癌轉移檢測方法及其設備的製作方法

2023-06-09 05:55:41

專利名稱：癌轉移檢測方法及其設備的製作方法
技術領域：
本發明涉及癌轉移的檢測方法及設備。
背景技術：
為了檢查特定組織的癌轉移，現在人們紛紛進行使用多重環介導恆溫擴增反應(LAMP法，loop-mediated isothermal amplification method)和聚合酶鏈反應(PCR法，polymerase chain reaction)等檢查癌分子的研究。分子檢查可以通過檢測組織和細胞等所含癌標誌物(比如在癌細胞特異表達的蛋白質的mRNA等)進行。比如，作為判斷乳腺癌的淋巴結轉移的癌標誌物(以下也簡稱為標誌)，眾所周知，角蛋白19(CK19)和癌胚抗原(CEA)的mRNA是有用的。正常淋巴結上的癌標誌物的表達量和轉移到淋巴結的乳腺癌細胞上的癌標誌物的表達量不同而有意義。
用於判斷癌轉移的標本可以通過生檢等方法採集，根據標本不同，所含細胞數也不同。用分子檢查法判斷癌轉移時，使用含大小不均的組織的標本或含不同細胞數量的標本，檢出該標本中的癌標誌物。
過去癌轉移的判斷是採取以下方法測定標本中的癌標誌物的量；對測定出的癌標誌物的量進行標準化處理；將標準化的癌標誌物的量與所定閾值進行比較；然後，用此比較結果判斷癌轉移。
標準化比如可用管家基因的表達量除以標本中的癌標誌物的量來進行(如Inokuchi et al.，British Journal of Cancer(2003)89，1750-1756)，一般認為管家基因不受細胞種類限制，任何種類的細胞其表達量幾乎一定。以此可以算出相對於管家基因的1個表達產物分子，癌標誌物表達多少。因此，不論標本中所含細胞數有多少，都可以將標準化的癌標誌物的值與特定閾值和其他標本的標準化癌標誌物的值作比較。

發明內容
過去的檢測方法是以標本中所含細胞均一(作為分析對象的標本其所含所有細胞實際上為同一種細胞)為前提的。比如試樣中的細胞幾乎均為癌細胞時，可視為屬均一。
但是，實際上從生物採集的標本往往不僅含癌細胞，還含正常細胞。因此，本發明者選擇了有時進行癌標誌物表達量的標準化不能正確判斷癌轉移的課題，並開發了解決此課題、能將錯誤判斷控制在最小的方法和裝置，完成了本發明。
本發明提供含以下步驟的癌轉移檢測方法測定採自生物的組織或細胞中的癌標誌物的絕對量的測定步驟；以及通過對比所述測定出的絕對量和預設閾值，判斷癌是否向所述組織或所述細胞所屬組織轉移的判斷步驟。
本發明還提供一種癌轉移的檢測方法，其包括如下步驟測定反映採自生物的組織或細胞中的癌標誌物絕對量的信息的測定步驟；以及通過將測定出的反映所述絕對量的信息與預設閾值進行比較，而無需用所述癌標誌物以外分子的絕對量進行標準化處理，判斷癌是否向所述組織或所述細胞所屬組織轉移的判斷步驟。
其中所述組織為淋巴結組織。
其中所述癌標誌物用測定用試樣進行測定，該測定用試樣是在所述組織或細胞中添加處理液，讓所述組織或細胞所含癌標誌物移至溶液中製備的，而不進行核酸抽取處理。
其中所述處理液含二甲亞碸。
其中所述的測定採用核酸擴增法。
其中所述癌標誌物為mRNA，特別是指角蛋白mRNA。
其中所述癌選自乳腺癌、胃癌、食道癌、大腸癌和前列腺癌。
本發明同時提供一種癌轉移檢測設備，包括測定採自生物的組織或細胞中的癌標誌物的絕對量的測定系統；以及通過對比所述測定出的絕對量和預設閾值，判斷癌是否向所述組織或所述細胞所屬組織轉移的判斷系統。


圖1為本發明一個實施方式的判斷設備整體結構的斜視圖。
圖2為圖1所示判斷設備的作為測定系統的核酸擴增測定裝置的整體結構斜視圖。
圖3為圖2核酸擴增測定裝置的平面略圖。
圖4為本發明一個實施方式的判斷設備中作為判斷系統計算機的CPU判斷癌轉移的流程圖。
圖5為顯示實施例1算出的乳腺癌淋巴結組織中的CK19mRNA拷貝數的附圖。
圖6為比較例1算出的乳腺癌淋巴結組織中的CK19mRNA標準化值的附圖。
圖7為顯示實施例2測定的大腸癌淋巴結組織中的CK19mRNA拷貝數的附圖。
圖8為顯示實施例3算出的胃癌淋巴結組織中的CK19mRNA拷貝數的附圖。
圖9為顯示實施例4算出的乳腺癌淋巴結組織中的CK19mRNA拷貝數的附圖。
圖10為顯示實施例5算出的大腸癌淋巴結組織中的CK19mRNA拷貝數的附圖。
圖11為顯示實施例6算出的胃癌淋巴結組織中的CK19mRNA拷貝數的附圖。
具體實施例方式在本實施方式的癌轉移判斷中，使用含從生物體採集的組織或細胞的試樣作為標本，比如淋巴結組織、血液、尿液、灌腸所得清洗液及其濃縮液等。
用本實施方式可以檢出所述組織的癌轉移。當使用含細胞的試樣作為標本時，可以判斷該細胞所屬組織的癌轉移。比如，當以灌腸所得清洗液為標本時，因為該清洗液中含有從胃中清洗脫落下來的細胞，故可以檢出癌的胃轉移。
在此，所謂「檢出癌轉移」包括定性地判斷有無癌轉移、半定量地判斷癌轉移程度(如判斷陰性、陽性或強陽性)以及定量地判斷癌轉移程度(如判斷轉移的大小、轉移的癌細胞數)等。本實施方式可以提供這些檢出結果作為有關癌轉移的信息。
