水稻OsAHL蛋白及其應用的製作方法

2023-06-09 07:06:41

專利名稱：：水稻OsAHL蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及水稻OsAHL蛋白及其應用。
背景技術：
：水稻是農業生產中用水最多的作物，其節水抗旱性對我國的糧食、水和生態安全具有重要意義。利用基因工程技術進行分子育種，將抗旱基因轉入優良的水稻品種中，從而改良其抗旱性，培育即抗旱又高產優質的農作物新品種是抗旱育種的有效途徑之一。發掘抗旱基因是抗旱分子育種的基礎。已發表的抗旱相關基因及其蛋白的研究越來越多。廣義上的反式轉錄調節因子包括所有具有調節基因轉錄功能的蛋白分子，它們在植物生長和抗逆性方面發揮著巨大作用。AT-hook是一種具有以GRP3個胺基酸殘基為核心序列的短小模體，有著很強的結合染色體中富含A/T的序列的能力。DUF296功能域是一類在原核生物和植物中保守的蛋白序列和結構，其具體功能尚無研究涉及。含DUF296功能域的蛋白往往同時伴隨有一個AT-hook模體出現。這種含DUF296功能域的蛋白分子能夠形成同源三聚體，並且形成這種結構需要乙醯基以及Zn2+等配體的調節。這一類蛋白識別並結合在富含A/T的核骨架結合區MARs區域的特殊序列。擬南芥中的研究發現，含DUF296功能域的蛋白分子結合於常染色質表面，調整染色體核仁結構，從而調節相關區域內的基因表達，故將其歸於轉錄調節因子。
發明內容本發明的目的是提供一種與水稻抗逆性相關的OsAHL蛋白、其核酸序列、含該核酸序列的載體及宿主。本發明的另一目的是提供編碼水稻OsAHL蛋白的基因在提高植物抗逆性(包括但不限於抗旱、耐冷、抗鹽等)中的應用。本發明的再一目的是提供編碼水稻OsAHL蛋白的基因在調節植物葉綠體發育相關基因表達，增強光合系統活性和穩定性中的應用。為了實現本發明目的，本發明的一種水稻OsAHL蛋白，其具有如SEQIDNo.1所示的胺基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列。前述的水稻OsAHL蛋白，其結構中含有AT-hook模體和DUF296功能域。編碼上述水稻OsAHL蛋白的基因，優選地，其編碼的核苷酸序列與SEQIDNo.2所示的從69-1169位的核苷酸序列具有至少70%的同源性；或者所述基因編碼的核苷酸序列能與SEQIDN0.2中從69-1169位的核苷酸序列雜交。更優選地，編碼上述水稻OsAHL蛋白的基因具有如SEQIDNo.2所示的從69-1169位的核苷酸序列。本發明還提供一種核酸探針分子，其含有上述水稻OsAHL基因編碼序列的8-100個連續核苷酸，優選地，含有上述水稻OsAHL基因編碼序列的15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼水稻OsAHL相關的核酸分子。本發明還提供含有上述水稻OsAHL基因的載體。本發明還提供含有上述水稻OsAHL基因載體的宿主。優選地，所述宿主為真核細胞。更優選地，所述宿主為水稻。本發明還提供含有上述水稻OsAHL基因的轉化植物細胞。本發明還提供上述水稻OsAHL基因在提高植物抗逆性(包括但不限於抗旱、耐冷、抗鹽等)中的應用。本發明進一步提供上述水稻OsAHL基因在調節植物葉綠體發育相關基因表達，增強光合系統活性和穩定性中的應用。本發明的目的還可以採用以下的技術措施來進一步實現。前述的水稻OsAHL蛋白，其為具有如SEQIDNo.1所示的胺基酸序列的多肽或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。在本發明中，「分離的」、「純化的，，DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。在本發明中，術語「水稻抗逆蛋白(或多肽)編碼序列」、「調節葉綠體發育蛋白(或多肽)編碼序列」，均指編碼具有水稻OsAHL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.2中第69-1169位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQIDNO.2序列的編碼框第69-1169位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQIDN0.2中第69-1169位核苷酸序列同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出SEQIDNO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件(70-85%序列一致性)下，優選地，在高度嚴緊條件(85%以上序列一致性)下與SEQIDNO.2中從核苷酸第69-1169位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQIDNO.2中從核苷酸第69-1169位的核苷酸序列的同源性至少70%，優選至少80%，更優選至少90%，最優選至少95%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與天然的水稻OsAHL相同功能的蛋白的SEQIDN0.2中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，優選為1-60個，更優選為1-20個，最優選為1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，優選為30個以內，更優選為10個以內，最優選為5個以內)核苷酸。