對甘氨酸轉運子具有抑制活性的新化合物的製作方法
2023-06-05 18:44:41 2
專利名稱：對甘氨酸轉運子具有抑制活性的新化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及對哺乳動物神經膠質細胞內甘氨酸轉運子具有抑制活性的由微生物產生的新型化合物。
背景技術：
近年來，研究證明神經分裂症患者腦內的穀氨酸受體數量明顯增加。穀氨酸受體的激活需要存在於腦脊髓間隙中的甘氨酸與穀氨酸受體結合，而甘氨酸的數量由存在於神經膠質細胞中的甘氨酸轉運子所調節，因此，甘氨酸轉運子抑制劑可增加腦脊髓間隙中甘氨酸的數量，從而作為能夠活化穀氨酸受體的神經分裂症治療藥物使用。
目前尚未發現與本發明化合物結構類似，且對甘氨酸轉運子具有抑制活性的化合物。
發明內容
本發明的目的是提供一類對神經膠質細胞甘氨酸轉運酶具有抑制活性的新型生理活性物質。
發明人進行各種研究，結果發現某些物質對神經膠質細胞的甘氨酸轉運子具有優異的抑制活性，從而完成了本發明。
即，本發明是以式1表示的化合物
式中，R1、R2及R3分別為氫原子或甲基，R4為氫原子、羥基或甲氧基，R5為氫原子或甲基，具體的化合物的結構如下
發明人為了完成前述目的，從土壤及植物中分離出多種菌株，並對這些菌株的代謝產物進行了各種研究，結果發現有的菌株產生的化合物對大鼠神經膠質細胞的甘氨酸攝取具有強烈的抑制活性，從而完成了本發明。
該菌株的細菌學性狀列述如下。
產生WSS2217、WSS2218、WSS2219、WSS2220、WSS2221及WSS2222的菌株是發明人等從自然界分離獲得的放線菌，下面分述其細菌學性狀。
1.性狀由分支狀基生菌絲上形成的氣生菌絲。氣生菌絲上生成鉤狀、彎狀或螺旋狀(1～3圈)的由4～15個孢子組成的短小孢子鏈。孢子的大小為1.0～1.3×1.4～2.0μm、其形狀為卵形、表面有皺紋。未發現菌簇、孢子囊和類孢子囊的形成以及遊動的孢子。
2.培養基的性質在各種培養基內，30℃培養3周時，肉眼觀察的結果列於表1。
表1
3.生理學性質1)生長溫度範圍a.生長溫度16～39℃b.最佳生長溫度32～34℃2)各種性質明膠的液化(30℃、2周)陰性脫脂牛奶的凝固(37℃、2周)陰性脫脂牛奶的腖化(30℃、2周)陰性產生黑色素樣色素(30℃、2周)陰性澱粉水解(30℃、2周)陰性3)碳源的利用(瓊脂培養基30℃、2周)L-阿拉伯糖弱；L-鼠李糖弱；D-木糖+；蜜山糖+；D-葡萄糖+；肌醇+；D-果糖+；D-甘露糖+；蔗糖+4.化學分類學的性質1)二氨基庚二酸是否存在及光學異構型檢測出內消旋型的二氨基庚二酸。
2)甲基萘醌的組成MK-9(H2)、MK-9(H4)作為主要成分被檢出。
3)菌體還原糖的種類檢測出核糖甘露糖及葡萄糖。
4)磷脂檢出含有未知氨基葡萄糖的磷脂，未檢出磷脂醯甘油。
以上性狀都是按照放線菌的分離和鑑定方法(日本放線菌學會編2001年)進行檢索的，結果表明，本菌株可以歸類於Nonomuraea菌屬放線菌，所以被命名為Nonomuraea sp.AT-0426。
本菌株已由國家藥品監督管理局四川抗菌素工業研究所於2002年8月28日申請中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心用於專利程序的微生物保存，保藏編號為CGMCC No.0792。
根據產生一般發酵產物的情形，WS2217～WSS2222的產生應在含有各種營養物質的培養基中，於好氣性條件下，培養TF-菌株。
主要使用液體培養基，培養基由碳源、氮源及無機鹽構成，根據需要可以加入維生素、前體物質及消沫劑，pH調節至7.0，碳源如葡萄糖、甘油和澱粉等可單獨或混合使用；氮源如肉湯、麥片粥、酵母汁、大豆粉、腖、尿素及銨鹽等可單獨或混合使用；無機鹽如磷酸鈉、硫酸鎂、氯化納和碳酸鉀等可單獨或混合使用；消沫劑可以使用含羥基和矽化合物。
培養方法使用振動培養、通風攪拌培養等好氣性培養，pH＝4～10，溫度25～35℃，時間2～5天，最好是pH＝6～7，溫度25～28℃，培養4天。
本發明的化合物可以用常規方法從發酵產物中精製得到。即，培養結束後，採用離心分離或過濾得到培養濾液，使之吸附於HP-20(商品名，三菱化學公司製造)等聚乙烯樹脂，用低級醇及丙酮等有機溶劑洗脫。菌體用低級醇和丙酮等有機溶劑提取。隨後，將菌體的提取液及吸附樹脂的洗脫液合併，減壓濃縮，除去有機溶劑，將殘留物用醋酸乙酯、氯仿及正丁醇等非水溶性有機溶劑中萃取，將有機相濃縮成糊狀。將該糊狀物再次溶解於苯、醋酸乙酯、丙酮、甲醇及氯仿等有機溶劑中。由矽膠層析柱、凝膠過濾層析柱及反相ODS填充柱進行柱層析及高效液相層析完成對本發明化合物的精製和分離。
