分析細胞或含有核酸的其它生物材料的方法
2023-06-08 19:02:11
專利名稱：分析細胞或含有核酸的其它生物材料的方法
分析細胞或含有核酸的其它生物材料的方法本發明涉及分析細胞或其它生物材料的方法，識別完整的和不完整的細胞的方法、所述方法的檢測系統，以及涉及一些新的化合物和包括這些化合物和核酸的螢光複合物。本發明在細胞和其它生物材料的分析中具有廣泛應用，尤其但不限於，涉及一種類型的不滲透細胞的螢光染料及其用途。用於測定樣本的細胞濃度和活力的方法(包括在非固定的細胞樣品中識別細胞完整性，以及在固定的和可滲透的細胞樣品中染色核材料)常規用於生命科學和醫療工業中。鑑定與形態學、生物化學和分子變化(其傾向於、優先於以及伴隨細胞死亡(例如壞死或凋亡))有關的過程的能力在生命科學具有廣泛的關注。分子探針技術(其容易在流式細胞儀和顯微鏡平臺上進行，允許在未接受先前固定的細胞樣品中進行所述過程的細胞水平研究)尤其引起關注(Darzynkiewicz, Juan等.1997)。已經開發了多種基於突光染料的染色方案，用於流式細胞和顯微分析真核細胞和細菌的活力。活/死細胞分析已經先前探索了完整的或代謝活性的細胞防止比色或螢光染料穿透至一個或多個細胞腔隙的能力。在高等真核生物中，該性質主要涉及質膜的完整性，而在低等真核生物、原核系統和植物中，細胞壁組成和破壞也可影響染料穿透和行為。已經公開了從活細胞狀態至死細胞狀態的過渡期，但其經常在不同類型的細胞和所涉及的過程的速度和形式之間存在差別。認為活的、完整的或有活力的細胞為如下細胞其同時保留一定程度的代謝功能和質膜完整性，但不必然意味著具有增殖能力。質膜完整性的喪失，而非其它膜重組的過程，是細胞死亡過程中的臨界點，並且導致細胞在細胞的內環境與外環境之間顯示增強的或自由的分子(根據它們的具體性質)通道的可能。在細胞死亡過程中，膜重組的實例表現為膜聯蛋白V分子與細胞表面的結合增強，但是需要與膜聯蛋白V與具有破裂的膜的細胞(所述細胞代表了與不滲透細胞的染料的正染色有關的細胞死亡晚期)的結合相區別。顯示受損的膜完整性的細胞可以描述為無活力的或不完整的細胞，並且認為包括死的、可滲透的或死亡中的細胞，其顯示了膜破裂的特徵。該臨界轉變點可以通過不滲透活細胞的染料的進入增加得以鑑定，提供了細胞死亡的功能性定義和一種分析方法。優選地，所述染料具有結合至殘留的細胞內結構的能力，因此優先蓄積在細胞群中的不完整的細胞內。應當理解，在細胞死亡過程中相對長期保留了攜帶殘留核酸的結構，而細胞單位最終分解為多個碎片通常鑑定為殘骸(debris)。活體染料也可用於檢測和因此選擇細胞群。這特別有利於需要保留活的、非受損的細胞的功能的分析。一種方法為通過檢測活躍的細胞代謝正面評價活力，所述細胞代謝可以通過滲透細胞的非-螢光底物在細胞內轉化為強螢光產物測定，所述強螢光產物優先保留在完整的細胞內(例如通過細胞內非-特異性酯酶活性的醋酸螢光素代謝)，因此正識別有活力的部分。在該情況下，排除具有受損的完整性的細胞用於增強來自所述分析的信息的有效性。另一方面，不滲透活細胞的染料將進入膜受損的細胞中，所述細胞為死細胞 或處於凋亡或細胞死亡的晚期。在不滲透細胞的DNA結合染料的情況下，染料進入和隨後與細胞內殘留的核酸的相互作用用於報導給定細胞的膜的受損狀態。在該情況下，所述細胞內染料與殘留的核酸(優選DNA)之間的『複合物』為報導原理(reporting principle)。在該情況下，所述試劑不再被這些細胞排出，而且現在具有複合物形成的可及性，因此提供了對活力的負染色和對受損的細胞的正染色。應當理解，細胞樣品也可使用固定方法處理，以允許細胞特徵的分析作為生命科學中所用的大量技術的一部分。