用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等有效成分的製作方法

2023-06-09 06:00:01 1

專利名稱：用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等有效成分的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物有效成分的提取方法，具體涉及一種從喜樹 果中提取白樺脂酸、羥基喜樹鹼和喜樹鹼的方法。
技術背景白樺脂酸是一種三萜類化合物，具有抗腫瘤細胞增長的作用，並 且在抗愛滋病方面還有許多新的作用機制，這使白樺脂酸成為很有開發前景的藥物，引起了人們的廣泛關注。Franoise等發現一些新的樺木酸的x-氨基鏈垸酸衍生物具有抗愛滋病的作用，它可以抑制在CEM4和MT-4細胞中的HIV-1發生細胞病變，並且不會影響到HIV-1 逆轉錄酶或蛋白酶的活性，這是目前所發現的其他抗愛滋病藥物不具 備的藥理活性，因此具有重要意義。目前白樺脂酸的製備方法主要有三個途徑1、直接提取法。其 中Carcache Blanco Ziziphusspina等是目前此途徑的主要的代表， 主要是從其他植物的樹葉樹枝中提取，原料消耗量大，成本高，所得到 的白樺脂酸雜質含量會比較高，且不易除去。2、 一步合成法。 一步 合成法是將樺木醇的提取和樺木酸的製備同步進行，它通過將植物浸 軟而使提取和轉化在一步內完成，可以用氯仿、二氯甲烷、二乙基醚、 四氫呋喃、丙酮、吡啶和DMF等有機溶劑來提取樺木醇，同時將硝酸 鐵、硝酸銅、硝酸鉻、硝酸鋅等氧化劑附著在矽膠、氧化鋁、膠嶺石 K-IO等固體載體上對提取物進行氧化，最後得到白樺脂酸。此法所製得的混合物產品雜質的種類和含量很多，給分離純化帶來困難，從而 導致產率下降。3、半合成法。這種方法是從植物中提取出樺木醇， 然後由樺木醇經過一系列化學反應製得樺木酸。由於樺木醇在植物中 的含量比樺木酸高，並且經過化學合成的方法製得的樺木酸產率較高， 分離提純也比較容易，所以這種方法得到廣泛的應用。但這種方法反 應路線較長，反應條件苛刻，有異構體的產生，但路線較長，不適於大 規模生產。喜樹(Camptotheca acuminate Decaisne， 簡禾爾CPT)， 珙桐禾鬥 (Nyssaceae)喜樹屬(Camptotheca)多年生植物，落葉大喬木。1966 年美國的Monroe E. wall從喜樹的皮中分離出喜樹鹼，經腫瘤試驗證 明這種色氨酸一萜烯類生物鹼具有抗癌活性，從而引起人們的廣泛關 注。喜樹果中已經發現有20多種有特殊藥效的化合物，其中就包括 有白樺脂酸。綜上所述，目前提取白樺脂酸及喜樹鹼的方法中所使用的試劑大 多數都是毒性較大的藥品，如氯仿，石油醚，甲醇等，其過程繁瑣， 設備要求高，生產成本高。而從喜樹果中採用清潔的方法提取白樺脂 酸的技術未見報導，尤其是能同時分離提取喜樹鹼，羥基喜樹鹼等有 效成分的方法，如果能實現這種方法，對於白樺脂酸、喜樹鹼和羥基 喜樹鹼的研究有著重要的意義，對於充分利用我國喜樹資源也有著重 要意義。 發明內容本發明的目的是提供一種用清潔方法從喜樹果中提取有效成分白樺脂酸、並且能同時分離得到喜樹鹼、羥基喜樹鹼等有效成分的方 法。本發明的技術方案是提供一種用清潔方法從喜樹果中提取白樺 脂酸等有效成分的方法，以喜樹果為原料，利用聚醯胺柱層析和乙醇 洗脫的方法提取白樺脂酸、喜樹鹼和羥基喜樹鹼。所述方法包括以下步驟(1) 喜樹果粉碎、用工業乙醇浸泡、過濾得到的澄清浸出液；(2) 濃縮澄清浸出液，避光低溫保存；(3) 聚醯胺柱吸附；(4) 滴入解吸液解吸，分段收集過柱液，重結晶。