WSS8027可以用如下記述的方法合成。即，查奈爾·奧布·吉，美國化學會志[J.Am.Chem.Soc.第97卷3802頁(1975)]所收載的方法，將WSS2219用碘甲烷處理進行合成。
通過對經上述方法所得物質WSS2217～WSS2222及WSS8027的紫外吸收光譜1H-NMR、13C-NMR核磁共振譜等進行解析，確證其化學結構。
WSS2217理化性質如下1、外觀白色粉末；2、分子量474；3、分子式C25H38N4O5；4、HR-TOF質譜儀；實測值497.2736；理論值497.2740(根據C25H38N4O5Na進行計算)；5、比旋度[α]D25-169.4(c0.062，二噁烷)；6、紫外吸收光譜λMAXnm(loge)二噁烷206.5(4.27)，223.5(sh，3.58)；7、1H-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以500MHz進行測定，其結果示於圖1。
8、13C-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以125MHz進行測定，其結果示於圖2。
9、溶解度溶於二氧六環、硫酸二甲酯、二甲基甲醯胺，難溶於氯仿，不溶於水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸鹼度中性WSS2218理化性質如下
1、外觀白色粉末2、分子量4863、分子式C27H42N4O44、HR-TOF質譜儀實測值509.3099；理論值509.3104(根據C27H38N4O4Na進行計算)5、比旋度[α]D25-46.2(c0.081，二噁烷)6、紫外吸收光譜λMAXnm(loge)二噁烷206.0(4.26)，223.5(sh，3.58)7、1H-NMR核磁共振譜氘代甲醇中以500MHz進行測定，其結果示於圖1。
8、13C-NMR核磁共振譜氘代甲醇中以125MHz進行測定，其結果示於圖2。
9、溶解度溶於二氧六環、硫酸二甲酯、二甲基甲醯胺，難溶於氯仿和甲醇，不溶於水、己烷、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸鹼度中性WSS2219理化性質如下1、外觀白色粉末2、分子量5023、分子式C27H42N4O54、HR-TOF質譜儀實測值525.3044；理論值525.3053(根據C27H42N4O5Na進行計算)5、比旋度[α]D25-182.6(c0.068，二噁烷)6、紫外吸收光譜λMAXnm(loge)二噁烷206.5(4.26)，223.0(sh，3.58)7、1H-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以500MHz進行測定，其結果示於圖1。
8、13C-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以125MHz進行測定，其結果示於圖2。
9、溶解度溶於二氧六環、硫酸二甲酯、二甲基甲醯胺，難溶於氯仿，不溶於水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸鹼度中性WSS2220理化性質如下1、外觀白色粉末2、分子量5793、分子式C27H39N4O8S4、HR-TOF質譜儀實測值625.2023；理論值625.2284(根據C27H39N4O8SNa2進行計算)5、比旋度[α]D25-190.8(c0.104，二噁烷)6、紫外吸收光譜λMAXnm(loge)二噁烷207.5(4.25)，223.5(sh，3.58)7、1H-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以500MHz進行測定，其結果示於圖1。
8、13C-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以125MHz進行測定，其結果示於圖2。
9、溶解度溶於二氧六環、硫酸二甲酯、二甲基甲醯胺，難溶於氯仿，不溶於水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸鹼度中性WSS2221理化性質如下1、外觀白色粉末2、分子量4883、分子式C26H40N4O5