在本發明中，術語「水稻抗旱蛋白或多肽」、「調節葉綠體發育蛋白或多肽」，指具有水稻OsAHL蛋白活性的SEQIDNO.1序列的多肽。該術語還包括具有與天然水稻OsAHL相同功能的SEQIDNO.1序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，優選為1-30個，更優選為1-20個，最優選為1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，優選為10個以內，更優選為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括水稻OsAHL蛋白的活性片段和活性衍生物。本發明的水稻OsAHL多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與水稻OsAHL相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用水稻OsAHL多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發明中，「水稻OsAHL保守性變異多肽」指與SEQIDNO.1的胺基酸序列相比，有至多10個，優選為至多8個，更優選為至多5個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽按照表1進行替換而產生。表1tableseeoriginaldocumentpage5替換前的殘基替換後的殘基優選的替換殘基tableseeoriginaldocumentpage6本發明還包括水稻OsAHL蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然水稻OsAHL相關多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的水稻OsAHL多肽時，可以將水稻OsAHL編碼序列可操作地連接表達調控序列，從而形成水稻OsAHL蛋白表達載體。在本發明中，「可操作地連接」是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連接多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連接編碼序列。一般，「可操作地連接」意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發明中，術語「宿主細胞」為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、菸草細胞和其它植物細胞。還可用Northern印跡法技術分析水稻OsAHL基因產物的表達，即分析水稻OsAHL的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。此外，根據本發明的水稻OsAHL核苷酸序列和胺基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選水稻OsAHL相關同源基因或同源蛋白。為了得到與水稻OsAHL相關基因相關的水稻cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選水稻cDNA文庫，這些探針是在低嚴謹條件下，用32P對水稻OsAHL相關的全部或部分做放射活性標記而得。最適合於篩選的cDNA文庫是來自水稻的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech,Stratagene,PaloAlto,Cal.等。這種篩選方法可以識別與水稻OsAHL相關的基因家族的核苷酸序列。本發明的水稻OsAHL相關核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確順序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可通過化學合成法將突變弓I入本發明蛋白序列中。