所述固定方法和細胞滲透方法可以改變，但經常導致允許不滲透活細胞的染料進入的膜改變。優選通過獲取與染料高親和力結合至細胞內核酸有關的螢光信號指示染料進入，並且常常認為染料進入得到結合後螢光增強協助。不定地結合至核酸的不滲透細胞的(和滲透細胞的)螢光染料為一大類分子探針，其廣泛用於生物科學，並可容易地獲自商品供應商。這些試劑的所尋求的特徵包括核酸選擇性、激發和發射特性、量子產率、結合後螢光增強的可能、在水性環境中的性能、從非 受損的細胞排出的程度(對活力提供負染色，並對細胞死亡提供正染色)或對於完整的細胞分析的穿透至完整的細胞的速度。具體染料的選擇通常由與摻入分析的其它螢光團的光譜重疊程度以及對選擇性或最佳激發方便的光源的可用性來確定。由於細胞死亡的過程常常包括細胞性質隨擴展的期間時限(幾分鐘至幾天)連續獲得改變，因此有必要確保不滲透細胞的染料具有可忽略的毒性，使得給定染料的連續存在不會影響報導分析中活力的喪失。所述非-毒性的不滲透細胞的染料優選用於連續監測長期分析中的活力的喪失。眾所周知，在具有變化的結構完整性水平的細胞中，細胞染色質被滲透和非-滲透染料突光染色的性質的程度複雜且不容易預測(Wlodkowic, Skommer等.2007)。發生細胞死亡過程的細胞(允許其它不滲透細胞的指示劑染料進入細胞)也發生了細胞結構變化(不僅是染色質構象)。經常觀察到凋亡的細胞核被吸收陽離子染料深色染色，而對於許多DNA螢光染料凋亡的細胞核常常表現暗淡。目前的理解是，早期的凋亡細胞的染色質對陽離子染料的增強的親和力與構象鬆弛而非DNA降解有關(Erenpreisa, Freivalds等.1997)。在晚期的凋亡細胞中，降解的DNA的非常緻密的包裝促進影響螢光性質的染料進一步聚集(Erenpreisa, Freivalds 等.1997)。靶向核酸的染料對細胞的螢光染色因此是細胞狀態、滲透性質、染料結合特異性、染料結合方式以及染料-染料相互作用的複雜模型(complexmatrix)。為了在基於細胞的分析中消除該問題，常規方法已經傾向於高螢光增強和高量子產率的染料。在核酸染色中已經發現了大量不滲透細胞的染料的用途。最常使用的實例為碘化丙啶(PD。強螢光的PI信號具有檢測簡單和靈敏的優點，但當該螢光染料摻入多色分析中時具有缺點。另外，PI具有在UVA(例如365nm)波長和被藍光(例如488nm)波長激發的能力，當有差別的激發用於區分螢光分析物或通過螢光探針檢測的分析物時，其應用變得複雜。PI不具有用於方便分析細胞染色的比色特徵。尤其是，在鄰近分析PI的峰發射區域的可見光譜部分收集到的信號中，必須應用補償，以解決I益出』。此外，PI的螢光發射可能處於以下光譜區域，在該區域中來自螢光分析物或者通過螢光探針檢測的分析物的發射可能需要區分。PI提供了一些如同在紅外區(red region)和之外區域(例如>620nm波長)發射的不滲透活細胞的染料的光譜優點。
應當理解，結合至DNA的PI的高螢光強度經常需要以對數標度分析從細胞群中獲得的螢光信號，其為鑑定細胞亞群提供了廣闊的動態範圍。US 5，057，413教導了使用滲透細胞的核酸染料LDS-751，其中基於發射出的螢光的量，對DNA的偏好區分了受損的和完整的細胞。在其它實例中，在白細胞標記(CD45)的表達的流式細胞的白血病/淋巴瘤評估中，使用染料7-AAD(具有低的完整細胞滲透性質)能夠區分完整的和死的細胞，避免了非-特異性染色的缺陷(Shenkin，Babu等.2007)。在另一實例中，美國專利申請20070082377公開了使用不滲透細胞的DNA染料7-AAD作為多參數分析的組成部分，其也利用了作為膜染料的螢光探針，以及作為滲透細胞的凋亡-檢測探針的螢光探針(其結合至活躍的半胱天冬酶)。