發酵方法

2023-06-04 23:10:01

專利名稱：：發酵方法發酵方法發明領域本發明涉及用於從含澱粉材料中產生發酵產物的方法，其包括產生乙醇的方法。發明背景發酵方法用於製造大量的商業產品，包括醇(例如，乙醇、曱醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有才幾酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸酯(gluconate)、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；S同(例如，丙酮)；胺基酸(例如，穀氨酸)；氣體(例如，H2和CO。，和更複雜的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青黴素和四環素)；酶；維生素(例如，核黃素、B12、P-胡蘿蔔素)；激素，和難以通過合成生產的其它化合物。發酵方法通常還用於乳製品(例如，產生酸奶酪和乾酪)、皮革和菸草工業中。工業上，發酵產物在能夠儲存多達IO立方米發酵培養基的大型發酵罐中產生。為了在發酵罐中建立合適的發酵生物群和濃度，發酵方法通常需要48-120小時的處理時間或者更多。因為罐的尺寸較大，而且發酵時間很長，所以很難保持發酵系統不受汙染。有害的汙染細菌常常是來自乳桿菌屬的革蘭氏陽性細菌，其將葡萄糖轉化為乳酸和乙酸。已經知道革蘭氏陰性細菌也會汙染髮酵方法。不幸的是，發酵條件通常是利於細菌生長的。如果發生細菌汙染，必須將整個發酵罐倒空，清潔和滅菌，發酵培養基不可使用。這當然是耗費時間和金錢的。此外，很多細菌與發酵生物體竟爭使用糖。這導致發酵產量下降。Bayrock等，2003,Appln.Microbiol.Biotechnol.62:498-502公開了通過持續或脈沖加入青黴素G，在連續燃料乙醇發酵中控制乳桿菌屬汙染。今天，抗生素、熱和化學消毒劑用於殺死有害細菌和/或抑制有害細菌的生長。在發酵前或過程中向發酵中加入這些消毒劑。已知的抗菌劑，包括抗生素(如青黴素)有時是不期望的。因此，需要更多的方法在發酵過程中殺死有害的細菌和/或抑制有害細菌的生長。發明概述本發明的目的是提供發酵方法，或者包括發酵步驟的方法，其中將有害細菌殺死和/或抑制有害細菌的生長。在第一方面，本發明提供使用發酵生物體從含澱粉材料中產生發酵產物的方法，其中在發酵前和/或發酵過程中加入一種或多種抗菌劑。在第二方面，本發明涉及從含澱粉材料中產生發酵產物的方法，其包括如下步驟(a)液化含澱粉材料；(b)使用糖-源產生酶(carbohydratesourcegeneratingenzyme)糖化；(c)使用發酵生物體發酵，其中在發酵前和/或發酵過程中加入一種或多種抗菌劑。在第三方面，本發明涉及從含澱粉材料產生發酵產物的方法，其包括(a)在低於所述含澱粉材料的起始膠凝溫度(initialgelatinizationtemperature)的溫度糖化含澱粉材料，(b)使用發酵生物體發酵，其中在發酵前和/或發酵過程中加入一種或多種抗菌劑。最後，本發明還涉及用於殺死細菌和/或抑制細菌生長的抗菌劑在發酵產物生產方法中的用途。定義術語"抗菌活性"指能殺死細菌和/或抑制細菌生長的活性。"抗菌肽，，是能殺死細菌和/或抑制細菌生長的肽。用相似的方式，"抗菌多肽"和"抗菌酶"分別是能殺死細菌和/或抑制細菌生長的多肽和酶。在本發明的上下文中，術語"抑制微生物細菌的生長"特別表示非生長狀態的細菌，即，它們不能繁殖。可以理解的是，"抗菌肽"或其類似物也能殺死其它微生物細胞和/或抑制其它微生物細胞的生長，如某些真菌細胞。當用於本文時，胺基酸序列、肽、多肽、酶等的"片段"表示子序列，其中從氨基和/或歡基末端缺失一個或多個胺基酸。優選從羧基末端缺失一個或多個胺基酸。片段還應該具有抗菌活性。本發明的方法中使用的抗菌肽、多肽、蛋白質、酶等可以是包含胺基酸序列，優選由胺基酸序列組成的"變體"，所述胺基酸序列與親代/野生胺基酸序列相比具有胺基酸的至少一個取代、缺失和/或插入。