除了重組法之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人』(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149_2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然後用化學方法加以連接，以產生全長的分子。利用本發明的水稻OsAHL蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與水稻OsAHL相關基因或蛋白發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。藉由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果(1)本發明提供的水稻OsAHL基因及其編碼蛋白在植物抗旱性方面具有明顯的作用，能夠明顯降低在乾旱土地上種植的各種農作物在生物產量上的損失，具有很大的應用價值。(2)利用轉基因技術得到改良的含有本發明水稻OsAHL基因的轉化植物在包括乾旱、低溫、高鹽等條件下，生長、生存狀況明顯優於野生型植物，表明了水稻OsAHL基因能夠明顯提高植物的抗逆性。(3)本發明提供的水稻OsAHL基因不僅能夠有效調節逆境相關轉錄因子，而且能夠直接或間接調節控制葉綠體發育以及光合作用相關功能蛋白和酶系統的表達，具有潛在的、巨大的應用價值。圖1為水稻不同生育期乾旱條件下OSAHL相對表達量變化；圖2為水稻IRAT109苗期在不同逆境脅迫處理下OsAHL相對表達量變化；圖3為水稻IRAT109苗期在不同激素處理下OsAHL相對表達量變化；圖4為本發明的水稻OsAHL(Osllg0149100)蛋白與水稻注釋基因0sl2g0147000、高粱基因Sb08g002940以及Sb05g002940編碼的胺基酸序列之間的同源性比較；圖5為轉OsAHL基因水稻苗期抗逆實驗結果；圖6為乾旱條件下OsAHL過量表達引起水稻的葉綠素含量變化；圖7為轉OsAHL基因超表達水稻成株期乾旱脅迫後表現；圖8表示轉OsAHL基因超表達植株成株期抗旱性提高；圖9為本發明酵母雙雜交實驗中OsAHL的表達載體構件示意圖；圖10為本發明酵母菌株YRG-2內表達驗證OsAHL蛋白及其DUF296結構域具有同源結合能力。具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。以下實施例中未註明具體條件的實驗方法，均按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商建議的條件。實施例1水稻基因OsAHL在水稻品種IRAT109中表達譜分析1.脅迫處理(1)旱處理IRAT109種子催芽後，移栽到土中培養，在苗期(4葉一新)、分櫱盛期(6葉一新)、孕穗期(減數分裂時期)進行旱處理。在各個時期，當盆中土層無水時開始斷水，同時作為旱處理的開始，在旱處理時期的每天同一時間剪取植株葉片，投入液氮中冷凍用於RNA提取。(2)苗期激素與化學試劑處理IRAT109種子催芽後，在發芽盒內水培生長。三葉期後施加營養液(國際水稻所標準營養液)，至幼苗長至30天開始處理。分別以ABA(50uM，150uM)、JA(50uM,150uM)、SA(0.5mM,1.5mM)、H2O2(lOOmM,200mM)、NaCl(lOOmM,250mM,500mM)、甘露醇(Mannitol)(lOOmM,250mM,500mM)處理，每種處理設Ih和2h兩個時間梯度。同時設有正常水管理對照。處理結束後，快速吸乾根表面水分並分別剪取葉片和根，投入液氮冷凍後-80°C保存用於RNA提取。2.RNA的提取取部分組織，在研缽中用液氮冷凍後研磨成粉狀，加入盛有TRIzol試劑(天根生化科技有限公司)的1.5mLEP管，充分振蕩後，室溫放置5分鐘，於4°C，12000r/min離心15min後，上清液移至新的1.5mLEP管中，氯仿去蛋白後，等體積異丙醇沉澱RNA，溶解後用Dnase消化降解殘留DNA。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測定RNA含量。3.定量PCR分析定量PCR體系與方法PCR反應使用美國ABIPRJSM7000定量PCR儀，使用Takara公司的定量PCR試劑盒。每個PCR反應重複三次。反應體系包含SYBRPremixExTaq(2X)12.5μL，正、反向引物(定量PCR擴增引物序列為F5，-CTGGTGGGCTCAGTGTATCG-3，，R:5，-GCCATAGGCGGTGGTAGTG-3，)各0.5μL，各種處理的cDNA模板1μL，加水補足體積至20μL0反應條件如下:95°C10s，然後在95°C5s,60°C31s,循環40次，設定在每個循環中60°CIs時讀取螢光值，同時進行ROX值校正，最後添加螢光PCR產物融解曲線分析，其他具體操作詳見儀器使用說明書。目的基因與參照基因的擴增效率任取一樣品分別稀釋10X、100X、1000X、10000X，取IX10000X各樣品IyL進行定量PCR，方法同上，重複三次，計算目的基因與參照基因的平均CT值以及ΔCT值，通過CDNA濃度梯度的log值對ACT值作圖，根據直線斜率絕對值判斷擴增效率(Kenneth等，2001)。