團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代的微衛星遺傳指紋的製作方法

2023-06-05 05:45:52

本發明涉及水產養殖技術領域，具體地說，是團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代的微衛星遺傳指紋。

背景技術：

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是中國淡水養殖的四大家魚之一，是目前大宗淡水魚類中年產量最大的養殖品種【沈玉幫,張俊彬,李家樂.草魚種質資源研究進展.中國農學通報,2011,27(7):369-373；曹婷婷,白俊傑,於凌雲.草魚遺傳結構和遺傳多樣性的研究概況.中國農學通報,2012,28(5):76-80】。由於草魚懷卵量大，再加上親本留種和配組操作不規範，容易近交造成遺傳多樣性降低、抗病(逆)性差、性狀退化等嚴重問題【漁業簡訊.水產科技情報,2010,37(2):102-104；張德春,楊代淑,等.長江鰱遺傳多樣性的隨機擴增多態DNA分析.水產學報,1999,23(增刊1):7-14；李思發,王強,陳永樂.長江、珠江、黑龍江三水系的鰱、鱅、草魚原種種群的生化遺傳結構與變異.水產學報,1986,10(4):351-372】。因其繁殖周期長，一般需要4年以上才能達到性成熟，應用傳統的選育方法選育出草魚優良品種進展緩慢，目前草魚尚無國家審定的良種。採用染色體倍性操作結合微衛星標記遺傳多樣性評估，在生產性能優良的長江水系草魚進行良種選育也可能是一種可行的途徑。

分子標記作為魚類群體多樣性研究的有效手段，在草魚研究中得到廣泛應用【Liu Z J,Cordes J F.DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics[J].Aquaculture,2004,238(1-4):1-37】。目前，一些國內外學者應用RAPD【薛國雄,劉棘,劉潔.三江水系草魚種群RAPD分析.中國水產科學,1998,5(1):1-5】、RFLP【張四明,汪登強,鄧懷,等.長江中遊水系鰱和草魚群體mtDNA遺傳變異的研究.水生生物學報,2002,26(2):142-147】、TRAP【Zhang ZW,Cao Z M,Zhou J S,etal.Genetic structure analyses ofdifferent populations ofgrass carp(Ctenopharyngodon idella)using the TRAP technique[J].ChineseJournalofAgriculturalBiotechnology,2007,4(1):27-32】、ISSR【Chen Q,Wang C H,Li S F,et al.Analysis of genetic variation in grass carp(Ctenopharyngodon idellus)from native and colonized regions using ISSR markers[J].Biochemical Systematics andEcology,2009,37(5):549-555】及SSR【Liu F,Xia J H,Yue G H,et al.High genetic diversity and substantial population differentiation in grass carp(Ctenopharyngodon idella)revealed by microsatellite analysis[J].Aquaculture,2009,297(1-4):51-56；王解香,於凌雲,白俊傑,等.草魚EST-SSR標記及5個不同地域群體的遺傳結構分析.動物學雜誌,2011,46(5):24-32；周盼,張研,孫效文,等.基於6個微衛星標記的三江水系草魚遺傳多樣性分析.中國水產科學,2011,18(5):1011-1020；Hiroshi H,Petrino M G,Kakunagaa T.A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes[J].Proceedings ofthe National Academy ofSciences,1982,79(21):6465-6469】等手段對草魚群體的遺傳多樣性進行了研究。微衛星(SSR)標記在基因組定位方面具有分布密度高、分布均勻等特點，它一出現就被作為良好的作圖標記廣泛應用【馬洪雨,嶽永生,於豔,等.鯉微衛星引物對麥穗魚的適用性初步研究.水生生物學報,2007,31(2):278-281；吳旭東,連總強,侯玉霞,等.大口鯰微衛星標記在三個鯰形目魚類種群間適用性研究.水生生物學報,2011,35(4):638-645；DubutV,Martin J F,Costedoat C,et al.Isolation and characterization ofpolymorphic microsatellite loci in the freshwater fishes Telestes souffia and Telestes muticellus(Teleostei:Cyprinidae)[J].MolecularEcologyResources,2009,9(3):1001-1005】。另外，SSR標記由於重複性好、共顯性、符合孟德爾分離等特點，迅速應用到群體多樣性分析、構建遺傳連鎖圖譜、親子鑑定等方面【Zietkiewicz E,RafalskiA,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymease chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20(2):176-183.】。此外，SSR標記在物種基因組中廣泛存在並具有較高的多態性，可用於檢測雌核發育後代是否含有父本的遺傳物質，並用於評價雌核發育後代的純合性。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種鑑別團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代的方法。

