限公司