一株腐皮鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗根腐病中的應用的製作方法
2023-06-08 19:50:21
本發明屬於微生物技術領域，具體涉及一株腐皮鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗根腐病中的應用。
背景技術：
石斛屬(dendrobium)為蘭科第二大屬，多年生草本植物，全球共計1500種以上。《中國藥典》2010年版將收載的石斛分為兩類，即石斛和鐵皮石斛，後者鐵皮石斛(d.officinalekimuraetmigo)除有良好的藥用功效外，還有非常好的滋補和養身效果，是極為珍貴的中藥材，素有「藥中黃金」之美稱。
由於過量採挖和生態環境破壞，石斛現已被我國列為瀕於滅絕的受保護的藥材品種之一。目前，鐵皮石斛的市場需求主要靠人工栽培，但人工種植鐵皮石斛生長速度慢，平均產量低，病害發生較為嚴重。目前，病害的防治仍然主要依靠農藥。從保護生態環境和食品安全的角度出發，鐵皮石斛作為名貴中藥，應儘可能減少農藥的使用量。蘭科植物對菌根的依賴性較強，菌根真菌與植物根系互為條件形成共生體，在生理上是一個相互協調的整體，並在共同進化的過程中，形成特定的形態特徵。菌根真菌與宿主植物的相互關係多數情況下是互利的，菌根真菌從植物體內獲取生長必需的營養物質，而植物通過與共生真菌結合，也能更好的從土壤中得到所需的養分及水分等，改善植物的生長勢，提高植物的抗病能力。合理利用菌根資源，提高鐵皮石斛的抗病能力，在一定程度上減少化學農藥的施用量，這也符合農業的可持續發展戰略。因此，菌根相關研究已成為鐵皮石斛產業的一個重要方向。
技術實現要素：
發明目的：針對現有技術存在的問題，本發明提供一株鐵皮石斛抗根腐病菌株jsnl007-1，用於改善鐵皮石斛抗根腐病的抗病能力。本發明的另一目的是提供該菌株生產的菌劑及其應用，該菌株製備的固體微生物菌劑可使鐵皮石斛抗根腐病能顯著提高。
技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述的一株腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)，菌株名為jsnl007-1，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號為cgmccno.13686，保藏日期為2017年3月10日。該菌株是2015年6月在江西省鷹潭市鐵皮石斛栽植區內生長狀況較好的植株上分離獲得的。該菌株jsnl007-1主要生物學特性為：在pda平板上培養，菌絲疏鬆，絨毛狀；正面為灰白色，背面為乳黃色。
本發明所述的菌株jsnl007-1在鐵皮石斛抗根腐病中的應用。
本發明所述菌株jsnl007-1生產的微生物菌劑。
本發明所述的菌株jsnl007-1生產微生物菌劑的製備方法，通過以下步驟所製成：
(1)以棉籽殼菌渣為培養基質、硝酸銨為外源氮源、蔗糖為外源碳源，製備成固體培養基，滅菌，接種腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1；
(2)在27-30℃，每天8h光照16h黑暗、ph6.0條件下培養20～30天；
(3)將步驟(2)培養好的固體微生物菌劑切割成1cm3大小的塊狀物，備用。
其中，步驟(1)所述滅菌條件為121℃和101.3千帕的高壓條件下滅菌20分鐘。
本發明所述的菌株jsnl007-1生產的微生物菌劑在鐵皮石斛抗根腐病中的應用。
其中，所述應用的具體步驟為：將固體微生物菌劑接種置於鐵皮石斛幼苗栽培基質表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑接種量為5-6g。
進一步地，所述鐵皮石斛幼苗栽培基質相對含水量維持在60％以上至少10天。以確保菌絲在基質內成活。
有益效果：與現有技術相比，本發明的優點是：
(1)本發明的腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1對鐵皮石斛抗病作用效果顯著，尤其是用於改善鐵皮石斛抗根腐病的抗病能力，對減少化學農藥的使用有一定作用，保證食用安全的重要手段。
(2)腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1生產的微生物菌劑能使鐵皮石斛抗根腐病能顯著提高，並且培養條件簡單、容易保存，易於工業化生產，具有良好的開發應用前景。
附圖說明
圖1為本發明菌株jsnl007-1菌落照片；
圖2為本發明菌株jsnl007-1菌根化鐵皮石斛的抗根腐病能力分析圖。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
實施例1
在江西省鷹潭市鐵皮石斛栽植區內生長狀況較好的植株上分離篩選到一株鐵皮石斛抗根腐病菌株jsnl007-1，該菌株在pda平板上培養，菌絲疏鬆，絨毛狀；正面為灰白色，背面為乳黃色，如圖1所示。