結果分析方法每種處理樣品重複三次，取平均CT值，利用2_ΔΔσ法進行結果分析。定量RT-PCR結果顯示，在水稻苗期、分櫱期及幼穗分化期等不同發育時期，隨著乾旱脅迫處理時間的持續，OsAHL基因的表達量先是快速的增加，達到正常水分處理下表達量的3-5倍，然後緩慢降低，恢復到正常的表達水平。圖1為不同生育期乾旱條件下OSAHL相對表達量變化，其是以水稻品種IRAT109為實驗材料，同時期正常水分下植株為對照(η=3)。誤差線表示3次生物重複的標準誤。在各種激素、鹽、滲透脅迫和低溫(4°C)處理的樣品中，OsAHL基因在根、葉中都有表達。不同濃度的ABA、H202、NaCl、SA、JA、Mannitol處理以及低溫(4°C)均提高了OsAHL基因在水稻葉片中的表達。OsAHL基因在根中對各種處理的響應表達情況不一，在不同濃度的ABA、H202、NaCl、MarmitOl和低溫(4°C)等處理下，OsAHL基因在根中的表達被誘導升高，其促進作用隨濃度升高與處理時間延長而加強。而SA和JA等抑制了OsAHL基因在根中的表達。圖2為水稻IRAT109苗期在不同逆境脅迫處理下OsAHL相對表達量變化，其是以三葉期的水稻IRAT109為實驗材料，分別在(A)4°C冷處理，⑶不同濃度的甘露醇，以及(C)不同濃度的NaCl等逆境下，OsAHL相對表達量明顯提高。誤差線表示3次生物學重複的標準誤。圖3為水稻IRAT109苗期在不同激素處理下OsAHL相對表達量變化，其是以三葉期的水稻IRAT109為實驗材料，分別使用濃度的激素，處理不同的時間。具體激素為(A)ABA；⑶H2O2；(C)茉莉酸JA；⑶水楊酸SA。誤差線表示3次生物重複的標準誤。實施例2水稻OsAHL基因的克隆1.幼苗培育水稻(品種為「IRAT109」)由上海市農業生物基因中心種質資源庫收集保存，將水稻置於35°C萌發48小時，然後播種於溫室中，待水稻葉片為3-5片時，準備提取DNA或RNA。2.RNA的提取按照實施例1中的方法提取RNA。3.基因的全長克隆根據GeneBank中水稻資料庫信息中提供的序列信息，設計引物，採用RT-PCR方法進行cDNA全長克隆。通過RT-PCR[Pfl(SEQIDNO.3)+Prl(SEQIDNO.4)]得到一個包含有完整開放閱讀框在內的cDNA序列(SEQIDNO.2)，長度為1331bp；回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果在NCBI網站上進行BLAST分析，知其與水稻注釋基因L0C_0s04g48900完全匹配，與全長插入片段AK102958.1具有98%同源性。同時，其編碼蛋白與已知禾本科植物高粱(Sorghumbicolor)的Sb08g002940有74%同源性，和Sb05g002940基因的同源性達到79%，與水稻(Oryzasativa)中的0sl2g0147000的同源性也高達69%。這三個基因均具有一個AT_hook和DUF296功能域，但其功能均未知。通過查詢Gramene網站，發現OsAHL基因位於抗旱QTL區間內。其中，SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的信息(I)SEQIDNO.3的信息(i)序列特徵(A)長度19bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述:SEQIDNO.3(2)SEQIDNO.4的信息(i)序列特徵(A)長度22bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQIDNO.4通過組合使用上述方法，獲得了水稻OsAHL蛋白的全長編碼序列(SEQIDNO.2)。(3)SEQIDNO.2的信息(i)序列特徵(A)長度133Ibp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(mRNA，cDNA)，雙鏈(對應染色體基因位點DNA序列)(D)拓撲結構線性(ii)分子類型mRNA，cDNA,DNA(iii)序列描述:SEQIDNO.2實施例3水稻OsAHL基因的序列信息與同源性分析本發明水稻OsAHL全長cDNA的長度為1331bp，其序列如SEQIDN0.2所示，其中開放讀框位於69-1169位核苷酸(1101個核苷酸)。根據全長cDNA推導出水稻OsAHL的胺基酸序列，共366個胺基酸殘基，分子量為37.2k道爾頓，等電點(pi)為7.57，其序列如SEQIDNO.1所示。將水稻OsAHL的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR資料庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現OsAHL基因在核苷酸及胺基酸水平與0sllg0149100基因100%同源。