步驟(1)所述的用工業乙醇浸泡是用工業乙醇浸泡過面，浸泡 5天。步驟(2)所述濃縮採用旋轉蒸發器對浸出液進行濃縮。步驟(3)所述聚醯胺柱吸附是取大約5ml濃縮液上聚醯胺柱， 緩慢加入使其充分滲透進入聚醯胺柱中，液面與聚醯胺齊平。所述聚醯胺柱採用溼法裝柱，是取250ml的聚醯胺置於500ml的 大燒杯中，加入95。/。的優質工業乙醇至300ml，在電熱套中煮沸半小 時後取出，離心除去剩餘的乙醇，再次加入95%的優質工業乙醇至 300ml再煮沸半小時，離心除去剩餘乙醇裝入層析柱。步驟(4)所述滴入解吸液是逐滴加入解吸液，濃縮液被聚醯胺 充分吸收後，增大加入量，最後解吸液的用量約為3倍床體積。所述解吸液是60%的乙醇水溶液。步驟(4)所述分段收集過柱液是採用三角瓶分5段依次收集並 編號，每瓶收集約50mL。 本發明的有益效果是(1) 利用聚醯胺柱層析、乙醇洗脫的方法從喜樹果中提取白樺 脂酸，這是一種簡單、易行、環保、有效的提取白樺脂酸的方法，是 目前有效提取白樺脂酸的最簡單的方法，另外本方法還能同時分離提 取喜樹鹼，羥基喜樹鹼等有效成分，具有很好的社會效益和價值。(2) 本方法中所使用的試劑不使用毒性較大的藥品，所需設備 簡單，用乙醇洗脫使整個提取分離過程環保，全過程只需要用60°/0乙 醇，解吸劑用量少，即3BV可以洗脫出所有物質，物質分段明顯，簡 單易行，乙醇可循環使用，從而大大降低了成本而且適用於較大規模 的製備，具有較高的實用價值。(3) 本方法分離效果好，而且對其他有效成分的分離作用也很 明顯，改變解吸劑，展開劑等條件的研究對此方法的後續研究工作和 充分利用我國喜樹資源也有著重要意義。


圖l本發明工藝流程示意2 14 28號部分試樣的聚醯胺薄板在UV-1型三用紫外分析儀 下觀察的照片圖3 29-46號部分試樣的聚醯胺薄板在UV-1型三用紫外分析儀 下觀察的照片圖4 47-67號部分試樣的聚醯胺薄板在UV-1型三用紫外分析儀下觀察的照片圖5 68-91號部分試樣的聚醯胺薄板在UV-1型三用紫外分析儀 下觀察的照片圖6 65-91組物質的試樣的LC-ESI-MS7 65-91組物質的試樣的LC-ESI-MS圖具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步詳細說明本發明。按照本方法的步驟(1) 喜樹果粉碎、用工業乙醇浸泡、過濾得到的澄清浸出液；(2) 濃縮澄清浸出液，避光低溫保存；(3) 聚醯胺柱吸附；(4) 滴入解吸液解吸，分段收集過柱液，重結晶。 得到產物後進行實驗檢測。具體操作如圖l所示的工藝流程圖。實施例11、 材料喜樹的幹種子，實驗所用的聚醯胺由南開大學化工廠和台州市路 橋四甲生化塑料廠提供，分析純和高效液相色譜純的乙醇、甲醇和磷 酸，分析純三乙胺。2、 實驗儀器SHZ-D (III)循環水式真空泵、旋轉蒸發器RE-52AA、 UV-1型 三用紫外分析儀、LQC 'DECAXP液相色譜一質譜連用儀，帶電噴 霧離子源；大氣壓化學電離源，質量範圍50 2000n， ThermoFinnign公司(美國)、北京分析儀器廠SY-5000高效液相色譜儀，C18柱。3、 方法(1) 稱取500g喜樹果粉碎並用工業乙醇浸泡過面，浸泡五天， 過濾後得澄清浸出液。聚醯胺的預處理取250ml的聚醯胺置於500ml的大燒杯中， 加入95%的優質工業乙醇至300ml，在電熱套中煮沸半小時後取出，* ,1、、1^土恭ilA6^ 7跪 古、/A^+n "X 。