本說明書中的「癌標誌物」指在癌細胞的表達量比在正常細胞的表達量多且有意義的分子。在本實施方式中，癌標誌物比如有核酸和蛋白質等，癌標誌物以mRNA、DNA等核酸為宜，最好是mRNA。
作為癌標誌物的種類，比如有CK18、CK19、CK20等角蛋白(CK)mRNA、癌胚抗原(CEA)mRNA、MUC1粘朊mRNA和乳腺球蛋白(MMG)mRNA。所述癌標誌物以角蛋白(CK)mRNA為宜，最好是CK19mRNA。
本實施方式是測定癌標誌物的絕對量。在本說明書中，所謂「癌標誌物的絕對量」意味著僅根據癌標誌物的量計算出的值，不考慮測定中根據其他因素、比如組織或細胞的量計算出的值。即，對此值不用所述管家基因等進行標準化處理。作為癌標誌物的絕對量有癌標誌物的濃度、分子數(拷貝數)等。在本說明書中，癌標誌物的絕對量包含「與癌標誌物絕對量相關的信息」。
所謂「與癌標誌物絕對量相關的信息」指僅根據癌標誌物絕對量而變化的值，可以是針對以下例示的癌標誌物測定方法的各種值。比如，可以是反應液的螢光強度、濁度和吸光度，也可以是這些值達到一定值所需的時間或PCR周期數。
以下，在本說明書中有時稱癌標誌物的絕對量為癌標誌物的「測定值」。另，有時將獲取癌標誌物的絕對量稱為「測定癌標誌物」。
根據本實施方式的方法，最好用經處理液處理所述組織或細胞而製備的測定用試樣測定癌標誌物。該處理液最好含有二甲亞碸(DMSO)。用核酸擴增法測定癌標誌物時，靠DMSO的作用，可以減少試樣中所含阻礙物質對核酸擴增反應的阻礙。經對組織或細胞如此處理，可將細胞或細胞中所含癌標誌物移到溶液中。
含所述DMSO的處理液以DMSO含量佔處理液的5～30％體積為宜，佔10～25％體積更好。
處理液也可添加緩衝劑和表面活性劑等。
處理液的pH以2.5～5.0為宜。為了使pH保持在2.5～5.0，比如可以添加甘氨酸-鹽酸緩衝劑等緩衝液。
所述表面活性劑只要是該領域中通常使用的表面活性劑即可，無特別限定，以非離子型表面活性劑為宜，最好是聚氧乙烯類非離子型表面活性劑。特別是如下通式表示的聚氧乙烯類非離子型表面活性劑更適合。
R1-R2-(CH2CH2O)n-H(在此，R1是碳原子數10～22的烷基、鏈烯基、炔基或異辛基；R2是-O-或-(C6H4)-O-；n為8～120的整數。)作為表面活性劑可舉例如下聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鯨蠟醚、聚氧乙烯油酯醚、聚氧乙烯肉豆蔻醚、聚氧乙烯硬脂醚、聚氧乙烯壬基苯酚醚和聚氧乙烯異辛苯酚醚等。其中尤以BRij35(聚氧乙烯(35)月桂醚)為宜。表面活性劑的濃度是該領域一般使用的即可，無特別限定。以處理液的0.1～6容量％為宜，1～5容量％更好。
所述表面活性劑具有破損細胞膜、溶解組織或細胞的作用。使用含有這種表面活性劑的處理液，可以有效地將存在於細胞膜內的癌標誌物移至溶液中。
通過使用所述處理液，不必進行使用市面上銷售的純化試劑盒等一般要進行的核酸抽取和純化，即可便捷地製備測定用試樣。
所述處理液與組織或細胞的混合比例無特別限定。使用組織時，可以在1MG組織中添加0.0001～0.005ML左右的處理液加以混合。
以處理液和組織或細胞混合後再破碎組織或細胞為宜。破碎的方法比如可以用均化器均化或用超聲波破碎機破碎等。作為均化器，用在該領域常用的即可，比如韋林氏攪切器、Potter-Elvehjem型均化器、Polytron型均化器和杜恩斯均化器等。也可以用杵手動均化。
用所述方法破碎的破碎液可以通過離心分離、過濾、柱層析等通常的提純方法進行初提煉。根據檢出的癌標誌物的種類，也可通過眾所周知的核酸抽取法再提純。
本實施方式可以通過對組織或細胞進行所述處理和提純等，製備測定用試樣。
本實施方式可以按照在該領域常用的方法測定癌標誌物。
如果癌標誌物是蛋白質，則可以用諸如免疫印跡法、放射免疫分析法、酶免疫分析法以及專利公開2003-130871號上記載的方法等傳統的方法測定癌標誌物。
如果癌標誌物是核酸，則最好採用環介導等溫擴增法(LAMP)和聚合酶鏈反應(PCR)等核酸擴增法。若癌標誌物為mRNA則可以使用在核酸擴增反應前含逆轉錄反應的核酸擴增法(如RT-PCR法、RT-LAMP法等)。當癌標誌物為mRNA時，具體而言，在所述測定用試樣中添加引物、RNA依賴型DNA聚合酶(逆轉錄酶)和DNA依賴型DNA聚合酶(以下也稱為DNA聚合酶)等製備反應液，進行核酸擴增。
逆轉錄反應和核酸擴增反應可根據與鑄模標記物相對應的CDNA序列和聚合酶序列適當改變條件。關於逆轉錄反應和核酸擴增反應的條件，比如Sambrook，J.et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual (2nded.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York上有記載。