0sllg0149100基因以及與其相關的EST均沒有功能注釋。OsAHL基因位於水稻抗旱QTL區間內，同時從實施例中可以看出，OsAHL基因在乾旱條件下明顯增強表達，因此，可以認為水稻OsAHL基因與水稻的抗旱性相關。圖4為本發明的水稻OsAHL(Osllg0149100)蛋白與水稻注釋基因0sl2g0147000、高粱基因Sb08g002940以及Sb05g002940編碼的胺基酸序列之間的同源性比較。其中，1為水稻OsAHL(Osllg0149100)的胺基酸序列，2為水稻注釋基因0sl2g0147000的胺基酸序列，3為高粱注釋基因Sb08g002940的胺基酸序列，4為高粱注釋基因Sb05g002940的胺基酸序列；方框部分為AT-hook模體，其中的陰影部分為AT-hook核心保守序列；下劃線部分為DUF296結構域的保守位點。實施例4水稻OsAHL蛋白或多肽在水稻中進行真核細胞表達及轉基因植株的抗逆性鑑定步驟1.含目的基因(水稻OsAHL基因)的表達載體的構建根據水稻基因OsAHL的全長序列(SEQIDNO.2)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在上遊和下遊引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將水稻基因OsAHL的cDNA克隆至中間載體(如PBI121)，進一步克隆到雙元表達載體(如pCAMBIA1300)上，在保證閱讀框架正確的前提下再將該雙元表達載體轉入農桿菌中，並轉化模式植物水稻日本晴(來自上海市農業生物基因中心)。步驟2.愈傷誘導將水稻種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70%的乙醇消毒1分鐘，然後用次氯酸鈉(1.5%有效濃度)溶液振蕩消毒20分鐘。最後再用無菌水衝洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸乾接種在誘導愈傷培養基中，25°C暗培養2周。愈傷誘導培養基採用表2的誘導培養基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL2，4-D(濃度lmg/mL)，配成IL溶液，調pH至5.9，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。步驟3.繼代培養把胚性愈傷組織切下，接入繼代培養基中，25°C暗培養2周。繼代培養基採用表2的繼代培養基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL2，4-D(濃度lmg/mL)，配成IL溶液，調pH至5.9，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。步驟4.農桿菌和愈傷組織共培養挑取步驟1的農桿菌陽性轉化子，接種於ImL農桿菌培養液(含抗生素)中，28°C培養過夜；取以上培養物，加入50mL農桿菌培養液(含抗生素)中，28°C培養至0D_=0.6-1.0。將獲得的農桿菌菌液離心，將收集到的菌體加入懸浮培養液中，震蕩培養30分鐘至OD6tltl=0.6-1.0。然後將愈傷組織放入含有農桿菌菌液的懸浮培養液中，振蕩培養20分鐘左右。將愈傷組織在滅菌濾紙上晾乾，轉入共培養培養基中，25°C暗培養5天。懸浮培養液採用表2的懸浮培養液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL2，4-D(濃度lmg/mL)，配成100ml溶液，調pH至5.4，分成兩瓶(每瓶50mL)，高溫高壓滅菌。使用之前加入ImL50%的葡萄糖和100μLAS(IOOmM)。共培養培養基採用表2的共培養培養基，加入0.Sg水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.OmL2，4-D(濃度lmg/mL)，配成IL溶液，調pH至5.6，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。使用之前加入20mL50%的葡萄糖和ImLAS(IOOmM)。步驟5.篩選培養共培養3天後，將愈傷組織轉入篩選培養基中，25°C暗培養2周，篩選兩次。篩選培養基採用表3的篩選培養基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL2，4-D(濃度lmg/mL)，配成IL溶液，調pH至6.0，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。使用之前加入ImLHn和ImLCn(IOOppm)。步驟6.分化培養挑取胚性愈傷組織接入分化培養基，24V，16h/8h光暗培養誘導分化芽(4_6周)。