為實現上述目的，本發明採取的技術方案是：微衛星標記在鑑別團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代中的應用。

所述的微衛星標記為17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137或HLJC151。

所述的微衛星標記為EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426或EST3643。

所述的團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代為以滅活的團頭魴精子激活草魚卵子，經冷休克處理建立的草魚雌核發育後代。

所述的團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代為以紫外線滅活的團頭魴精子激活草魚F2代親本卵子，冷休克抑制第二極體排出的方法建立的草魚雌核發育後代。

一種鑑別團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代的微衛星DNA指紋，所述的DNA指紋由EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426和EST3643組成。

一種鑑別團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代的微衛星DNA指紋，所述的DNA指紋由17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137或HLJC151組成。

一種鑑別團頭魴精子誘導草魚減數分裂雌核發育後代的方法，所述的方法測定草魚的17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137、HLJC151位點，EST1573、EST0222、HLJC20或EST0426擴增出獨有的條帶為草魴雜交後代。

本發明優點在於：

本發明以紫外線滅活的團頭魴精子激活草魚卵子，冷休克抑制第二極體排出的方法誘導出長江水系優良F2代草魚減數雌核發育子代。在後代中不僅存在雌核發育後代，還存在草魴雜交後代，雌核發育後代的體型與草魚一致，而草魴雜交後代的體型介於草魚與團頭魴之間。Partec CyFlow倍性分析儀測定結果顯示：普通草魚與雌核發育草魚的相對DNA含量分別為23.01、22.72，二者的DNA含量接近；而高體型子代的相對DNA含量為25.38，介於草魚與團頭魴(DNA含量28.21)之間，屬於草魴雜交後代。選取17個微衛星標記對草魚群體、雌核發育草魚群體和草魴雜交後代的遺傳多樣性進行了檢測，共檢測出59個等位基因，其中43.18個有效等位基因。草魚對照群體、草魴雜交後代和雌核發育草魚群體的平均等位基因依次為3.57、2.86、2.79，平均有效等位基因依次為2.93、2.37、1.96，平均期望雜合度在依次為0.6502、0.5573、0.3775，多態信息含量(PIC)平均值依次為0.5738、0.4649、0.3791。與草魚對照群體相比，雌核發育草魚群體的遺傳多樣性顯著下降，表明通過減數雌核發育方法可獲得純合性較高的草魚個體。構建了草魚後代不同群體的DNA指紋模式圖，篩選到不同群體的9個特異微衛星標記，為草魚優良群體的選育提供了基礎資料。

附圖說明

附圖1：草魚雌核發育後代的形態(A：草魚對照；B：團頭魴對照；C：雌核發育草魚；D：草魴雜交後代)。

附圖2：草魚雌核發育後代的相對DNA含量。a：雌核發育草魚；b：草魴雜交後代；c：草魚對照；d：團頭魴對照。

附圖3：草魚雌核發育不同群體微衛星DNA指紋模式圖。A：雌核發育草魚，B：草魴雜交後代，C：草魚對照群體。

附圖4：HLJC20引物在草魚群體的PAGE圖譜。M：Marker I，1-8：雌核發育草魚，9-16：草魴雜交後代，17-24：草魚對照，25-32：團頭魴對照。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。

1材料與方法

1.1實驗材料

本實驗以上海海洋大學青浦魚類育種試驗站保存的長江水系優良草魚F2代為繁殖用魚。對照組為草魚F2代親本自交後代，實驗組為紫外線滅活團頭魴(Megalobrama amblycephala)精子激活草魚F2代親本卵子，冷休克抑制第二極體排出的方法建立草魚雌核發育群體。每群體各取樣30尾，每尾剪取少許魚鰭放入95％酒精中保存於-20℃備用。

1.2草魚F2代減數雌核發育個體的誘導

團頭魴精子的滅活：緩慢擠壓成熟的雄性團頭魴的腹部，將擠出的白色精液均勻分布於玻璃培養皿中，與Hank’s緩衝液按1:4的比例稀釋。稀釋好的精液厚度控制在0.1-0.2mm，然後將玻璃培養皿平放於冰袋上，置於兩支15w紫外燈裝置中照射10-20min，距離約為15cm；為使精子照射均勻，每隔1.5min輕搖培養皿一次，顯微鏡下觀察其活力，最後將處理好的精液保存於4℃冰箱。