作為檢測癌標誌物的引物，只要是可以擴增與癌標誌物相應的CDNA的多核甙酸即可，其序列無特別限定。引物的長度可以是5～100核甙酸，5～50核甙酸更好。引物可以用在該技術中周知的核酸合成方法製造。
逆轉錄酶和DNA聚合酶可以使用在該技術領域周知的物質。作為逆轉錄酶比如可以使用禽成髓細胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus)由來的逆轉錄酶和莫洛尼鼠類白血病病毒(Molony Murine Leukemia Virus)由來的逆轉錄酶等。作為DNA聚合酶可以使用Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等。
通過測定所述核酸擴增生成的核酸擴增產物，可以取得關於癌標誌物絕對量的信息。從而得以測定癌標誌物。當癌標誌物為mRNA時，最好採用Quantitative Reverse Transcription-PCR(QRT-PCR)和Quantitative ReverseTranscription-LAMP(QRT-LAMP)等。採用這些方法，隨著由mRNA逆轉錄的cDNA的擴增，反應液的光學狀態(濁度、吸光度、螢光強度等)會發生變化。因此，反應液的光學狀態作為關於癌標誌物絕對量的信息被實時測定，用於癌轉移的判斷。
作為QRT-PCR的具體例子可以使用眾所周知的方法，比如嵌合螢光法(SYBR Green法預先在核酸擴增反應前的反應液中添加SYBRGreen，實時測定擴增反應中隨著cDNA的擴增而增強的螢光強度的方法)和Taqman(羅氏診斷產品公司Roche Diagnostics註冊商標)探針法。
癌標誌物的測定值可以根據反應液的螢光強度達到一定值時所需要的循環數計算出來。試樣中的癌標誌物越多，反應液的螢光強度達到一定值所需循環數越少。試樣中的癌標誌物越多，反應液的螢光強度達到一定值所需循環數越多。
根據反應液的螢光強度達到一定值所需時間，計算出試樣中的癌標誌物拷貝數，並將其與該癌標誌物拷貝數相對應的閾值進行比較，根據比較結果診斷癌轉移。
也可以不計算拷貝數，通過比較反應液螢光強度達到一定值所需時間和與之對應的閾值，診斷癌轉移。
如果使用QRT-LAMP，則隨著cDNA的擴增，作為副產品生成大量焦磷酸鎂。此焦磷酸鎂為非溶性，反應液會隨焦磷酸鎂的增加而變濁。因此，通過實時對反應液的濁度(或吸光度)進行光學測定即可測定癌標誌物。另外，在QRT-LAMP中也可使用所述SYBR Green。
癌標誌物的測定值可以根據反應液的濁度、吸光度、螢光強度等達到一定值所需時間(檢測時間)計算出來。試樣中的癌標誌物越多，檢測時間越短。試樣中的癌標誌物越少，檢測時間越長。
可以根據檢測時間算出試樣中的癌標誌物拷貝數，將其與閾值比較，根據比較結果即可判斷癌轉移。
也可以不計算拷貝數，通過比較檢測時間和與之對應的閾值，診斷癌轉移。
過去的癌轉移分子檢查是根據將癌標誌物測定值標準化後所得的值判斷癌轉移的。
在分子檢查中，如果標本中實際上只含癌細胞，則假設管家基因任何細胞都表達一定量，此時進行標準化也能正確判斷癌轉移。然而，如果標本中包含正常細胞，則進行標準化後含有正常細胞越多的標本，管家基因的表達量越大，因此癌轉移的可能性會被忽視。
比如，比較含有大量正常細胞的標本A(癌標誌物絕對量為1，管家基因的表達量為1000)和正常細胞比標本A含量少的標本B(癌標誌物絕對量為1，管家基因的表達量為10)時，進行標準化，則算出標本A的癌標誌物為1/1000，標本B的癌標誌物為1/10。儘管標本A和標本B所含癌標誌物等量，進行標準化後正常細胞多的標本A判斷為癌轉移可能性低。但是，如本實施方式這樣不進行標準化做出判斷，則因標本A與標本B癌標誌物等量而關於標本A和標本B癌轉移的判斷結果也一樣。
過去通過鏡檢組織切片的組織診斷只能檢查組織的一部分，一旦在不含癌細胞的部位切片的話，有可能漏過癌細胞。另一方面，通過分子檢查判斷癌轉移能夠使用從生物體採集的全部標本(或製作切片剩餘的標本)，因此，與僅憑部分截面檢查的組織診斷不同，漏診的可能較小。
在本實施方式中，標本的管家基因的mRNA測定值不用標準化，但是可以作為判斷核酸擴增反應是否正確進行的對照物使用。管家基因在幾乎各種細胞中均有表達，因此，如果檢測出管家基因的mRNA，就可認為癌標誌物的核酸擴增反應也適當發生。另一方面，若沒有檢測出管家基因的mRNA，則認為核酸擴增反應沒有正確發生，懷疑其起因於酶失去活性等。
作為管家基因，可以例如β-肌動朊、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、β2微球蛋白和次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1(HPRT1)等基因。
在本實施方式中，所述閾值可根據癌標誌物和核酸擴增法的種類適當設定。該閾值比如既可以低於確認癌轉移的組織或細胞(陽性標本)所含癌標誌物的測定值，也可以設定得比確認沒有癌轉移的組織或細胞(陰性標本)所含癌標誌物的測定值高。