分化培養基採用表3的分化培養基，加入2.Omg/L6_BA、2.Omg/LKT,0.2mg/LΝΑΑ、0·2mg/LΙΑΑ、1.Og水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成IL溶液，調pH至6.0，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。步驟7.生根培養待芽長至2cm左右時，將幼芽切下，插入生根培養基中，25°C左右，16h/8h光暗培養，誘導生根。生根培養基採用表3的生根培養基，加入30g蔗糖，配成IL溶液，調pH至5.8，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。步驟8.轉化植株培養待根系發達後，打開試管口，加入無菌水煉苗2-3天後，將植株取出，用無菌水洗淨附著的固體培養基，移入土壤中，剛開始遮蔭避風，待植株健壯後進行常規田間或溫室管理培養。表2培養基成分成分N6(mg/L)誘導、繼代培養基(mg/L)懸浮、共培養培養基(mg/L)大量元素KNO3283028301415KH2PO4400400200(NH4)2SO4463463231.5MgS04-7H2018518562.5CaCl2_2H2016616683微量元素ZnSO4VH2O1.51.50.75MnS04'4H204.44.42.2H3BO31.61.60.8KI0.80.80.4Fe2+-EDTA(鐵鹽)FeS04.7H2027.827.827.8Na2EDTA-2H2037.337.337.3Vitamin(有機成分)Glycine222ThiamineHCL(VBl)111PyridoxineHCL(VB6)111Nicotinicacid111Inositol100100100表3培養基成分tableseeoriginaldocumentpage13實施例5含水稻基因OsAHL的轉基因水稻植株的抗逆性鑑定鑑於水稻基因OsAHL位於抗旱QTL區段內，經過對IRAT109苗期乾旱脅迫及成株期乾旱脅迫下的基因進行了定量PCR分析，結果表明該基因在水分脅迫(乾旱、低溫及高鹽)條件下表達時明顯增加。因此對含水稻OsAHL基因的轉基因水稻(中花11)苗期和成株期水分脅迫實驗，分析水稻基因OsAHL的抗逆(包括但不限於抗旱、抗鹽、耐低溫等)作用。1苗期抗逆性實驗轉OsAHL基因水稻(中花11)苗期實驗主要包括鹽脅迫(150mM、200mMNaCl)，低溫脅迫(4-10°C)，20%的PEG脅迫和土壤乾旱脅迫等。實驗結果表明，與野生型水稻(中花11)相比，轉OsAHL基因水稻(中花11)抗性顯著提高。在150mMNaCl以及低溫分別處理7天，轉基因株系生存狀況優於對照株系，並且在恢復正常培養條件後，其恢復生長的速度明顯高於對照株系。在200mMNaCl以及20%的PEG分別處理12天後，恢復正常培養條件，最終轉基因株系植株的存活率明顯高於對照株系。苗期的土壤乾旱脅迫條件下，轉基因株系的株高和生長量均高於對照株系；葉片死亡、捲曲程度比對照株系較輕。所以，苗期實驗表明，轉OsAHL基因水稻(中花11)在包括乾旱、低溫、高鹽等在內的水分脅迫條件下，生長、生存狀況明顯優於對照水稻(野生型中花11)，表明了OsAHL基因能夠明顯提高水稻對水分脅迫耐受性。圖5為轉OsAHL基因水稻苗期抗逆實驗結果。轉基因水稻與對照植株四葉期時開始處理，其中(A)200mMNaCl；(B)20%PEG，分別處理12天，然後恢復正常培養條件7天後統計存活率；(C)低溫脅迫(4-10°C)7天，恢復7後統計的植株高度。*表示與同樣處理條件下野生型植株相比，t檢驗ρ值小於0.05；**表示與同樣處理條件下野生型植株相比，t檢驗ρ值小於0.01。2成株期抗旱性實驗成株期水分脅迫實驗，採用土壤自然乾旱法。水稻在PVC(Polyvinylchloridepolymer)管中栽培生長。PVC管直徑20cm，高100cm，底部封閉，兩側對稱分布兩排各3個排水孔，孔徑1cm。水稻生長前期用橡皮塞封閉各個孔，乾旱脅迫開始時，根據實驗的需要從上至下依次拔掉各層的孔塞，最終保持75cm的土壤水位。每個PVC在裝土前緊貼管內壁放入一條相同口徑的聚乙烯塑膠袋，以便於考種時整體取出管內土壤調查根系性狀。實驗用土是河沙(洗淨曬乾)與風乾細篩後的水稻田耕作層土壤按照13質量配比的混合壤土，並添加氮磷鉀重量比為111的複合肥，充分攪拌混勻。每個PVC管裝土38Kg(含複合肥25g)。播種前多次加水直至管內土壤飽和，每管種植一棵健壯苗並追施Ig尿素，隨時天澆水保證有水層覆蓋。實驗材料種植方式野生型和轉OsAHL基因超表達株系(5個不同轉化子株系)，每株系各種兩組，每組5株，共10株。對其中的一組斷水進行乾旱脅迫處理，在植株進入幼穗分化期左右時形成水分脅迫；另外一組的材料作為對照按照正常栽培條件進行水分管理。脅迫處理在脅迫的前將PVC管先灌滿水，使土壤水分充分飽和，開始脅迫時打開排水孔並捅破裡面的塑膠袋以便排去水分，到野生型中花11出現明顯脅迫症狀時復水，直至收穫。