卵子染色體的加倍：擠取雌性草魚的卵子，與經UV照射的團頭魴精子充分混合，加水激活2min後，將受精卵浸於控溫水浴循環槽中，4-6℃冷休克處理12min，處理完的受精卵置於室溫下繼續培養，每4hr換水，並挑棄死卵直至出苗，然後放於24m2水泥池養殖。

1.3雌核發育後代的倍性檢測

取6月齡的草魚對照群體、雌核發育草魚群體、草魴雜交後代群體和團頭魴各5尾，從尾靜脈採血，然後取1μL血樣加入到1mL DAPI染液中，避光染色30-60s，用500目過濾管過濾到上樣管內，然後用Partec CyFlow倍性分析儀(產地，德國)進行DNA含量檢測。

1.4微衛星引物

本研究採用的17對草魚微衛星引物中，其中8對草魚的EST-SSR標記(EST0363、EST0307、EST3746、EST793、EST3643、EST1573、EST0426、EST222)是本實驗室篩選的草魚SSR引物【鄭國棟,陳杰,鄒曙明,等.長江草魚不同群體EST-SSR多態性標記的篩選及其遺傳結構分析.水生生物學報,2015,39(5):1003-1012】，另外9對引物(HLJC20、HLJC26、5476、17329、HLJC145、HLJC222、MFW1、HLJC137、HLJC151)分別參考文獻【王解香,於凌雲,白俊傑,等.草魚EST-SSR標記及5個不同地域群體的遺傳結構分析.動物學雜誌,2011,46(5):24-32；周盼,張研,孫效文,等.基於6個微衛星標記的三江水系草魚遺傳多樣性分析.中國水產科學,2011,18(5):1011-1020；Wang J X,Yu LY,Bai J J,et al.Development of EST-SSR markers and analysis of genetic diversity in five populations of grass carp(Ctenopharyngodon idellus)[J].ChineseJournal ofZoology,2011,46(5):24-32；李文升,劉翠,孫效文,等.草魚三、四核苷酸重複微衛星標記的分離與特徵分析.中國水產科學,2011,18(4):742-750】，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物相關信息見表1。

表1微衛星引物特徵

註：F為正向引物；R為反向引物

1.5基因組DNA製備

參照北京天根生物科技有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書介紹的方法提取樣品基因組DNA。基因組DNA提取完成後，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA質量和濃度，-20℃保存備用。

1.6PCR反應體系與擴增程序

反應體系10μL，包含5μL含染料的2×Taq PCR MasterMix(Taq DNA Polymerase：0.1U/μL；MgCl2：4mM；dNTPs each：0.4mM)，上下遊引物各0.5μL(10μmol/L)，0.5μLDNA(30-50ng)，3.5μL ddH2O。PCR反應在EppendorfMastercycler ep gradients型PCR儀上進行，反應程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，54-65℃(可據表1進行調整)退火30s，72℃延伸30s，30個循環，最後72℃延伸10min。

1.7PCR產物凝膠電泳檢測

PCR產物在8％的非變性聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，膠片大小為195mm(長)×120mm(寬)×1mm(厚)。產物上樣量均為1μL，DNAMarkerⅠ。電泳條件：電泳緩衝液為1×TBE，電壓200V，電泳1-1.5h(具體時間根據PCR產物分子量大小而定)。電泳完成後，進行硝酸銀染色，染色方法參照張倩倩等【張倩倩,蔣霞雲,鄒曙明,等.不同鯿魴魚類群體微衛星DNA指紋圖譜的構建和遺傳結構分析.水產學報,2014,38(1):15-22.】的方法進行。最後將膠片平鋪於觀片燈箱上，用數位相機照相併存入電腦。

1.8數據統計與分析

(1)用Quantity One凝膠圖像分析軟體分析微衛星條帶大小，根據每個個體產生的條帶位置確定基因型。

(2)用Popgene(Version 1.32)軟體進行分析，計算每個微衛星座位分別在3個群體中的等位基因數(number of alleles,Na)，觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)，期望雜合度(expected heterozygosity,He)。

(3)多態信息含量(polymorphic information content,PIC)【Botstein D,White R L,Skolnick M,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].The American Journal ofHuman Genetics,1980,32(3):314-331】，，式中，Pi、Pj分別為第i個和第j個等位基因的頻率，n為等位基因數目。