最好將數個陽性標本的癌標誌物測定值和多個陰性標本的癌標誌物測定值進行比較，以能夠概率最高地區分陽性標本和陰性標本的值作為閾值。比如，用QRT-PCR法檢測乳腺癌轉移時，閾值設為230～260個拷貝數，檢測胃癌轉移時閾值設為8～690個拷貝數，檢測大腸癌轉移時閾值設為79～180個拷貝數。用QRT-LAMP法檢測檢測乳腺癌轉移時，閾值設為86～360個拷貝數，檢測胃癌轉移時閾值設為10～270個拷貝數，檢測腸癌轉移時閾值設為170～640個拷貝數。
在本實施方式中，根據癌標誌物的絕對值與閾值的比較結果判斷癌向組織或細胞的轉移。即，當癌標誌物的絕對值比閾值高時可以斷定轉移為陽性，當癌標誌物的絕對值比閾值低時則斷定轉移為陰性。通過取得這種判斷結果即可作為手術方式、切除範圍和術後治療方針等的決定指標。
本實施方式對癌的種類無特別限定，比如可以是乳腺癌、胃癌、食道癌、大腸癌和前列腺癌等。
本實施方式的癌轉移判斷通過儀器進行。
此儀器包括一個測定裝置，用於獲取關於癌標誌物絕對量的信息；一臺計算機，用於對比所述絕對量和預設閾值，判斷癌的組織轉移。
對於測定裝置無特別限定，只要能獲得關於癌標誌物絕對量的信息即可。但以能以RT-LAMP法和RT-PCR法測定擴增核酸的核酸擴增裝置為宜。核酸擴增裝置具有測定核酸擴增產物的測定單元，該核酸擴增產物是用引物和酶擴增從生物採集的組織或細胞中的癌標誌物而獲得的。
計算機用於根據測定單元獲得的數據計算出癌標誌物絕對量，將其與預設閾值比較，從而檢測出癌的轉移。此設備也可具備輸出癌轉移檢測結果的顯示單元。
本發明的設備的一個實施方式如圖1～3所示。圖1為本實施方式的設備的整體結構斜視圖。圖2為圖1所示作為測定系統的核酸擴增裝置的整體結構斜視圖。圖3為圖2所示核酸擴增裝置的平面略圖。
本發明某實施方式的設備如圖1所示，由核酸擴增裝置101和與該核酸擴增裝置連接能進行有線或無線通信、作為分析手段的計算機(PC)102組成。
核酸擴增裝置101如圖2所示，包括分裝機構10、上樣單元20、吸嘴安裝單元30、吸嘴廢棄單元40、由5個反應檢測塊50a構成的反應檢測單元50和用於向X方向和Y方向移送分裝設備的移送器60。
分裝機構10如圖2所示，包括被移送器60向X方向和Y方向(水平方向)移動的旋臂11和與旋臂11相對可各自獨立地向Z方向(垂直方向)移動的一對(二支)注射器12。
如圖2和圖3所示，上樣單元20從裝置眼前開始依次有10個試樣管插孔21a～21j、一個酶試劑容器孔21k和一個引物試劑容器孔21L。10個試樣管插孔21a～21j分5行2列排列。試樣管插孔21C和21d、試樣管插孔21e和21f、試樣管插孔21G和21H、試樣管插孔21i和21j分別從裝置裡面向外依次置於試樣放置位置1、試樣放置位置2、試樣放置位置3和試樣放置位置4。
本實施方式中，正面左側的試樣管插孔21C、21e、21G和21i插有經預處理(勻質化、過濾等)生物組織(淋巴結)切片製作的可溶解抽取液(測定用試樣)的試樣管22，正面右側的試樣管插孔21d、21f、21H和21j插裝有所述試樣稀釋到10倍的稀釋試樣的試樣管23。
試樣管插孔21a用於放置裝陽性對照物的容器24，該陽性對照物用於確認應該擴增的核酸是否正常擴增；而試樣管插孔21b用於放置裝有陰性對照物的容器25，該陰性對照物用於確認不該擴增的核酸是否正常未擴增。
酶容器插孔21k和試劑容器插孔21L分別放置裝有用於擴增對應於CK19 mRNA的cDNA(以下也稱CK19CDNA)的核酸擴增酶試劑的酶試劑容器26和裝有CK19的引物試劑的引物試劑容器27。
反應檢測單元50的各反應檢測塊50a如圖2和圖3所示，由反應部51、二個濁度檢測部52和閉合機構53(參照圖2)構成。設置於各反應檢測塊50a的反應部51如圖3所示，設置有二個用於放置檢測池54的檢測池孔51a。各反應檢測塊50a從裝置裡側向外依次排列於池位1、池位2、池位3、池位4和池位5。
濁度檢測部52由置於反應部51一側基板55a上的由有465nm波長的蘭色發光二極體組成的發光二極體光源部52a和配置於反應部51另一側基板55b上的光電二極體集光部52b構成。各反應檢測塊50a分別配置了由一個發光二極體光源部52a和一個光電二極體集光部52b為一組的濁度檢測部52各二組。
檢測池54有裝試樣的2個試樣池54a和蓋2個試樣池54a的2個蓋子54b。
移送器60如圖2所示，有向Y方向移送分裝機構10的直行嚮導61和球型螺杆62、驅動球型螺杆62的步進電動機63、向X方向移送分裝機構10的直行嚮導64和球型螺杆65、驅動球型螺杆65的步進電動機66。向X方向和Y方向移送分裝機構10是靠步進電動機63和步進電動機66分別轉動球型螺杆62和65實現的。
計算機102如圖1所示有輸入設備鍵盤102a和滑鼠102b、由監視器組成的顯示器102c以及分析試樣測定結果的CPU102d。