實驗中對植株進行以下性狀的考察抽穗期、株高、分櫱數、有效穗數、生物學產量、單株產量、百粒重、每穗穎花數、每穗實粒數、結實率以及根長、根重和根體積等。試驗結果表明，在正常水分條件和乾旱脅迫下，轉OsAHL基因水稻(中花11)根系狀況均優於對照水稻(野生型中花11)。在正常水分條件和乾旱條件下生長的轉OsAHL基因水稻，其表現在根系更長，根體積更大，深層根系發達，根系活力更強，這說明OsAHL基因能夠增強水稻的避旱性。與對照水稻相比，在乾旱條件下轉OsAHL基因水稻(中花11)能夠更好的保持細胞水分，結實率、百粒重、單株產量和生物學產量均明顯提高，證明基因OsAHL能夠明顯提高水稻抗旱、耐旱能力。在恢復灌溉後，轉OsAHL基因水稻與野生型中花11相比，葉片恢復到正常狀況的比例更高、速度更快，而且能夠迅速生長出更多高位分櫱，表明基因OsAHL促進水稻在水分脅迫傷害之後恢復生長，能提高植物的復原抗旱性。成株期抗旱試驗證明，水稻基因OsAHL能夠提高植物的避旱、抗旱、耐旱和復原抗旱性。圖6為乾旱條件下OsAHL過量表達引起水稻的葉綠素含量變化，其中(A至C)代表葉綠素a、b和總葉綠素相對含量；⑶代表葉綠素a/b比率變化。誤差線表示3次重複的標準誤；*表示與同樣處理條件下野生型植株相比，t檢驗ρ值小於0.05；#表示與對照條件下同株系材料相比，乾旱處理後數值變化經t檢驗ρ值小於0.05。圖7為轉OsAHL基因超表達水稻成株期乾旱脅迫後表現，其中㈧為正常水分管理條件下野生型與轉基因株系；(B)為成株期乾旱脅迫條件下，野生型與轉基因株系；(C)為成株期乾旱脅迫條件下，野生型與轉基因株系分櫱情況；(D)為野生型與轉基因株系根系在正常水分和乾旱條件下直觀表現。圖8表示轉OsAHL基因超表達植株成株期抗旱性提高，其中(A)為乾旱脅迫後轉基因植株結實率；(B)單株產量；(C)生物學產量(地上部分乾重)；(D)百粒重。誤差線表示4次(正常水分條件下)或者8次(乾旱條件下)數據重複標準誤。*表示與野生型植株相比，t檢驗ρ值小於0.05；**表示t檢驗ρ值小於0.01。(E)乾旱脅迫後轉基因水稻葉片相對含水量顯著高於野生型對照。誤差線表示3次重複標準誤，*表示與野生型植株相比，t檢驗ρ值小於0.05。(F)與野生型對照相比，轉基因水稻離體葉片水分散失速度較慢。平均值士標準差(η=3)。實施例6應用基因晶片檢測轉OsAHL基因水稻(中花11)中基因表達譜變化1.幼苗培育轉OsAHL基因水稻(中花11)與對照水稻(野生型中花11)，置於35°C萌發48小時，然後播種於塑料桶土壤中，置於溫室中，待水稻葉片為5-6片時，提取RNA。2.RNA的提取按照實施例1中的方法提取RNA。3.晶片分析轉OsAHL基因水稻(中花11)與對照水稻(野生型中花11)材料分別取3個單株，共6份材料，提取RNA進行晶片雜交。選取水稻全基因組表達晶片AfTymetrixOryzasativa(Rice)57KGeneChip(Affymetrix，US)，由博奧生物有限公司(中國，北京)進行晶片雜交和信號掃描實驗。然後根據實驗數據，分析、比較轉OsAHL基因水稻(中花11)與對照水稻(野生型中花11)之間基因轉錄普的差異。4.分析結果轉OsAHL基因水稻(中花11)與對照水稻(野生型中花11)之間在基因組上的差異主要是外源OsAHL基因的存在與否，所以其在轉錄譜上的差異是由OsAHL的超表達引起的。實驗發現，由於OsAHL基因的過量表達，引起了包括0sGLK2等在內的調節葉綠體發育相關基因的上調表達。通過PATHWAY分析發現，轉OsAHL基因水稻(中花11)與對照水稻(野生型中花11)相比，相關基因變化最明顯的是光合作用(P=0.0000042)和光合系統II(P=0.0002)代謝途徑，均達到極顯著差異表達水平。表4—基因注釋0s05g0202500AK068507LOC—OsO1g04020AP2domaincontainingproteinLOC_OsOIgl3740OsGLK2LOC—OsOlg41800CytochromeP45072A1L0c_0s01g41820CytochromeP450familyproteinLOC—OsOlg43760CytochromeP450familyproteinL0c_0s01g58010ATPsynthaseachainL0c_0s01g58040PhotosystemIID2proteinL0c_0s01g64660Fructose-1,6-bisphosphatase,cytosolicL0c_0s01g65902AK288924L0c_0s02g24630PhotosystemIID2proteinL0c_0s02g43370transposonproteinL0c_0s03g21000Thioredoxin-Iike1L0c_0s04g02910membranerelatedproteinCP5,putativeLOC—0s04g10940L0c_0s04g25440UDP-glucoronosylandUDP-glucosyltransferasefamilyproteinL0c_