2結果

2.1草魚雌核發育後代不同群體的倍性檢測

以紫外線滅活的團頭魴精子激活草魚卵子，冷休克抑制第二極體排出的方法建立長江水系優良草魚F3雌核發育後代。在後代中存在形態差異明顯的2種類型後代：一種與草魚體形相似，應為減數雌核發育後代(圖1a-c)；另一種為高背體型，體形明顯偏高，可能屬草魴雜交後代(圖1d-f)。Partec CyFlow倍性分析儀測定草魚減數雌核發育後代不同群體的相對DNA含量，統計結果見表2。結果顯示，普通草魚與減數雌核發育草魚的相對DNA含量分別為23.01、22.72(圖2)，二者的DNA含量接近；而高體型子代相對DNA含量為25.38，介於草魚與團頭魴(DNA含量28.21)之間(圖2)，應屬於草魴雜交後代。

表2草魚雌核發育後代的相對DNA含量統計

2.2草魚雌核發育後代不同群體的微衛星多態性

選取17個SSR位點進行草魚不同群體多樣性分析，由表3可知，等位基因總數為59，有效等位基因總數為43.18，多態信息含量介於0.000-0.7368，只有MFW1位點在草魚群體中表現為純合，其它位點均為多態位點。根據PIC>0.5為高度多態位點，因此採用PIC位於0.35-0.75之間的14個SSR位點(17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137、HLJC151)對雌核發育後代不同群體進行遺傳多樣性分析。

2.3草魚雌核發育後代不同群體的SSR遺傳多樣性分析

採用14個多態性SSR位點在3個群體中檢出的等位基因數、有效等位基因數、觀測純合度、期望純合度、觀測雜合度、期望雜合度和多態信息含量見表4(表4-1、表4-2)。由表4可知，每個位點檢測到的等位基因數2-4個不等。在3個草魚群體中，雌核發育草魚，草魴雜交後代和草魚對照群體的平均等位基因數依次為2.79、2.86、3.57；平均有效等位基因數依次為1.96、2.37、2.93；平均期望純合度依次為0.6225、0.4427、0.3498；平均期望雜合度依次為0.3775、0.5573、0.6502；平均多態信息含量依次為0.3791、0.4649、0.5738。從這些遺傳參數中可得出，這3個群體的遺傳多樣性從高到低依次為草魚對照群體>草魴雜交後代>雌核發育草魚。

用Popgene(Version 1.32)軟體計算草魚3個群體間的Nei’s相似性和遺傳距離，結果如表5所示。雌核發育草魚，草魴雜交後代和草魚對照群體的遺傳相似性分別為0.7579，0.7501；雌核發育草魚和草魴雜交後代的遺傳相似性為0.8006。

表3草魚17個微衛星座位上遺傳多樣性參數

表4-1草魚雌核發育後代不同群體的遺傳多樣性參數

注A：雌核發育草魚，B：草魴雜交後代，C：草魚對照群體

表4-2草魚雌核發育後代不同群體的遺傳多樣性參數

注A：雌核發育草魚，B：草魴雜交後代，C：草魚對照群體

表5草魚雌核發育後代不同群體的Nei’s遺傳相似性(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)

註：A群體：雌核發育草魚，B群體：草魴雜交後代，C群體：草魚對照群體

2.4草魚雌核發育後代不同群體的微衛星鑑別

根據3個草魚群體在14個SSR位點上的擴增結果構建草魚雌核發育不同群體的DNA指紋模式圖(圖3)。9個特異的SSR標記(EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426和EST3643)可用於草魚雌核發育後代不同群體的區分。其中EST1573、EST0222、HLJC20和EST0426可在草魴雜交後代中擴增出獨有的條帶(圖4)。相比雌核發育草魚，EST0222、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363和EST3643可在草魚對照群體中擴增出獨有的條帶(圖3)。

3討論

3.1草魚雌核發育後代不同群體的遺傳多樣性分析

從各個遺傳參數來講，等位基因的數目(Na)、遺傳純合度(He)和多態性信息含量(PIC)等可從多個角度反映群體的遺傳多樣性和遺傳潛力【楊弘,李大宇,曹祥,等.微衛星標記分析羅非魚群體的遺傳潛力.遺傳,2011,33(7):768-775.】。本研究獲得草魚對照群體、草魴雜交後代、減數雌核發育後代的等位基因數依次為50、40、39；遺傳純合度依次為0.3498、0.4427、0.6225，經過人工誘導雌核發育方法，草魚群體的等位基因數明顯減少，遺傳純合度得到顯著提高。並且，通常認為PIC＞0.5為高度多態，0.25＜PIC＜0.5為中度多態，PIC＜0.25為低度多態【Botstein D,White R L,Skolnick M,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].AmericanJournal ofHuman Genetics,1980,32(3):314-331】。本研究草魚對照群體的PIC＝0.5738為高度多態，而雌核發育草魚群體的PIC＝0.3791，為中度多態，這與我們採用多條草魚F2代母本有關。全迎春【全迎春,韓林強,白俊傑,等.雌核發育草魚的遺傳結構分析和微衛星鑑別方法的建立.水產學報,2014,38(11):1-7】以微衛星方法鑑別得出普通草魚和雌核發育草魚多態信息含量分別是0.5528、0.3571，這與我們的結果基本相一致。