下面，參照圖1～圖3說明本實施方式中判斷設備的運行過程。此實施方式如上所述，從癌手術中切除的淋巴結組織中的癌標誌物mRNA合成cDNA，通過RT-LAMP法擴增cDNA。反應液因隨著擴增而產生的焦磷酸鎂而變濁，由於濁度上升，通過測定反應液的濁度變化即可測定癌標誌物數量。將此測定結果與閾值比較，判斷癌的淋巴結轉移。
首先如圖2和圖3所示，將對從生物切除的組織進行預處理(勻質化、過濾等)後溶解的液體(以下稱試樣)裝入試樣容器22，將試樣容器22插入試樣管插孔21C～21j。將裝有陽性對照物的容器24和裝有陰性對照物的容器25分別插入試樣管孔21a和21b(參照圖3)。在酶試劑容器孔21k(參照圖3)和引物試劑容器孔21L分別放入裝有CK19CDNA擴增用核酸擴增酶試劑的酶試劑容器26和裝有CK19CDNA擴增用引物試劑的引物試劑容器27。吸嘴安裝單元30設置2個各自收納有36個使用後丟棄的吸移管吸嘴31的託盤32。
核酸擴增裝置101一啟動，首先，分裝機構10被圖2所示移送器60從初始位置移到吸嘴安裝單元30後，分裝機構10的二個注射器12在吸嘴安裝單元30向下移動。於是，二個注射器12的頂端插入二個吸移管吸嘴31的上部開口處，從而自動裝上吸移管吸嘴31。當二個注射器12向上移動之後，分裝機構10的旋臂11向X方向移動，移向裝有CK19引物試劑的引物試劑容器27的上方。位於引物試劑容器27上方的一個注射器12向下移動，吸移引物試劑後向上移動。分裝機構10的旋臂11被移送器60向Y方向移動，使另一個注射器12同樣位於引物試劑容器27的上方。然後另一個注射器12向下移動，同樣從引物試劑容器27吸移引物試劑後向上移動。如此，引物試劑容器27內的CK19引物試劑被安裝在注射器12上的二個吸移管吸嘴31吸移。
引物試劑吸移後，二個注射器12都移向上方後，分裝機構10的旋臂11被移送器60移向位於最裡面(正對裝置的裡側)池位1的反應檢測塊50a上方。在最裡面的反應檢測塊50a，二個注射器12向下移動，使裝在二個注射器12的二個吸移管吸嘴31分別插入檢測池54的二個池54a中，再用注射器12將引物試劑吐到二個池54a中。
引物試劑吐出後，二個注射器12向上移動，分裝機構10的旋臂11被移送器60向X方向移動，移到吸嘴廢棄單元40的上方。在吸嘴廢棄單元40的上方，吸移管吸嘴31被丟棄。具體而言，二個注射器12向下移動，使吸移管吸嘴31插入吸嘴廢棄單元40的二個吸嘴廢棄孔40a(參照圖3)。在此狀態下，分裝機構10的旋臂11被移送器60向Y方向移動，使吸移管吸嘴31移到槽40b下面，然後向上移動二個注射器12，吸移管吸嘴31上部的緣卡在槽40b下面，受到向下的力，從而吸移管吸嘴31自動脫離二個注射器12的嘴部，這樣，吸移管吸嘴31就被丟棄在吸嘴廢棄單元40。
接下來，以同樣的動作酶試劑從酶試劑容器26吐到所述池54a，再以同樣的動作將試樣從試樣容器22和試樣容器23吐到所述池54a。
引物試劑、酶試劑和試樣向所述池54a的吸移動作完成後，檢測池54的蓋子54b閉合。當此閉合動作完成後，將檢測池54內的液溫從約20℃加溫到約65℃，通過RT-LAMP反應從癌標誌物(mRNA)合成cDNA，再對合成的cDNA進行擴增。隨著cDNA的擴增，生成焦磷酸鎂，反應液變濁。用圖3所示發光二極體光源部52a和光電二極體集光部52b檢測(監測)擴增反應過程中檢測池54內的濁度。
試樣的濁度數據從核酸擴增裝置101實時傳送到計算機102。計算機102的CPU102d實時接收濁度數據，測定濁度達到一定值時所需時間(檢測時間)。根據測定的檢測時間計算出試樣中所含癌標誌物的拷貝數，與預先設定的閾值比較，判斷癌轉移。
下面，參照圖4就計算機102的CPU102d處理過程進行說明。
步驟S1，CPU102d從核酸擴增裝置101接收反應液的濁度數據。
步驟S2，CPU102d從接收到的濁度數據測定檢測時間，根據此檢測時間計算出癌標誌物的拷貝數，比較此拷貝數和預設閾值。根據比較結果判斷癌轉移為陽性還是為陰性。具體地說，拷貝數超過一定閾值時，判斷為癌轉移陽性，未達到一定閾值時，判斷為癌轉移陰性。
步驟S3，CPU102d將步驟S2的判斷結果輸送到顯示單元102c。
在所述實施方式中，核酸擴增裝置101負責測定反應液的濁度數據和將測得的濁度數據傳送至計算機102，計算機102則負責計算出癌標誌物的拷貝數，比較拷貝數，判斷癌轉移。
但是也可以由核酸擴增裝置101負責測定反應液的濁度數據、計算出癌標誌物的拷貝數、將計算出的拷貝數傳送至計算機102，而由計算機102負責比較拷貝數，判斷癌轉移。
實施例例1用QRT-PCR法診斷乳腺癌的轉移測定用試樣的製備用在組織診斷中組織學上認為有乳腺癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陽性淋巴結)24個和組織學上診斷為沒有乳腺癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陰性淋巴結)52個如下製備測定用試樣。