0s04g25490UDP-glucoronosylandUDP-glucosyltransferasefamilyproteinL0c_0s04g49570Glutamatereceptor3.3precursorL0c_0s05g11260expressedproteinL0c_0s06g50300EndoplasminhomologprecursoL0c_0s07g325705'-adenylylsulfatereductase2，chloroplastprecursorL0c_0s07g46852sexdeterminationproteintasselseed-2L0c_0s08g30020LOC_Os8g31200UDP-glucoronosylandUDP-glucosyltransferasefamilyproteinL0c_0s09g04440DNA-bindingproteinL0c_0s09g38090LOCOs11g47140ProteinkinasedomaincontainingproteinL0c_0sl2g30460LOC_Os12g38180Heatshockcognate70kDaprotein2_表4為轉OsAHL基因水稻(中花11)與對照水稻(野生型中花11)相比，表達量明顯上升的部分基因，其中包括轉錄調節因子和葉綠體發育相關基因。通過以上實驗可以證明OsAHL基因能夠調節其它一些逆境相關轉錄因子，直接或間接調節控制葉綠體發育以及光合作用相關功能蛋白和酶系統的表達。實施例7酵母雙雜交實驗驗證OsAHL蛋白能夠形成同源聚合物酵母菌株為YRG-2(ΜΑΤα，ura3_52，his3_200，ade2_101，lys2_801，trpl-901，leu2-3112,gal4_542，gal80_538，LYS2::UASGAL1-TATAgal1_HIS3，URA3::UASgal417mers(x3)-TATACYC1_lacZ),購自Stratagene公司(Stratagene,LaJolla,CA)。具體實驗操作為構建含完整OsAHL蛋白或OsAHL蛋白部分功能區域導入到pBD-GAL-AAHL以及pAD_GAL_2.I-AAHL的酵母雙雜交載體，將其分別組合(圖9)、轉化導入酵母菌株YRG-2，陽性轉化子SC-Leu-Trp培養基上生長3-5天誘導出孢，誘導後在SC-Leu-Trp-His(含30mM3-AT)培養基上檢測其互作效果。實驗結果如圖10所示，表明OsAHL蛋白及其DUF296結構域具有同源結合能力。通過以上實驗可以證明OsAHL基因能夠調節其它一些逆境相關轉錄因子，直接或間接調節控制葉綠體發育以及光合作用相關功能蛋白和酶系統的表達。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。權利要求水稻OsAHL蛋白，其特徵在於，其具有如SEQIDNo.1所示的胺基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列。2.編碼權利要求1所述的水稻OsAHL蛋白的基因。3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於，其編碼的核苷酸序列與SEQIDNo.2所示的從69-1169位的核苷酸序列具有至少70%的同源性。4.如權利要求3所述的基因，其特徵在於，其具有如SEQIDNo.2所示的從69-1169位的核苷酸序列。5.一種核酸探針分子，其特徵在於，其含有權利要求2-4任一項所述水稻OsAHL基因編碼序列的8-100個連續核苷酸。6.含有權利要求2-4任一項所述基因的載體。7.含有權利要求6所述載體的宿主。8.含有權利要求2-4任一項所述基因的轉化植物細胞。9.權利要求2-4任一項所述的基因在提高植物抗逆性中的應用。10.權利要求2-4任一項所述的基因在調節植物葉綠體發育相關基因表達，增強光合系統活性和穩定性中的應用。全文摘要本發明提供了一種與水稻抗逆性(包括但不限於抗旱、耐低溫、耐高鹽脅迫)、葉綠體發育相關的OsAHL蛋白以及編碼具有水稻OsAHL蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.2中第69-1169位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQIDNO.2中第69-1169位的核苷酸序列雜交。本發明提供的水稻OsAHL基因具有調節葉綠體發育，增強光合系統活性和穩定性的功能；在植物抗逆性(包括但不限於抗旱、耐低溫、耐高鹽脅迫)方面具有明顯的作用，具有很大的應用價值，能夠明顯減少農作物在乾旱、半乾旱或者高鹽、低溫等條件下產量和生物產量的損失。文檔編號C12N15/63GK101830973SQ20101019082公開日2010年9月15日申請日期2010年6月2日優先權日2010年6月2日發明者劉灶長,劉運華,周立國,孔德豔,秦建英,羅利軍申請人:上海市農業生物基因中心