4、HR-TOF質譜儀實測值511.6034；理論值511.6155(根據C27H38N4O5Na進行計算)5、比旋度[α]D25-182.6(c0.068，二噁烷)6、紫外吸收光譜λMAXnm(loge)二噁烷206.5(4.26)，223.0(sh，3.58)7、1H-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以500MHz進行測定，其結果示於圖9。
8、13C-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以125MHz進行測定，其結果示於圖10。
9、溶解度溶於二氧六環、硫酸二甲酯、二甲基甲醯胺，難溶於氯仿，不溶於水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸鹼度中性WSS2222理化性質如下1、外觀白色粉末2、分子量4883、分子式C26H40N4O54、HR-TOF質譜儀實測值511.6048；理論值511.6155(根據C25H38N4O5Na進行計算)5、比旋度[α]D25-182.6(c0.068，二噁烷)6、紫外吸收光譜λMAXnm(loge)二噁烷206.5(4.26)，223.0(sh，3.57)7、1H-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以500MHz進行測定，其結果示於圖11。
8、13C-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以125MHz進行測定，其結果示於圖12。
9、溶解度
溶於二氧六環、硫酸二甲酯、二甲基甲醯胺，難溶於氯仿，不溶於水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸鹼度中性WSS8027理化性質如下1、外觀白色粉末2、分子量5583、分子式C31H50N4O54、HR-TOF質譜儀實測值581.7433；理論值581.7496(根據C31H50N4O5Na進行計算)5、比旋度[α]D25-160.4(c0.04，二噁烷)6、紫外吸收光譜λMAXnm(loge)二噁烷206.5(4.26)，223.0(sh，3.58)7、1H-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以500MHz進行測定，其結果示於圖13。
8、13C-NMR核磁共振譜氘代硫酸二甲酯中以125MHz進行測定，其結果示於圖14。
9、溶解度溶於二氧六環、硫酸二甲酯、二甲基甲醯胺，難溶於氯仿，不溶於水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸鹼度中性本發明化合物對在神經膠質細胞中發現的甘氨酸轉氨酶具有抑制作用。所以，對精神分裂症的治療有用。
圖1表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz測定的WSS2217的1H-NMR譜圖2表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz測定的WSS2217的13C-NMR譜圖3表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz測定的WSS2218的1H-NMR譜圖4表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz測定的WSS2218的13C-NMR譜圖5表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz測定的WSS2219的1H-NMR譜圖6表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz測定的WSS2219的13C-NMR譜圖7表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz測定的WSS2220的1H-NMR譜圖8表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz測定的WSS2220的13C-NMR譜圖9表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz測定的WSS2221的1H-NMR譜圖10表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz測定的WSS2221的13C-NMR譜圖11表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz測定的WSS2222的1H-NMR譜圖12表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz測定的WSS2222的13C-NMR譜圖13表示在氘代吡啶中以500MHz測定的WSS8027的1H-NMR譜圖14表示在氘代吡啶中以125MHz測定的WSS8027的13C-NMR譜具體實施方式