在各淋巴結(約50～600mg/個)中添加4mL處理液(含pH3.4、200mM甘氨酸-HCI、5％Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格瑪公司生產)和20％DMSO(和光純藥制))，用攪拌機勻質化。
將所得勻質液以10,000XG、室溫下離心分離1分鐘。
取上清200μL。
用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN公司制，產品號74014)純化上清中所含RNA，將所得溶液作為測定用試樣使用。
癌標誌物的測定使用從陽性淋巴結和陰性淋巴結製備的測定用試樣，採用實時PCR裝置(ABI PRISM(註冊商標)7000型螢光定量PCR儀，應用生物系統公司)進行QRT-PCR反應，測定CK19的mRNA。
實時RT-PCR使用QRT-PCR試劑盒QuantiTect SYBR Green RT-PCR試劑盒(QIAGEN公司制，產品號204245)按照使用說明書進行，反應液的組成和反應條件如下檢測CK19的引物上遊引物5′-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3′(序列號1)下遊引物5′-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3′(序列號2)反應液RNase-free H2O 10.99μL2Xmastermix 12.50μL100μM上遊引物(最終濃度500nM)0.13μL100μM下遊引物(最終濃度500nM)0.13μLQuantiTect RTmix 0.25μL測定用試樣 1.00μL合計 25.00μL反應條件50℃、30分鐘95℃、15分鐘以下工序重複40個周期；94℃、15秒60℃、1分鐘。
求反應液螢光強度超過閾值(所述實時PCR儀配備的SDS軟體自動設定的值)時的PCR周期數，根據此PCR周期數算出mRNA拷貝數。
閾值被設定為每個測定用試樣500個拷貝(圖5中的點線)。
各測定用試樣的mRNA拷貝數如圖5所示。
得知，用本實施例的方法可以判斷組織診斷中診斷為陽性標本的標本(+)為陽性，組織診斷中診斷為陰性標本的標本(-)為陰性。
(比較例1)測定測定用試樣中β-肌動朊的mRNA的量作為管家基因。測定方法同實施例1中測定CK19的mRNA。用於PCR的引物如下用於檢測β-肌動朊的引物上遊引物5′-CCACACTGTGCCCATCTACG-3′(序列號3)下遊引物5′-AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3′(序列號4)用比較例1所得β-肌動朊mRNA的拷貝數除以實施例1所得CK19的mRNA拷貝數(進行標準化)，結果如圖6所示。
從圖6的結果可以看出，標準化CK19的mRNA拷貝數，即使將閾值設為0.0001～0.001，也有可能判斷幾個陰性標本為陽性。
例2用QRT-PCR法診斷大腸癌的轉移除用在組織診斷中組織學上認為有大腸癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陽性淋巴結)34個和組織學上診斷為沒有大腸癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陰性淋巴結)40個外，其他與實施例1同，測定測定用試樣中的CK19mRNA的絕對量。
求反應液螢光強度超過閾值時的PCR周期數，根據此PCR周期數算出mRNA拷貝數。
閾值設定為每個測定用試樣130個拷貝數。
各測定用試樣的mRNA拷貝數如圖7所示。
得知，用本例的方法可以判斷出組織診斷中診斷為陽性標本的標本(+)為陽性，組織診斷中診斷為陰性標本的標本(-)為陰性。
例3用QRT-PCR法診斷胃癌的轉移除用在組織診斷中組織學上認為有胃癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陽性淋巴結)7個和組織學上診斷為沒有胃癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陰性淋巴結)8個外，其他與實施例1同，測定CK19的mRNA絕對量。
求反應液螢光強度超過閾值時的PCR周期數，根據此PCR周期數算出mRNA拷貝數。
閾值設定為每個測定用試樣350個拷貝數。
各測定用試樣的mRNA拷貝數如圖8所示。
得知，用實施例1～3的方法可以判斷出，組織診斷中診斷為陽性標本的標本(+)為陽性，組織診斷中診斷為陰性標本的標本(-)為陰性。
從以上結果可以知道，用實施例1～3的方法可以正確判斷各種癌的癌轉移。
例4用QRT-LAMP法診斷乳腺癌的轉移測定用試樣的製備用在組織診斷中組織學上診斷為有乳腺癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陽性淋巴結)19個和組織學上診斷為沒有乳腺癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陰性淋巴結)45個，如下製備測定用試樣。