從遺傳距離角度來講，雌核發育草魚群體與高體型子代群體、草魚對照群體的遺傳距離分別為0.2224、0.2772，這表明雌核發育草魚群體與高體型子代群體的親緣關係較近，而與草魚對照群體的親緣關係稍遠，出現此結果的原因可能是選用微衛星標記的多態性對遺傳多樣性的影響，李歐等人【李鷗,趙瑩瑩,孫效文,等.草魚種群SSR分析中樣本量及標記數量對遺傳多度的影響.動物學研究,2009,30(2):121-130】研究表明樣本量、微衛星標記的數量和多態性水平對群體遺傳多樣性均有較大的影響，其次是不同的草魚微衛星標記在團頭魴(與草魚不同亞科)中適用性低對遺傳多樣性的影響，目前已有不少研究證實微衛星標記在親緣關係較近的物種間適用性較高，Chen等【Chen WM,Cheng Q.Development of thirty-five novel polymorphic microsatellite markers in Pseudosciaena polyactis(Perciformes:Sciaenidae)and cross-species amplification in closely related species,Pseudosciaena crocea[J].Biochemical Systematics and Ecology,2013,47:111-115】在小黃魚中開發的35對微衛星引物適用於近緣種大黃魚，具有很好的通用性。但草魚和團頭魴的親緣關係較遠，針對微衛星標記在兩者間的適用性的研究較少。本研究14個草魚SSR標記，只有4個標記(EST1573、EST0222、HLJC20、EST0426)在團頭魴中擴增出異於草魚的等位基因。

3.2對高體型子代群體的分析

對於高體型子代群體，其在雌核發育草魚群體所佔的數量比例非常的少，其外部形態特徵除了背高，還具有體型偏窄，側線鱗增多等特徵，以上特徵明顯趨近父本團頭魴，推測可能在紫外線滅活團頭魴精子時少部分精子並未完全失活，從而產生了草魴雜交後代。鄒桂偉【鄒桂偉,潘光碧,汪登強,等.人工雌核發育鰱的遺傳多樣性及異源遺傳物質整入的RAPD分析.水生生物學報,2004,28(2):180-185】在人工雌核發育鰱的遺傳多樣性及異源遺傳物質整入的RAPD分析中，證明了父本的遺傳物質可整合到了雌核發育子代個體中。

由表2可知，雌核發育草魚群體和草魚對照群體的相對DNA含量比值為1：0.987。趙如榕【趙如榕,肖亞梅,劉筠,等.雌核發育草魚及親本倍性研究.生命科學研究,2008,12(2):100-103】在雌核發育草魚及親本倍性研究中的結果是雌核發育草魚和普通草魚的相對DNA含量的比值為1：0.997。高體型子代的相對DNA含量的平均值為25.38，而草魚對照群體和父本團頭魴的相對DNA含量分別為23.01、28.21，其DNA含量處於草魚和團頭魴之間，因此進一步證明高體型子代群體是草魚和團頭魴雜交的後代。

本研究中高體型子代群體在EST1573、EST0222、HLJC20和EST0426位點上均擴增出特有的條帶，其大小分別為260.3bp、155.7bp、193.5bp、280.6bp，草魚對照群體均沒有相應的條帶，而父本團頭魴均出現相應的條帶。張新輝【張新輝,夏新民,王衛民,等.團頭魴雌核發育後代的微衛星標記分析.華中農業大學學報,2012,31(2):737-743】在團頭魴雌核發育後代的研究中，表明微衛星分子標記是一種對雌核發育遺傳物質的來源檢測的有效手段。進一步推測高體型子代群體應是草魚和團頭魴雜交的後代。

3.3草魚群體DNA指紋圖譜

本研究利用14個SSR標記，構建了3個草魚群體的DNA指紋資料庫，並根據其等位基因片段大小製成了微衛星DNA指紋模式圖譜，為了確保實驗結果的準確性，選取每個特異性片段都與其他片段相差10bp以上，因此找出用於區分各個種群的9對特異性微衛星標記，此方法可以簡單、快速、有效的進行雌核發育後代不同體型草魚群體鑑定。同時可推廣到相似的高度近交群體間的分析鑑定。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。