C0/一的/4^法T、11/7鵬《Qnn"1市去、她半小時，即可離心除去剩餘乙醇裝入層析柱，採用溼法裝柱。(2) 對粉碎的喜果浸泡得出的清液濃縮，用旋轉蒸發器對其進 行濃縮，濃縮至150到200mL左右，避光低溫保存。(3) 取大約5ml濃縮液上聚醯胺柱，緩慢加入使其充分滲透進 入聚醯胺柱中，液面與聚醯胺齊平。(4) 濃縮液被聚醯胺充分吸收後，用60%的乙醇解吸，剛開始 解吸液逐滴加入，濃縮液被充分吸收後可以增大加入量，最後解吸液 的用量大約為3倍床體積，用三角瓶分5段收集並編號，每瓶收集約 50mL，經檢測後挑選分段物重結晶得到產物。分離方法分段收集解吸液洗脫出的組分，經薄板初步檢測進行分類後再通 過HPLC 、 LC-ESI-MS檢測、選擇性離子流色譜(SIM)檢測進行進一步的測定，證實此洗脫方法能較好分離喜樹果中有效成分。4、 檢測方法收集的過柱液用旋轉蒸發器濃縮至溶液約lmL左右，進行以下檢①聚醯胺薄膜層析檢測展開劑為乙醇水的體積比=3: 2的乙醇，即60%乙醇 用玻璃毛細管吸取少量從聚醯胺柱中洗出的濃縮液點板，點板時 注意要等第一滴幹了後再點第二滴， 一塊板點三個樣，用乙醇水體 積比二3: 2的展開劑進行展開層析，展層完畢取出聚醯胺薄膜，於陰涼通風處自然乾燥，待展開劑完全揮發後，在波長為254nm紫外燈下 觀察，根據螢光點不同高度進行初步的分類。表l各分段收集液螢光標記瓶編號14-2829-4445-4748-6465-91☆(黃綠螢光)□(紫藍螢光)◎(亮黃色熒 光)VVA(藍紫螢光)VVV〇(紫白螢光)V其中 (亮黃色螢光)在聚醯胺薄板上顯示是較其他螢光點遲出現，並且不在UV-1型三用紫外分析儀下觀察也能在聚醯胺薄板上觀察到黃斑，各個螢光點能較好地分開。UV-1型三用紫外分析儀下觀察的照片組見圖2 圖5。圖2中部 分式樣即表1中"□"標記的物質；圖3中部分試樣即表1中"□" "◎" "△"標記的物質；圖4中部分試樣即表1中"△""〇"標 記的物質；圖5中部分試樣即表1中"〇"標記的物質。在擬定色 譜條件和聚醯胺薄板層析檢測下，用45 47組試樣與喜樹鹼標準品 對照，確定為喜樹鹼，分離效果好，純度高。聚醯胺薄板層析檢測下判定65 91組樣品(即"〇")結晶含有少量羥基喜樹鹼。② HPLC色譜條件色譜柱為Zorbax (]18柱(4. 6mmX 150mm)，流 動相為{ V甲醇:V磷酸隱5m。^55:45 (混合後用三乙胺調pH3. 0 3.2) }:甲醇=9:1，檢測波長360nm，流速O. 8mL/min，柱溫25。C③ LC-ESI-MS檢測離子化源(士)ESI;加熱毛細管溫度300°C;鞘氣(N2)流速30流量單位(arbitrary units);輔助氣(N2)流速30流量單位 (arbitrary units);噴霧電壓4 kV。同時採用一級全掃描質譜及 MS/MS兩種方式檢測，掃描範圍150 550， MS / MS的相對碰撞能為30/b 。通過LC-ESI-MS法對65-91組樣品檢測，結果見圖6 圖7，該 組樣品中主要含量是分子量分別為455.6， 456.9的物質，純度高， 物質通過與文獻分子量的對比，認定是白樺脂酸。同時，用LC一ESI-MS以選擇性離子掃描方式(SIM)對65-91 組樣品結晶(即"〇")中羥基喜樹鹼進行測定，確定含有羥基喜樹 鹼。
權利要求
1、一種用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等有效成分的方法，其特徵在於以喜樹果為原料，利用聚醯胺柱層析和乙醇洗脫的方法提取白樺脂酸、羥基喜樹鹼和喜樹鹼。