在各淋巴結(約50～600mg/個)中添加4mL處理液(含pH3.4、200mM甘氨酸-HCI、5％Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格瑪公司生產)和20％DMSO(和光純藥制))，用攪拌機勻質化。
將所得勻質液以10,000XG、室溫下離心分離1分鐘，取上清液200μL。
將此上清液作為測定用試樣使用。
反應緩衝液的製備將以下物質混合，製備13.97μL的反應液。
750mM TRIS緩衝液(pH8.0) 1.00μl10XThermopol緩衝液(新英格蘭bioLaboratorie公司生產)2.50μl
10mM dNTPs 2.00μl100mM MgSO4 0.75μl100mM二硫蘇糖醇 1.25μl2％Tergitol(Sigma Aldrich Japan公司制)2.50μlH2O 3.97μl酶試劑的製備混合以下成份製備3.04μL的酶試劑。
10U/μl AMV逆轉錄酶(普洛麥格(Promega)公司制) 0.14μl8U/μl Bst DNA聚合酶(新英格蘭bioLaboratorie公司制)2.27μlRNase inhibitor(普洛麥格公司制) 0.63μl引物溶液的製備混合以下成份製備6.00μL的引物試劑。
80pmol/μl上遊內引物 1.00μl(序列號55′-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3′)80pmol/μl下遊內引物 1.00μl(序列號65′-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3′)5pmol/μl 上遊外引物 1.00μl(序列號75′-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3′)5pmol/μl下遊外引物 1.00μl(序列號85′-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3′)60pmol/μl loop上遊引物 1.00μl(序列號95′-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3′)60pmol/μl loop下遊引物 1.00μl
(序列號105′-CGTCTGGCTGCAGATGA-3′)反應液的製備混合所述反應緩衝液、酶試劑和引物溶液調製出23μL溶液，將此溶液與測定用試樣2μL混合，製備反應液25μL。
用QRT-LAMP技術進行核酸擴增及其測定用實時濁度測定裝置(Teramecs公司制LA-200)對反應液中的核酸擴增，實時測定作為核酸擴增副產品生成的焦磷酸鎂所造成的反應液的混濁。
測定反應液濁度達到0.1時所需的時間(檢測時間)。
根據此檢測時間計算出CK19mRNA的拷貝數(絕對量)。
閾值設定為220拷貝數。
各測定用試樣的mRNA拷貝數如圖9所示。
得知，本例方法可以將在組織診斷中診斷為陽性標本的標本(+)判斷為陽性，可以將在組織診斷中診斷為陰性標本的標本(-)判斷為陰性。
例5用QRT-LAMP法診斷大腸癌的轉移除用在組織診斷中組織學上認為有大腸癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陽性淋巴結)34個和組織學上診斷為沒有大腸癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陰性淋巴結)40個製備測定用試樣外，其他與實施例4相同，測定CK19mRNA的絕對量。
用QRT-LAMP法測定各測定用試樣中所含mRNA相應的cDNA擴增、濁度達到0.1時所需的時間(檢測時間)。
根據此檢測時間計算出CK19mRNA的拷貝數(絕對量)。
閾值設定為400個拷貝。
各測定用試樣的mRNA拷貝數如圖10所示。
得知，用本例方法可以判斷在組織診斷中診斷為陽性標本的標本(+)為陽性，可以判斷在組織診斷中診斷為陰性標本的標本(-)為陰性。
例6用QRT-LAMP法診斷胃癌的轉移除用在組織診斷中組織學上診斷為有胃癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陽性淋巴結)7個和組織學上診斷為沒有胃癌由來的癌細胞轉移的淋巴結(陰性淋巴結)8個製備測定用試樣外，其他與例4相同測定CK19mRNA的絕對量。
用QRT-LAMP法測定各測定用試樣中所含mRNA相應的cDNA擴增、濁度達到0.1時所需的時間(檢測時間)。
根據此檢測時間計算出CK19mRNA的拷貝數(絕對量)。
閾值設定為140個拷貝。
各測定用試樣的mRNA拷貝數如圖11所示。
得知，用實施例4～6所示方法可以判斷在組織診斷中診斷為陽性標本的標本(+)為陽性、在組織診斷中診斷為陰性標本的標本(-)為陰性。