這種變體可以用本領域已知的任何技術構建，如通過定點/隨機突變和結構域重排技術。在一個實施方案中，胺基酸改變(在變體中以及在親代/野生序列中)對性質是不重要的，如保守胺基酸取代，其不顯著影響分子的摺疊和/或活性。通過參數"同一性"描述兩個胺基酸序列之間或兩個核普酸序列之間的術語"同源性"。兩個胺基酸序列之間的"同一性"程度使用FASTA軟體包2.0x版中包括的程序FASTA確定(參見W.R.PearsonandD.J.Lipman(1988),"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448;andW.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA"，MethodsinEnzymology183:63-98)。使用的評分矩陣是BLOSUM50，缺口罰分是-12,而缺口延伸罰分是-2。使用如上所述的同樣的算法和軟體包確定兩個核苷酸序列之間的同一性程度。使用的評分矩陣是同一性矩陣，缺口罰分是-16,而缺口延伸罰分是-4。術語"有害細菌(unwantedbacteria)"在本發明的上下文中表示不期望的細菌，它們可能以消極的方式影響發酵產物的生產，例如，通過將發酵生物體的底物轉化成不期望的發酵產物。在例如醇生產包括乙醇生產中有害的汙染細菌的實例是乳桿菌，其將葡萄糖轉化成乳酸和乙酸。附圖筒述圖1表示在抗菌肽A的不同濃度，四種乳桿菌屬菌林的混合物24小時的生長。圖2表示在抗菌肽B的不同濃度，四種乳桿菌屬菌林的混合物24小時的生長。圖3表示在SSF方法0、24、48和72小時後乳桿菌屬的總量。圖4表示在48小時0-1000mg溶菌酶/L發酵培養勤於乳桿菌的抗菌效果。發明詳述本發明的目的是提供發酵方法或包括發酵步驟的方法，其中殺死有害細菌和/或抑制有害細菌的生長。有害細菌本身和它們的代謝終產物，如乳酸和/或乙酸，導致發酵產量降低，使生產者遭受相當大的經濟損失(參見Thomas等，2001,J.AppliedMicrobiology,90:819-828)。有害細菌與發酵生物體(例如酵母)竟爭發酵培養基中的糖(碳源)。由有害細菌產生的乳酸和/或乙酸還可能對酵母生長具有負面影響。本發明的發明人發現，抗菌劑可以具有優勢地用於殺死有害細菌和/或抑制有害細菌的生長，有害細菌已知會汙染髮酵過程。本發明的方法可以用作下述方法的替代方法，例如，向發酵方法加入抗生素，如特別是青黴素，其可能由於種種原因不期望使用。本發明的方法可能導致與不加入抗菌劑的相應方法獲得的產量相比，發酵產量提高。根據本發明，特別是由乳酸和/或乙酸產生細菌引起的細菌汙染可以避免和/或降低。已知乳酸和/或乙酸產生菌，特別是乳桿菌屬的細菌，會汙染髮酵過程。已經發現會汙染髮酵過程的乳桿菌屬菌種實例包括丘狀菌落乳桿菌(丄acto6"ci!.〃w51co〃/wo/(iay)、-豆孝L4幹菌(丄actoZ)a"7/wsZ)屍ev&)、發酵豸L^幹菌(丄acto6ac/〃ws/^777ewfMm)、類乾酪孝L才幹菌(丄afctoZwc/〃wj/arafcose/)、才直物吝'L^亍菌(丄acto6acZ〃ws//a"tar畫),和/或鼠李糖乳軒菌(Zacto6acz.〃wsr/zamwosm),或它們的混合物。本發明的方法在第一方面，本發明涉及使用發酵生物體從含澱粉材料產生發酵產物的方法，其中在發酵前和/或發酵過程中加入一種或多種抗菌劑。本發明的發酵方法包括，不限於，用於產生發酵產物的發酵方法，發酵產物包括醇(例如，乙醇、曱醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有機酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸酯、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；胺基酸(例如，穀氨酸)；氣體(例如，H2和C02),和更複雜的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青黴素和四環素)；酶；維生素(例如，核黃素、B12、(3-胡蘿蔔素)；激素，和其它化合物。