所述方法允許了區分死的或壞死的細胞(使用活體染料7-AAD檢測；當該染料結合或嵌入DNA時，其可例如經過與核酸結合後螢光增強的過程得以檢測)和特徵在於修飾的半胱天冬酶活性的凋亡的細胞。利用滲透細胞的和不滲透細胞的染料的『雙重染料』分析是已知的(Giao，Wilks等，2009 ；Biggerstaff, Le Puil 等，2006 ；Lehtinen, Nuutila 等 2004 ；fflodkowic and Skommer, 2007a ；fflodkowic and Skommer, 2007b) 常常優化所用染料的個別性能，並有效避免相互作用，使得細胞可以準確報導滲透特性。上面討論的雙重染料陣列分別地具有多種缺點和不利性質，其與應用的精確係統有關。然而，毫無例外地，在雙重染料分析中也存在基本問題，即直接結合滲透細胞的核酸染料也將染色具有受損的或破裂的膜的細胞中的核酸。獲自如上所述的滲透細胞的和不滲透細胞的染料的信號的動態範圍提供了方便的分析方法。此外，存在持續的提高螢光染料分析細胞和其它生物材料的有用性質的需要。在至少一些實施方式中，本發明解決了上述問題和需要。尤其是，在至少一些實施方式中，本發明提供了改進的不滲透細胞的染料，而且提供了能夠使用不滲透細胞的和滲透細胞的染料進行活/死細胞識別的改進的系統。在一些實施方式中，本發明提供了在遠紅外(例如>660nm波長或>690nm波長)具有優選的發射並在橙色/紅色光譜區域(例如>530<620nm波長)具有減少的發射的不滲透細胞的染料。根據本發明的第一方面，提供式(I)化合物
+
X, O NR1-A-NR2R3R4
I Il T I (Zm')1/m
火 2 d X1(I)其中A為C2_8亞烷基洱1、! 2、! 3和R4獨立地選自氫、Ch烷基、C2_4 二羥基烷基，其中連接至氮原子的碳原子不攜帶羥基且沒有碳原子被兩個羥基取代，或R2和R3 —起形成C2_6亞烷基，其與R2和R3連接的氮原子形成雜環；X1' X2 和 X3 獨立地選自氫、羥基、NR1-A-NR2R3R4+ (ZmO 1/ηι、滷代氨基(halogenoamino)、C^4燒氧基或C2_8燒酸基氧基；且
(Zn 1/ni為具有m電荷的陰離子；或者其中基團NR1被季銨化的衍生物。優選地，m為I。當用作分析細胞和其它生物材料的染料時，這些化合物的至少一些具有許多優點。所述優點包括·水溶性，用於在與基於細胞的分析常用的等滲緩衝條件相容的一系列濃度範圍方便地摻入分析。·化學純度和穩定性，用於在多重分析內可重現的使用並方便保存。·紅色/遠紅螢光性質，用於方便地摻入多參數分析中，該多參數分析具有很少有 光譜重疊或不具有光譜重疊的可見範圍螢光或橙色螢光，以容易與紅色螢光一起使用。·高親和力核酸結合性質，用於需要分析有核細胞的應用。·結合核酸後非-增強的螢光，其確保螢光發射強度與DNA結合程度之間的已知程度的化學計量。 低內源螢光，其提供未結合的染料的背景螢光的相對降低，對比於核結合後增強的信號(歸因於結合的分子的集中的濃度)。·不滲透細胞的性質，用於選擇性和正性染色具有受損的膜或不能排出染料分子的細胞。·在固定的細胞中識別細胞核的性質，其用作所有有核細胞的直接DNA染料，並且通過成像或流式細胞儀或其它檢測平臺檢測螢光發射。·對完整的細胞的低毒性，其使得染料可以在生物應用期間與細胞共同培養延長的時間，而無有害作用，例如抑制增殖。·上述性質的組合，其允許了時間相關性分析細胞完整性的喪失，所述細胞完整性通過將細胞與不滲透細胞的染料培養不同的時間進行監測，以及允許了不定期取樣相同細胞群，用於檢測細胞染色。本發明提供了季銨化的氨基烷基氨基蒽醌化合物，其可尤其用作螢光染料。季銨化的氨基烷基氨基取代基存在於至少I位。其它季銨化的氨基烷基氨基取代基可以存在於