2、 根據權利要求1所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等有效成分的方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 喜樹果粉碎、'用工業乙醇浸泡、過濾得到澄清浸出液；(2) 濃縮澄清浸出液，避光低溫保存；(3) 聚醯胺柱吸附；(4) 滴入解吸液解吸，分段收集過柱液，重結晶。
3、 根據權利要求2所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等有效成分的方法，其特徵在於步驟(1)所述的用工業乙醇浸泡是用工業乙醇浸泡過面，浸泡5天。
4、 根據權利要求2所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等 有效成分的方法，其特徵在於步驟(2)所述濃縮採用旋轉蒸發器對 浸出液進行濃縮。
5、 根據權利要求2所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等 有效成分的方法，其特徵在於步驟(3)所述聚醯胺柱吸附是取大約 5ml濃縮液上聚醯胺柱，緩慢加入使其充分滲透進入聚醯胺柱中，液 面與聚醯胺齊平。
6、 根據權利要求2或5所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂 酸等有效成分的方法，其特徵在於所述聚醯胺柱採用溼法裝柱，是取 250ml的聚醯胺置於500ml的大燒杯中，加入95%的優質工業乙醇至 300ml，在電熱套中煮沸半小時後取出，離心除去剩餘的乙醇，再次 加入95%的優質工業乙醇至300ml再煮沸半小時，離心除去剩餘乙醇裝入層析柱。
7、 根據權利要求2所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等 有效成分的方法，其特徵在於步驟(4)所述滴入解吸液是逐滴加入 解吸液，濃縮液被聚醯胺充分吸收後，增大加入量，解吸液的最後用 量約為3倍床體積。
8、 根據權利要求2或7所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂 酸等有效成分的方法，其特徵在於所述解吸液是60%的乙醇水溶液。
9、 根據權利要求2所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸等 有效成分的方法，其特徵在於步驟(4)所述分段收集過柱液是採用 三角瓶分段依次收集並編號，每瓶收集約50mL。
10、 根據權利要求2或9所述用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂 酸等有效成分的方法，其特徵在於步驟(4)所述分段收集是分5段。
全文摘要
本發明公開了一種用清潔方法從喜樹果中提取白樺脂酸、羥基喜樹鹼和喜樹鹼的方法，以喜樹果為原料，利用聚醯胺柱層析和乙醇洗脫的方法提取有效成分，所需設備簡單，用乙醇洗脫使整個提取分離過程環保，全過程只需要用60％乙醇，解吸劑用量少，物質分段明顯，簡單易行，乙醇可循環使用，從而大大降低了成本而且適用於較大規模的製備，具有較高的實用價值，具有很好的社會效益和價值，對於充分利用我國喜樹資源有著重要意義。
文檔編號C07D491/22GK101220036SQ200710031330
公開日2008年7月16日 申請日期2007年11月9日 優先權日2007年11月9日
發明者何潔萍, 劉展眉, 鍾雪蓮 申請人:仲愷農業技術學院