發酵方法還包括乳品工業(例如，發酵的乳製品)、皮革工業和菸草工業中使用的發酵方法。優選的發酵方法包括醇發酵方法，其在本領域中眾所周知。優選的發酵方法是厭氧發酵方法。在實施方案中，本發明的發酵方法是進一步包含液化步驟和/或糖化步驟的方法的一部分。在優選實施方案中，發酵方法是同步糖化和發酵方法(SSF方法)，或者未蒸煮的(uncooked)含澱粉材料的一步發酵方法(有時稱為同步液化、糖化和發酵(LSF))中的步驟。一步方法的實例包括美國專利號4,316,956、US2004/0234649和WO2003/066816和WO2003.066826中公開的方法(所述文件全部通過引用併入本文)。在一個實施方案中，本發明的發酵方法可以在20-40。C,優選30-35。C,特別是約32。C的溫度進行。當產生醇發酵產物，如乙醇，特別是燃料乙醇、可飲用乙醇和/或工業乙醇時通常為這種情況。在優選實施方案中，發酵方法中的pH可為4-7,優選5-6。在一個實施方案中，在液化和/或糖化過程中(即，發酵前)或在同步糖化發酵(SSF)過程中加入抗菌劑。在另一個實施方案中，向回流(backset)和/或通常循環至液化和/或發酵步驟的稀釜餾物(thinstillage)中加入抗菌劑。發酵方法通常以批式發酵進行，即，發酵由始至終在一個罐中進行，或者以連續發酵進行，即，不中斷操作的穩態發酵系統，其中每階段發酵都在發酵系統的單獨部分進行，設定流速使其與需要的保留時間相對應。換句話說，包含本發明的發酵方法的過程中的各個方法步驟可以以批式或連續的方式進行。根據本發明，預期全部方法步驟都以批式進行，或者全部方法步驟都連續進行，或者其中一個或多個方法步驟以批式進行，而一個或多個方法步驟連續進行。串聯方法是這樣的實例，其中一個或多個方法步驟連續進行，如同本發明所預期的。要獲取更多關於串聯方法和其它特別的乙醇方法的資料,可以參考"TheAlcoholTextbook",Ethanolproductionbyfermentationanddistillation.Eds,T.P.Lyons,D.R.KesallandJ.E.Murtagh.NottinghamUniversityPress1995。在優選實施方案中，本發明的發酵方法是連續發酵產物產生方法的一部分。在優選實施方案中，在接種發酵生物體之前，使抗菌劑保持與發酵培養基接觸1分鐘-48小時，優選至少1小時，特別是至少24小時。本發明的方法可以進行1至250個小時，優選25至190個小時，更優選從30至180個小時，更優選從40至170個小時，甚至更優選從50至160個小時，還更優選/人60至150個小時，甚至還更優選/人70至140個小時，和最優選/人80至130個小時。發酵培養基"發酵培養基(fermentationmedia)，，、"發酵培養基(fermentationmedium)"或"發酵液(fermentationbroth)"指發酵進行的環境，其中包括發酵底物，即，由發酵生物體代謝的糖源。發酵培養基，包括發酵底物和本發明的發酵方法使用的其它原材料，可以通過，例如，粉碎(milling)、液化和/或糖化或其它期望的步驟，在發酵方法之前或與發酵過程同時進行處理。因此，發酵培養基可以指加入發酵生物體之前的培養基，如液化和/或糖化中的或源自液化和/或糖化的培養基，以及包含發酵生物體的培養基，如同步糖化和發酵方法(SSF)或例如未蒸煮原材料的一步發酵(LSF)中使用的培養基。發酵生物體"發酵生物體"指適用於期望發酵方法中的任何生物體。根據本發明的合適的發酵生物體能發酵，即，直接或間接地將糖(如葡萄糖或麥芽糖)轉化成期望的發酵產物。