以下列舉實施例及實驗例對本專利的具體說明。
實施例1 WSS2217、WSS2218、WSS2219及WS2220的製備。
1、將含有2.5％的可溶性澱粉、1％葡萄糖、0.5％魚粉、0.3％棉籽粉、0.3％NZ CASE、0.2％酵母汁、0.2％碳酸鈣的液體培養基置於三角瓶中，於121℃、滅菌20分鐘。然後，在該無菌培養基上接種Nonomuraea sp.TA-0426菌株，於28℃、200rpm振搖培養三天，作為種子培養液。
接著，將由2％玉米粉、1.0％的甘油、0.5％葡萄糖、0.5％棉籽粉、0.5％麥芽汁、0.3％多腖、0.05％硫酸鎂及0.3％的碳酸鈣組成的100ml無菌液體培養基裝入500ml的三角瓶內。將前述種子培養液4ml加入其中，製備100瓶，28℃、180rpm搖振培養14天。
培養結束後，將所得培養液10L加入5L正丁醇，攪拌、離心分離，減壓濃縮正丁醇組分得到褐色油狀物質6.03克。
2、將前述褐色油狀物質6.03克溶於10ml氯仿，上矽膠柱[SilicaGel60(Merck公司製造)200ml層析柱f＝40mm]吸附。用400ml氯仿洗脫，以氯仿—甲醇(98∶2～50∶50)的混合溶劑進行梯度洗脫後，將其中氯仿—甲醇(95∶5)的組分合併，減壓濃縮至幹，得到272.8mg的餾分1。將氯仿—甲醇(90∶10)的組分合併，減壓濃縮至幹，得到172.5mg的餾分2。再將氯仿—甲醇(80∶20)的組分合併，減壓濃縮至幹，得到398.0mg的餾分3。
3、將前項餾分1溶於少量的甲醇中，用乙腈-0.02％的三氟醋酸水溶液(65∶35)作為流動相進行高效液相色譜分離[儀器]瓦特公司制，層析柱瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ10×250mm)]，於210nm檢測，流速2.5ml/min，收集保留時間為13～16分鐘的餾分。減壓濃縮該餾分，除去乙腈後，用等體積的乙酸乙酯分2次抽提。合併有機相，用無水硫酸納脫水後，減壓濃縮至幹，得到15.2mg的WSS2218。
4、將前項餾分2溶於少量的甲醇中，用乙腈-0.01％的三氟醋酸水溶液(45∶65)作為流動相進行高效液相色譜分離[儀器瓦特公司制，層析柱瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ10×250mm)]，於210nm檢測，流速2.5ml/min，收集保留時間9.5～10分和15～16分鐘的餾分。分別合併分離的兩個組分，減壓濃縮，除去乙腈後，用等體積的乙酸乙酯分2次抽提。合併有機相，用無水硫酸納脫水後，減壓濃縮至幹，得到3.5mg的WSS2217及13.4mg的WSS2219。
5、將前項餾分3溶於少量的甲醇中，將30％的乙腈作為流動相進行高效液相色譜分離[儀器瓦特公司制，層析柱瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ10×250mm)]，於210nm檢測，流速10ml/min，收集保留時間8.0～9.0分的餾分。將分離餾分減壓濃縮至幹，得到8.8mg的WSS2220。
實施例2 WSS2221及WSS2222的製備1、將含有2.5％的可溶性澱粉、1％葡萄糖、0.5％魚粉、0.3％棉籽粉、0.3％NZ CASE、0.2％酵母汁及0.2％碳酸鈣的液體培養基60ml加入三角瓶中，121℃、滅菌20分鐘。然後，在該無菌培養基上接種Nonomuraea sp.TA-0426菌株，於28℃、200rpm振搖培養三天，作為種子培養液。
接著，將由2％玉米粉、1.0％的甘油、0.5％葡萄糖、0.5％棉籽粉、0.5％麥芽汁、0.3％多腖、0.05％硫酸鎂及0.3％的碳酸鈣組成的無菌液體培養基100ml裝入500ml的三角瓶內。將前述種子培養液4ml加入其中，製備150瓶，28℃、180rpm振搖培養14天。