從以上結果看，顯然用實施例4～6所示方法可以正確判斷各種癌的癌轉移。
從所述得知，不進行標準化，採用癌標誌物的絕對量可以正確判斷癌轉移。顯然，本發明的檢測方法不論診斷對象為何種癌，不論用何種核酸擴增法，均可有效判斷。
序列表110希森美康120癌轉移檢測方法及其設備130IP378416010170PatentIn version 3.1210121120212DNA213人工序列220
223引物4001cagatcgaag gcctgaagga20210221119212DNA213人工序列220
223引物4002cttggcccct cagcgtact 19210321120212DNA213人工序列220
223引物4003ccacactgtg cccatctacg 20210421126212DNA213人工序列220
223引物4004aggatcttca tgaggtagtc agtcag 26210521141212DNA213人工序列220
223引物4005ggagttctca atggtggcac caactactac acgaccatcc a 41210621141212DNA213人工序列220
223引物4006gtcctgcaga tcgacaacgc ctccgtctca aacttggttc g 41210721118212DNA213人工序列220
223引物4007tggtaccaga agcagggg 18210821119212DNA213人工序列220
223引物4008gttgatgtcg gcctccacg19210921118212DNA213人工序列220
223引物4009agaatcttgt cccgcagg 182101021117212DNA213人工序列220
223引物40010cgtctggctg cagatga 1權利要求
1.一種癌轉移的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟測定採自生物的組織或細胞中的癌標誌物的絕對量的測定步驟；以及通過對比所述測定出的絕對量和預設閾值，判斷癌是否向所述組織或所述細胞所屬組織轉移的判斷步驟。
2.一種癌轉移的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟測定反映採自生物的組織或細胞中的癌標誌物絕對量的信息的測定步驟；以及通過將測定出的反映所述絕對量的信息與預設閾值進行比較，而無需用所述癌標誌物以外分子的絕對量進行標準化處理，判斷癌是否向所述組織或所述細胞所屬組織轉移的判斷步驟。
3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特徵在於，所述組織為淋巴結組織。
4.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特徵在於，所述癌標誌物用測定用試樣進行測定，該測定用試樣是在所述組織或細胞中添加處理液，讓所述組織或細胞所含癌標誌物移至溶液中製備的，而不進行核酸抽取處理。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述處理液含二甲亞碸。
6.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特徵在於，所述的測定採用核酸擴增法。
7.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特徵在於，所述癌標誌物為mRNA。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特徵在於，所述mRNA為角蛋白mRNA。
9.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特徵在於，所述癌選自乳腺癌、胃癌、食道癌、大腸癌和前列腺癌。
10.一種癌轉移檢測設備，包括測定採自生物的組織或細胞中的癌標誌物的絕對量的測定系統；以及通過對比所述測定出的絕對量和預設閾值，判斷癌是否向所述組織或所述細胞所屬組織轉移的判斷系統。
全文摘要
本發明提供一種癌轉移的檢測方法及其設備。其中癌轉移的檢測方法包括測定步驟，測定採自生物的組織或細胞中所含癌標誌物的絕對量；判斷步驟，通過比較所述所測絕對量和預設的閾值，判斷癌是否向所述組織或所述細胞所屬組織轉移。癌轉移檢測設備包括測定採自生物的組織或細胞中的癌標誌物的絕對量的測定系統；以及通過對比所述測定出的絕對量和預設閾值，判斷癌是否向所述組織或所述細胞所屬組織轉移的判斷系統。
文檔編號C12M1/34GK101089197SQ20071011099
公開日2007年12月19日 申請日期2007年6月12日 優先權日2006年6月13日
發明者中林一樹, 大友泰裕, 大東元就, 高田英基, 檜山佳代 申請人:希森美康株式會社