4、5或8位，或其組合。國際公布W091/05824和W099/65992 (將它們二者的全部內容在此引入參考)公開了多種類型的氨基烷基氨基蒽醌化合物，其可用作合成本發明化合物的前體。優選地，X1, X2和X3中至少一個為NR1-A-NR2R3R4+ (Zm_) 1/m。在尤其優選的實施方式中，X2 (而非X1和X3)為NR1-A-NR2R3R4+ (Zm_) 1/m，即在1，5位被季銨化的氨基烷基氨基取代的蒽醌。在另一優選的化合物類型中，X1 (而非X2和X3)為NR1-A-NR2R3R4+ (Zm_) 1/m，即在1，4位具有季銨化的氨基烷基氨基取代基的蒽醌。1，8取代的類似物也可能存在。有利地，X1和X3均為羥基。在其它優選的實施方式中，X1和X3均為氫。優選地，R1為氫，儘管可能使用其中在該位置的氨基部分為叔胺的化合物。在這些實施方式中，優選R1為Cy烷基。優選R2、R3和R4為Ch烷基。有利地，R2、R3和R4為甲基。
在優選的實施方式中，A為(CH2)2。在一個特別優選的實施方式中，所述化合物為式(IA)
權利要求
1.式⑴化合物
2.權利要求I的化合物，其中XpX2和X3中至少一個為NR1-A-NR2R3R4+(Zm_)1/m。
3.權利要求2的化合物，其中X2,而非X1和X3,為NR1-A-NR2R3R4+(Zm_) 1/m。
4.上述權利要求中任一項的化合物，其中X1和X3均為羥基。
5.權利要求I至3中任一項的化合物，其中X1和X3均為氫。
6.上述權利要求中任一項的化合物，其中R1為氫。
7.上述權利要求中任一項的化合物，其中R2、R3和R4為Cy烷基。
8.權利要求7的化合物，其中R2、R3和R4為甲基。
9.上述權利要求中任一項的化合物，其中A為(CH2)2。
10.式(IA)化合物
11.式(IB)化合物
12.螢光複合物，其包含核酸和式(I)化合物
13.權利要求12的複合物，其中所述核酸為DNA。
14.權利要求13的複合物，其中所述DNA存在於細胞內。
15.權利要求14的複合物，其中所述DNA存在於不完整的細胞內。
16.一種分析細胞或含有核酸的其它生物材料的樣品的方法，所述方法包括以下步驟 a)製備含有式(I)化合物的生物相容的溶液
17.權利要求16的方法，其中所述與式(I)化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質為螢光，且步驟c)包括用電磁輻射激發所述式(I)化合物，並檢測放射出的螢光信號。
18.權利要求16的方法，其中所述與式(I)化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質為色度性質。
19.權利要求16至18中任一項的方法，其用於識別細胞樣品中的細胞核，其中進行步驟b)以使得細胞核中的核酸被所述式(I)化合物結合，且細胞核的識別至少部分地基於步驟C)中檢測的光譜學性質。
20.權利要求16至19中任一項的方法，其中進行步驟b)以將細胞樣品用式(I)化合物染色。
21.權利要求20的方法，其中監測到細胞死亡增加，其中在測試期之前或期間進行步驟b)，因此使得在測試期期間連續或頻繁地讀出細胞死亡增加。
22.權利要求17或從屬於權利要求17的權利要求18至21中任一項的方法，其中步驟c)包括通過流式細胞儀檢測個體細胞發射出的螢光。
23.權利要求17或從屬於權利要求17的權利要求18至21中任一項的方法，其中步驟c)包括通過螢光顯微鏡進行細胞內定位檢測。
24.權利要求16至23中任一項的方法，其用於分析固定的或滲透化處理的細胞，其中所述細胞的樣品通過使用固定劑或滲透劑處理而固定。