發酵生物體的實例包括真菌生物，如特別是酵母。優選酵母包括酵母屬菌種OS^cc/zarawjcMspp.)的菌抹，和具體地釀酒酵母(Sacc/zaramycascerevWae)的菌抹。商業上可得到的酵母包括，例如ETHANOLrEDtm酵母(可從Fermentis/Lesaffre，USA獲得)、FALI(可從Fleischmann，sYeast,USA獲得)、SUPERSTART和THERMOSACCtm新鮮酵母(可從EthanolTechnology,WI,USA獲得)、BIOFERMAFT和XR(可從NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA獲得)、GERTSTRAND(可/人GertStrandAB，Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。含澱粉材料任何合適的含澱粉材料(包括粒狀澱粉(granularstarch))可以用作根據本發明的底物。材料通常根據期望的發酵產物選擇。適用於本發明的方法的含澱粉材料包括塊莖、根、莖、整穀粒、玉米、穗軸、小麥、大麥、黑麥、買羅高粱、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、甜高粱、稻、豌豆(pea)、豆(bean)或甘薯，或它們的混合物，或穀類、含糖原材料，如糖蜜、水果材料、甘蔗或糖用甜菜、馬鈴薯，和含纖維素材料(如木材或植物殘餘物)或它們的混合物。預期的材料是蠟質(waxy)和非蠟質(non-waxy)型的玉米和大麥。合適的底物還包括糖源，特別是能由發酵生物體代謝的小分子糖DPw，其可以通過直接向發酵培養基添加來提供。抗菌劑本發明的方法使用的抗菌劑優選聚合物分子，如由胺基酸序列組成的聚合物分子。胺基酸序列可以是肽、多肽、蛋白質或酶等。在優選實施方案中，抗菌劑是能殺死有害細菌和/或抑制有害細菌生長的肽、多肽、蛋白質、酶等，有害細菌優選革蘭氏陽性細菌和/或革蘭氏陰性細菌，特別是乳桿菌屬的革蘭氏陽性細菌。抗菌肽、多肽、蛋白質、酶等可以是微生物來源的，如真菌或細菌來源的，^f旦是也可以合成產生的。在優選實施方案中，抗菌劑是防衛素或防衛素-樣肽。在優選實施方案中，抗菌肽是真菌防衛素，優選源自假黑盤菌(屍wwfifop/ectom'am'gre〃a)，特別是假黑盤菌CBS444.97。特別期望的是作為WO2003/044049(通過引用併入本文)的SEQIDNO:2中胺基酸l-40公開的肽，或其具有抗菌活性的片段，或其具有抗菌活性的變體，所述變體與WO2003/044049中SEQIDNO:2中的胺基酸l-40具有至少80%,優選至少90%,更優選至少95%,甚至更優選至少97%,特別是至少99%的同一性。在具體的實施方案中，抗菌劑是肽Novispirin或選自作為WO2002/00839中SEQIDNO:1-37公開的組中的Novispirin變體，特別是作為WO2002/00839(通過引用併入本文)中的SEQIDNO:17公開的G10。在優選實施方案中，抗菌肽是NovispirinG10的變體(WO2005/105831中的SEQIDNO:1)。期望的變體包括作為WO2005/105831中的SEQIDNO:2-116公開的任何變體。在另一個優選實施方案中，抗菌劑是抗菌蛋白質或酶，如溶菌酶(Lysozyme)。)容菌酶可以是任何來源，如母雞溶菌酶。加入抗菌劑的濃度足以殺死細菌細胞和/或抑制細菌細胞的生長，細菌細胞優選革蘭氏陽性細菌和/或革蘭氏陰性細菌細胞，特別是乳桿菌屬的革蘭氏陽性細菌細胞，包括短乳桿菌、丘狀菌落乳桿菌、發酵乳桿菌、類乾酪乳桿菌、植物乳桿菌，和/或鼠李糖樹桿菌，或其中一種或多種的混合物。其它預期的抗菌肽包括Heliomicin(在WO1999/053053中7>開的抗真菌作用AMP)、Eurocin(WO2006/050737);Piceasin、Oystrisin、Virgisin和Gibbosin(WO2006/053565);Marinasin(WO2006/097110)。