培養結束後，將所得培養液15L加入5L正丁醇，攪拌、離心分離，將正丁醇組分減壓濃縮，加入用醋酸調pH3.0的水500ml，攪拌，用500ml醋酸乙酯提取兩次。將該醋酸乙酯提取組分合併，減壓濃縮，得褐色油狀物質2.83g。
2、前項油狀物質2.83克溶於10ml氯仿，上矽膠柱[SilicaGel60(Merck公司製造)200ml層析柱f＝40mm]吸附。用400ml氯仿洗脫，以氯仿—甲醇(99∶1～50∶50)進行梯度洗脫。將其中以氯仿-甲醇(90∶10)的組分與(80∶20)的組分合併，減壓濃縮至幹，得褐色油狀物質864mg。
3、將前項褐色物質864mg溶於少量的甲醇中，用乙腈-0.01％的三氟醋酸水溶液(45∶55)作為流動相進行高效液相色譜分離[儀器瓦特公司制，層析柱瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ20×250mm)]，於210nm檢測，流速10ml/min，分別收集合併保留時間12～12.5分和13～14分鐘的餾分。分別減壓濃縮至幹，即得5mg的WSS2221及3.7mg的WSS2222。
實施例3 WSS8027的製備在氮氣流下，向氫氧化納(100.6mg)中加入1ml二甲基甲醯胺，冷卻、攪拌。向其中加入溶有WSS2219(12.9mg)的二甲基甲醯胺1ml，再加入碘甲烷(300ml)，室溫下攪拌1小時。反應結束後，冰浴冷卻下加入水和醋酸乙酯，減壓濃縮醋酸乙酯層。濃縮物用高效液相色譜[流動相乙腈-0.02％三氟醋酸水溶液(80∶20)、裝置瓦特公司，層析柱瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ10×150mm)]系統分離，在210nm處檢測，流速為2.5ml/min。將分離的組分減壓濃縮至幹，即得4.4mg的WSS8027。
實驗例1對大鼠神經膠質細胞甘氨酸轉運酶的抑制實驗檢體將WSS2217、WSS2218、WSS2219、WSS2220、WSS2221、WSS2222及WSS8027分別溶解於二甲基亞碸並配製成10mg/ml的濃度，用滅菌水稀釋成所需濃度待用。
試驗細胞大鼠神經膠質細胞C6。
試驗方法在含有液體閃爍液的平底96孔平板(Cytostar-T阿馬西公司制)，以5×104細胞/皿接種C6細胞於含有10％小牛血清(義布柯公司制)的培養基中，置於5％CO2培養箱中於37℃培養24小時。然後，將用由10mM磷酸緩衝液比比斯(pH7.4)、150mM氯化納、1mM氯化鈣、1mM氯化納、1mM氯化鎂及10mM葡萄糖組成的緩衝劑置換培養基。加入濃度藥品溶液0.01ml及375K Bq/ml的[14C]甘氨酸0.01ml，於30℃培養50分鐘。培養後，棄去緩衝液，室溫下乾燥5小時。然後用(TopCount；巴卡公司制)測定其放射活性。將對照組的放射活性作為0％，添加過量甘氨酸(10mM)的試驗組作為100％，以下式計算各組的抑制率。
抑制率(％)＝[(藥物試驗組的數據-過量甘氨酸試驗組的數據)/(未添加藥物試驗組的數據-過量甘氨酸試驗組的數據)]×100以引起顯示50％抑制率的化合物濃度作為IC50(μM)，各化合物及甘氨酸的IC50列於表2。同時求出Glycine的抑制率。
表2
權利要求
1.一種如式I所示的對甘氨酸轉運子具有抑制活性的新化合物， 式中，R1、R2、及R3分別為氫原子或甲基，R4為氫原子、羥基或甲氧基，R5為氫原子或甲基。
2.一種如式II所示的對甘氨酸轉運子具有抑制活性的新化合物
3.根據權利要求1和2所述新化合物；遴選出的醫藥品。
4.根據權利要求1和2所述新化合物；作為有效成分的甘氨酸轉運子的抑制劑。
全文摘要
本發明公開了甘氨酸結合穀氨醯氨酸受體，可使受體活化；存在於突觸神經間隙中的甘氨酸數量由在神經膠質細胞中發現的甘氨酸轉氨酶進行調節，所以，甘氨酸轉氨酶的抑制劑可以增大突觸神經間隙的甘氨酸，可以作為活化穀氨醯氨酸受體的精神分裂症治療藥物使用；本發明還公開了微生物發酵產生的對甘氨酸細胞的甘氨酸轉氨酶具有抑制活性的新型的具有生理活性的物質。
文檔編號C07K5/12GK1535980SQ0311764
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月8日 優先權日2003年4月8日
發明者褚以文, 李俊英, 戶田喜久, 照井佑一, 福永拓哉, 一, 久, 哉 申請人:國家藥品監督管理局四川抗菌素工業研究所, 大正製藥株式會社, 國家藥品監督管理局四川抗菌素工業研