25.權利要求16至24中任一項的方法，其中步驟b)還包括用至少一種其它螢光染料或發光化合物處理該樣品，且步驟c)還包括檢測與該螢光染料或發光化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質。
26.權利要求25的方法，其用於識別完整的細胞和不完整的細胞，其中所述式(I)化合物不滲透細胞，步驟b)還包括用滲透細胞的第二螢光染料或發光化合物處理該樣品，且步驟c)還包括檢測與第二螢光染料或發光化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質，其中所述與式(I)化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質的檢測與存在不完整的細胞相關聯，且所述與第二螢光染料或發光化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質的檢測與存在完整的細胞相關聯。
27.權利要求26的方法，其中所述第二螢光染料或發光化合物具有與識別的細胞中的核酸和/或其它大分子材料的結合能力，該結合能力低於式(I)化合物的結合能力，並因此在式(I)化合物的存在下，較不有效地競爭結合識別的細胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述第二螢光染料或發光化合物基本上排除與不完整的細胞結合或被式(I)化合物掩蔽。
28.權利要求26或權利要求27的方法，其中所述第二螢光染料或發光化合物為式(II)化合物
29.權利要求28的方法，其中X2,而非X1和X3,為NR1-A-NR2R30
30.權利要求26至29中任一項的方法，其中在將細胞樣品暴露於為潛在毒性或者能夠誘導細胞死亡的試劑後，進行完整的和不完整的細胞的識別，以監測所述試劑對細胞樣品的影響。
31.權利要求26至30中任一項的方法，其中步驟b)還包括使用至少第三螢光染料或發光化合物處理該樣品，且步驟c)還包括檢測與所述至少第三螢光染料或發光化合物吸 收電磁輻射有關的光譜學性質，並將所述光譜學性質與完整的細胞和/或不完整的細胞的特徵或性質關聯。
32.權利要求31的方法，其中檢測的所述第三螢光染料或發光化合物的光譜學性質與檢測的所述式(I)化合物的光譜學性質相似，且不同於檢測的所述第二螢光染料或發光化合物的光譜學性質，其中檢測的所述第三螢光染料或發光化合物的光譜學性質與完整的細胞的特徵或性質有關。
33.權利要求31的方法，其中檢測的所述第三螢光染料或發光化合物的光譜學性質與檢測的所述第二螢光染料或發光化合物的光譜學性質相似，且不同於檢測的所述式(I)化合物的光譜學性質，其中檢測的所述第三螢光染料或發光化合物的光譜學性質與不完整的細胞的特徵或性質相關聯。
34.權利要求26至33中任一項的方法，其中步驟c)中檢測的光譜學性質為電磁波譜的預定區域中的發射螢光，且步驟c)包括用電磁輻射激髮式(I)化合物、所述第二和任選地所述第三和任何其它螢光染料或發光化合物。
35.權利要求34的方法，其中所述式(I)化合物、所述第二和任選地所述第三螢光染料或發光化合物被單一來源的電磁輻射共同激發。
36.權利要求35的方法，當從屬於權利要求32時，其中所述第三螢光染料或發光化合物 發射出的螢光位於電磁波譜的預定區域內，其i)與所述式(I)化合物發射出的螢光的區域相似，優選位於紅色和/或近IR區域，和ii)不同於所述第二螢光染料或發光化合物發射出的螢光的區域。