抗菌劑的其它實例包括WO2002/090384公開的抗真菌肽。將所有文件的全文併入本文。才艮據本發明，以0.1-1000mg/L發酵培養基，優選0.5-500mg/L發酵培養基，特別是1-100mg/L發酵培養基的濃度加入抗菌劑。從膠凝的含澱粉材料產生發酵產物在這個方面，本發明涉及從含澱粉材料產生發酵產物，特別是乙醇的方法，所述方法包括液化步驟和分別/順序或同步進行的糖化和發酵步驟。因此，在這個方面，本發明涉及從含澱粉材料產生發酵產物的方法，所述方法包括步驟(a)液化含澱粉材料；(b)使用糖-源產生酶糖化；(c)使用發酵生物體發酵，其中在發酵前和/或發酵過程中加入一種或多種抗菌劑。發酵產物，如特別是乙醇，可以可選地在發酵後回收，例如，通過蒸餾回收。發酵步驟(c)可以是如本文所述的本發明的發酵方法。合適的含澱粉起始材料列於上面的"含澱粉材料"部分中。在優選實施方案中，使用a-澱粉酶進行液化步驟(a)。期望的酶和合適的濃度列於下面的"酶"部分中。發酵優選在酵母，優選酵母屬的菌抹存在時進行。合適的發酵生物體列於上面的"發酵生物體"中。合適的抗菌劑的實例列於上面的"抗菌劑"部分中。還可以在液化和/或糖化的過程中，即，在開始發酵之前加入抗菌劑。可替換地，可將抗菌劑加入回流和/或循環至例如液化和/或發酵步驟的稀釜餾物中。在優選實施方案中，在接種發酵生物體前，使抗菌劑保持與發酵培養基接觸至少1分鐘-48小時，優選至少l小時，特別是至少24小時。通過加熱至含澱粉材料的膠凝溫度以上而進行液化。在優選實施方案中，步驟(b)和(c)同時進行(SSF方法)。在具體實施方案中，在步驟(a)之前，本發明的方法還包含步驟x)減小含澱粉材料的粒度，優選通過粉碎進行；y)形成包含含澱粉材料和水的漿料。漿料可以包括水和/或工藝水(processwater),如回流和/或稀爸餾物、洗滌水、蒸發器的冷凝物或蒸餾物、蒸餾中側流汽提器(sidestripper)的水，或其它發酵產物工廠設備(plant)的工藝水。在優選實施方案中，通過幹磨或溼磨減小含澱粉材料的粒度。然而，也可以使用其它粒度減小技術，如乳化技術、旋轉脈動(rotarypulsation)。含水漿料可以包含從10-40wt%，優選25-35wt。/o含澱粉材料。將漿料加熱至膠凝溫度之上，並可以加入a-澱粉酶，優選細菌和/或酸性真菌a-澱粉酶，以開始液化(稀釋)。在實施方案中，可將漿料噴射蒸煮Get-cook)以在經過步驟(a)的a-澱粉酶處理之前使漿料進一步膠凝。然而，可以理解的是，可進行液化而無噴射蒸煮步驟。更具體地，可以以三步熱漿料方法進行液化。將漿料加熱至60-95。C,優選80-85。C，並加入a-澱粉酶以開始液化(稀釋)。然後可以在95-140。C,優選105-125。C的溫度將漿料噴射蒸煮1-15分鐘，優選3-10分鐘，特別是約5分鐘。將漿料冷卻至60-95。C，並加入更多的a-澱粉酶以完成水解(二級液化)。可以在pH4.5-6.5，特別是在5-6的pH進行液化過程。磨製和液化的整穀粒稱為醪(mash)。可以使用本領域眾所周知的條件進行糖化步驟(b)。例如，完整的糖化方法可以持續約24小時至約72小時，然而，常見的是在30-65°C,通常約60。C的溫度僅進行通常40-90分鐘的預糖化，然後是同步糖化和發酵方法(SSF方法)的發酵過程中的完全糖化。糖化通常在30-65°C,通常約60。C的溫度且在4-5的pH，通常在約pH4.5進行。在發酵產物產生方法(特別是乙醇產生中)使用最廣泛的方法是同步糖化和發酵(SSF),其中沒有糖化的保留階段(holdingstage),表示發酵生物體(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可以在20-40。C，優選30-35。C，特別是約32。C的溫度進行。