擴增該菌株jsnl007-1的its區全序列並進行測序，pcr擴增得到的rdnaits序列全序列，如seqidno1所示，通過在genebank上進行比對發現，結果表明菌株jsnl007-1與腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)菌株的同源性最近，與菌株fusariumsolaniqk1409120101和fusariumsolanicdr3p2f2同源性都達到99％，結合形態和生理生化特徵，將菌株jsnl007-1初步鑑定為腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)，命名為腐皮鐮刀菌jsnl007-1(fusariumsolanijsnl007-1)，屬於半知菌亞門瘤座孢目鐮孢屬。將該菌株jsnl007-1送交位於中國北京，中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)保藏，保藏編號為cgmccno.13686，保藏日期為2017年3月10日。
實施例2
腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1生產的微生物菌劑：
(1)以棉籽殼菌渣為培養基質、硝酸銨為外源氮源、蔗糖為外源碳源，製備成固體培養基質裝入高壓滅菌袋內，於121℃和101.3千帕的高壓條件下滅菌20分鐘，待培養基質冷卻後在無菌條件下接種菌根真菌jsnl007-1，然後進行人工培養；
(2)人工培養的具體培養條件為27-30℃、每天8h光照16h黑暗、ph6.0條件下培養20～30天，
(3)將步驟(2)培養好的固體微生物菌劑切割成1cm3大小的塊狀物，備用。
實施例3
腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1生產的微生物菌劑對鐵皮石斛根腐病的抗病能力作用效果分析。
(1)將實施例2培養好的固體微生物菌劑，置於鐵皮石斛幼苗栽培基質表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑接種量為5-6g，施用菌劑後，基質相對含水量維持在60％以上至少10天，以確保菌絲在基質內成活。
(2)通過紫外光和黑暗處理培養在pda培養基上的根腐病病原菌，製得病菌孢子懸浮液，將其稀釋到2×105個/ml；
(3)將步驟(1)供試鐵皮石斛植株在同等條件下進行管理，均選取供試植株上部第五片葉，用針刺法人工製造傷口，在製造傷口的葉片表面噴灑病原菌孢子懸浮液2ml/每株，溫室內溫度為30-35℃，溼度95％，每種處理均為100株，並設3組重複；同時選取沒有接種腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1生產的微生物菌劑的供試植株上部第五片葉作為對照(ck)，採用相同的方法噴灑病原菌孢子懸浮液2ml/每株，並採用相同的培養方法。
(4)接種後每天監控根腐病的發病程度，統計發病率、發病指數。
病株分級標準：病情分級主要根據接種葉片正反兩面出現病斑數量及直徑，初定分級標準為：
0：正常；
ⅰ：正反兩面有少量病斑；
ⅱ：正反兩面有病斑，發病面積佔葉片總面積1/4以下；
ⅲ：正反兩面有病斑，發病面積佔葉片總面積的1/4-1/2；
ⅳ：正反兩面有病斑，發病面積佔葉片總面積1/2-3/4；
ⅳ：正反兩面有病斑，發病面積佔葉片總面積3/4以上。
感病指數＝∑(各級病株數×該級代表數值)×100/(總株數×最高一級代表數值)；
感病率＝(感病株樹/接種株樹)×100％。
沒有接種腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1生產的微生物菌劑的供試植株與接種微生物菌劑的感病率和感病指數的結果，如圖2所示。
由圖2表明，在人工接種病原菌孢子後的30天內，接種腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1生產的固體菌劑的鐵皮石斛植株感病率和感病指數均明顯低於未接種腐皮鐮刀菌(fusariumsolani)jsnl007-1菌劑的鐵皮石斛植株。
sequencelisting
江蘇農林職業技術學院
一株腐皮鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗根腐病中的應用
2017
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patentinversion3.3
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腐皮鐮刀菌（fusariumsolani）
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