37.權利要求35的方法，當從屬於權利要求33時，其中所述第三螢光染料或發光化合物發射出的螢光位於電磁波譜的預定區域內，其i)與所述第二螢光染料或發光化合物發射出的螢光的區域相似，優選位於橙色區域，和ii)不同於所述式(I)化合物發射出的螢光的區域。
38.權利要求26至37中任一項的方法，其中步驟c)使用流式細胞儀進行。
39.權利要求26至38中任一項的方法，其中步驟c)還包括測量來自細胞的光散射。
40.一種識別完整的和不完整的細胞的方法，所述方法包括以下步驟 a)製備含有不滲透細胞的螢光染料或發光化合物的生物相容的溶液； b)製備含有滲透細胞的螢光染料或發光化合物的生物相容的溶液，該螢光染料或發光化合物具有與識別的細胞中的核酸和/或其它大分子材料的結合能力，該結合能力低於不滲透細胞的螢光染料或發光化合物的結合能力，並因此在不滲透細胞的螢光染料或發光化合物的存在下，較不有效地競爭結合至識別的細胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述滲透細胞的螢光染料或發光化合物基本上排除與不完整的細胞結合或被不滲透細胞的螢光染料或發光化合物掩蔽； c)用所述的一種或多種生物相容的溶液處理該細胞樣品；和d)檢測與不滲透細胞的螢光染料或發光化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質，且將其與不完整的細胞的存在關聯，並檢測與滲透細胞的螢光染料或發光化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質，且將其與完整的細胞的存在關聯。
41.檢測系統，其用於權利要求26至40中任一項的方法，所述系統包括 一個或多個電磁輻射源，用於激發所述方法中使用的螢光染料和發光化合物； 多個檢測器，用於檢測與螢光染料和發光化合物吸收電磁輻射有關的光譜學性質；以及 檢測器分析系統，適於將檢測的光譜學性質與完整的和不完整的細胞的存在關聯，因此識別完整的和不完整的細胞。
42.權利要求41的檢測系統，其中所述檢測器為螢光檢測器。
43.權利要求41或權利要求42的檢測系統，其具有單一來源的電磁輻射，用於共同激發所述螢光染料和發光化合物。
44.權利要求41至43中任一項的檢測系統，其中所述多個檢測器為一對檢測器的形式，其檢測所有螢光染料和發光化合物的光譜學性質。
45.組合物，其包含權利要求I的化合物與至少一種第二螢光染料或發光化合物的混合物。
46.試劑盒，其用於進行權利要求16至39中任一項的方法，其包括權利要求I的化合物，以及有關的容器和試劑。
47.製備權利要求I的化合物的方法，其包括以下步驟提供式(I)化合物的氨基烷基氨基前體化合物；並季銨化所述氨基烷基氨基前體化合物。
全文摘要
本發明提供式(I)化合物，其中A為C2-8亞烷基；R1、R2、R3和R4獨立地選自氫、C1-4烷基、C2-4二羥基烷基，其中連接至氮原子的碳原子不攜帶羥基且沒有碳原子被兩個羥基取代，或者R2和R3一起形成C2-6亞烷基，其與R2和R3連接的氮原子形成雜環；X1、X2和X3獨立地選自氫、羥基、NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m、滷代氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷醯基氧基；且(Zm-)1/m為具有m電荷的陰離子；或者其中基團NR1被季銨化的衍生物。
文檔編號C12Q1/02GK102947266SQ201180028424
公開日2013年2月27日 申請日期2011年4月8日 優先權日2010年4月9日
發明者P.J.史密斯, R.J.厄林頓, L.H.帕特森 申請人:生物狀態有限公司