SSF過程中的pH通常為4-7,優選5-6。從未膠凝的/未蒸煮的含澱粉材料中產生發酵產物特別地，在使用未蒸煮的含澱粉材料作為起始材料的一步發酵方法中加入抗菌劑是有優勢的，因為一步發酵方法在低於20-40。C的低溫進行。例如，本發明的一步乙醇發酵方法通常在約32°C,使用釀酒酵母作為發酵生物體進行。因此，在這個方面，本發明涉及從含澱粉材料產生發酵產物的方法，其包括(a)在低於所述含澱粉材料的起始膠凝溫度的溫度糖化含澱粉材料，(b)使用發酵生物體發酵，其中在發酵前和/或發酵過程中加入一種或多種抗菌劑。發酵產物，如特別是乙醇，可任選地在發酵後回收，例如通過蒸餾回收。發酵步驟(b)可以是如本文所述的本發明的發酵方法。合適的含澱粉起始材料列於上面的"含澱粉材料"部分。在優選實施方案中，含澱粉材料是粒狀澱粉。糖化步驟(a)和發酵步驟(b)可以順序或同時進行。在優選實施方案中，方法作為一步發酵方法，即同步糖化和發酵進行。期望的一步發酵方法的實例，其中與依照本發明加入一種或多種抗菌劑有關，在例如美國專利號4,316,956;WO2003/066816、WO2003/066826、WO2004/081193、WO2004/080923、WO2005/008156和WO2005/118795中描述(通過引用併入本文)。在實施方案中，使用a-澱粉酶和/或糖-源產生酶，特別是葡糖澱粉酶，將未蒸煮的含澱粉材料水解成可發酵的糖。在優選實施方案中，a-澱粉酶是酸性a-澱粉酶，優選酸性真菌a-澱粉酶。期望的酶和合適的濃度列於下面的"酶"部分中。發酵優選在酵母，優選酵母屬的菌抹存在時進行。合適的發酵生物體列於上面的"發酵生物體"部分中。合適的抗菌劑的實例列於上面的"抗菌劑"部分中。可以在開始發酵前的糖化過程中加入抗菌劑。可選地，可將抗菌劑加入循環至發酵步驟的稀釜餾物和/或回流中。在優選實施方案中，在接種發酵生物體之前，使抗菌劑保持與發酵培養基接觸至少l分鐘至48小時，優選至少1小時，特別是至少24小時。根據這個方面，進行本發明的方法而不進行含澱粉材料的膠凝。含澱粉材料保持未蒸煮。在一個實施方案中，在糖化和/或發酵過程中存在a-澱粉酶和/或糖-源產生酶，優選葡糖澱粉酶。根據本發明，可生產期望的所述發酵產物(如乙醇)而不將含澱粉材料在膠凝溫度以上液化。術語"起始膠凝溫度，，指使所述澱粉開始膠凝的最低溫度。在水中加熱的澱粉通常在50。C-70。C開始膠凝；膠凝的確切溫度依賴於特定的澱粉，可以由技術人員容易地確定。因此，起始膠凝溫度可以根據植物種類、植物種類的特定變種以及生長條件而不同。在本發明的上下文中，給出的含澱粉材料的起始膠凝溫度是使用Gorinstein.S.andLii.C，Starch/Starke，Vol.44(12)，pp.461-466(1992)所述的方法，5%的澱粉顆粒中雙折射消失的溫度。在步驟(a)前，可以製備含澱粉材料，如粒狀澱粉的漿料，其含有20-55wt%的幹固體，優選25-40wt。/。的幹固體，更優選30-35%含澱粉材料的幹固體。漿料可以包括水和/或工藝水，如回流和/或稀釜餾物、洗滌水、蒸餾器的濃縮物和蒸餾物、蒸餾中側流汽提器的水，或其它發酵產物工廠裝置的工藝水。因為本發明的這個方面的方法在膠凝溫度以下進行，因此沒有發生顯著的粘度增加，如果期望的話可以使用高濃度的釜餾物。在實施方案中，含水漿料包含約1至約70voP/。的釜餾物，優選15-60vol。/。的釜餾物，特別是約30至50vol。/。的釜餾物。可以通過如下方法製備含澱粉材料將粒度(優選通過粉碎)減至0.05至3.0mm,優選0.1-0.5mm。在進行本發明的方法後，含澱粉材料的幹固體中至少85°/。，至少86%，至少87%,至少88%，至少89%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95°/。，至少96%,至少97%，至少98%，或優選至少99%轉化成可溶澱粉水解物。進行步驟(a)的溫度為30-75。C，優選45-60。C。在優選實施方案中，步驟(a)和步驟(b)作為同步糖化和發酵方法進行。在這種優選實施方案中，方法通常在20-4(TC，優選30-35。C，特別是約32""C的溫度進行。根據本發明，可以在發酵過程中上調或下調溫度。在實施方案中，進行同步糖化和發酵，使糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，如低於6wt。/。，優選低於約3wt。/。，優選低於約2wt。/。，更優選低於約1wt%，甚至更優選低於約0.5%，或者甚至更優選0.25wt%，如低於約0.1wt%。通過筒單地使用調整量的酶和發酵生物體可以實現這樣低水平的糖。這樣低水平的糖避免了分解代謝抑制。本領域的技術人員可以容易地確定使用何種量的酶和發酵生物體。還可以選擇酶和發酵生物體的使用量以保持發酵液中的麥芽糖的低濃度。例如，可將麥芽糖水平保持低於約0.5wt。/。或低於約0.2wt。/c)。本發明的方法可以在4-7,優選在5-6的pH進行。酵a-澱粉酶根據本發明，a-澱粉酶可為任何來源。優選真菌或細菌來源的a-澱粉酶。在優選實施方案中，a-澱粉酶是酸性a-澱粉酶，例如，真菌酸性a-澱粉酶或細菌酸性a-澱粉酶。術語"酸性a-澱粉酶，，是指以有效量加入的a-澱粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在3至7，優選3.5至6，或更優選4-5的pH具有最佳活性。細菌a-澱粉酶根據本發明，細菌a-澱粉酶可以優選源自芽孢桿菌屬。在優選實施方案中，芽孢桿菌屬a-澱粉酶源自地衣芽孢桿菌(Bacz7/us//c/ze"zj^r附&)、解;定4分芽孑包斥幹菌(5ac/〃wsamy/o/^we^c/eMS)、4古草芽孑包4幹菌CBac!7/Mrato7z'力或嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌抹，但是還可以源自其它芽孢桿菌屬菌種。期望的a-澱粉酶的具體實例包括WO99/19467中SEQIDNO:4所示的地衣芽孢桿菌a-澱粉酶(BLA)、WO99/19467中SEQIDNO:5所示的解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶(BAN),和WO99/19467中SEQIDNO:3所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶(BSG)。在本發明的實施方案中，a-澱粉酶與WO99/19467中SEQIDNO:1、2、3、4或5分別所示的任何序列具有至少60%，優選至少70%，更優選至少80%,甚至更優選至少90%的同一性程度，如至少95%，至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同一性。芽孢桿菌屬a-澱粉酶還可以是變體和/或雜合體，特別是WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO02/10355期望的a-澱粉酶變體在美國專利號6，093，562、6,297,038或美國專利號6,187,576中^^開(通過引用併入本文)，而且包括在位置179至182缺失一個或兩個胺基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶(BSGa-澱粉酶)變體，優選WO1996/023873中公開的雙缺失一參見例如，第20頁，第l-10行(通過引用併入本文)，優選與WO99/19467中公開的SEQIDNO:3所列的野生型BSGa-澱粉酶胺基酸序列相比對應於A(181-182)，或缺失胺基酸179和180，使用WO99/19467中SEQIDNO:3的編號(通過引用併入本文)。甚至更優選的是芽孢桿菌屬a-澱粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶，其具有對應於A(181-182)的雙缺失，而且與WO99/19467中SEQIDNO:3所列的野生型BSGa-澱粉酶胺基酸序列相比，還包含N193F取代(也表示為I181*+G182*+N193F)。a-澱粉酶也可以是產麥芽糖a-澱粉酶。"產麥芽糖a-澱粉酶"(葡聚糖1，4-a-麥芽水解酶，E.C.3.2丄133)能將直鏈澱粉和支鏈澱粉水解成a構型的麥芽糖。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌抹NCIB11837的產麥芽糖a-澱粉酶可從NovozymesA/S,Denmark購買得到。美國專利號4,598,048、4,604,355和6,162,628中描述了產麥芽糖a-澱粉酶，其通過引用併入本文。細菌雜合a-澱4分酶特別期望的雜合a-澱粉酶包含地衣芽孢桿菌a-澱粉酶(如WO99/19467中SEQIDNO:4所示)的445C末端胺基酸殘基，和源自解澱粉芽孢桿菌的a-澱粉酶(如WO99/194676中SEQIDNO:3所示)的37N末端胺基酸殘基，具有一種或多種(特別是全部)下述取代地衣芽孢桿菌編號)。還優選的是具有一個或多個下述突變(或在其它芽孢桿菌屬a-澱粉酶骨架中的相應突變)的變體H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之間的兩個殘基的缺失，優選缺失E178和G179(使用WO99/19467中SEQIDNO:5的編號方式)。可以以本領域眾所周知的量加入細菌a-澱粉酶。當以KNU單位(在下面的"材料與方法，，部分描述)測量時，a-澱粉酶活性優選以0.5-5000NU/gDS的量，以1-500NU/gDS的量，或者更優選以5-1000NU/gDS的量，如10-100NU/gDS存在。真菌a-澱4分酶真菌酸性a-澱粉酶包括源自麴黴屬0^/er^7/w力的菌抹的酸性a-澱粉酶，如米麴黴(Aypgr^'〃wso，—、黑麴黴(^5p^7'〃ws"/ger)、川地麴黴(A/ergz7/wsAra而c/zz7)a-澱粉酶。優選的酸性真菌a-澱粉酶是Fungamyl樣a-澱粉酶，其優選源自米麴黴的菌抹。在本公開中，術語"Fungamyl樣a-澱粉酶"表示與WO96/23874中SEQIDNO:10所示胺基酸序列的成熟部分顯示高度同一性，即高於70%,高於75%,高於80%,高於85%，高於90%，高於95%,高於96%，高於97%,高於98%,高於99%,或者甚至100%同一性的a-澱粉酶。另一種優選的酸性a-澱粉酶源自黑麴黴菌株。在優選實施方案中，酸性真菌a-澱粉酶是來自黑麴黴的a-澱粉酶，其在Swiss-prot/TeEMBL資料庫中以"AMYA_ASPNG，，公開，初級登錄號為P56271,並在WO89/01969(實施例3)中更詳細地進行了描述。酸性黑麴黴酸性a-澱粉酶還顯示為WO2004/080923中的SEQIDNO:1(Novozymes),其通過引用併入本文。還期望與WO2004/080923中SEQIDNO:1具有至少70%同一性，如至少80%或甚至至少90%同一性，如至少95%,至少96%，至少97%,至少98%，或至少99%同一性的所述酸性真菌澱粉酶的變體。合適的商業上可得到的源自黑麴黴的酸性真菌a-澱粉酶是SP288(可從NovozymesA/S，Denmark獲得)。在優選實施方案中，a-澱粉酶源自川地麴黴，由Kaneko等，J.Ferment.Bioeng.81:292-298(1996)，"Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stablealpha-amylasefrom爿^e/^7'〃wsA:m^c/H7"A開；還作為EMBL:#AB0083707>開。真菌酸性a-澱粉酶還可以是包含糖結合模塊(CBM)和a-澱粉酶催化域的野生型酶(即，非雜合)，或其變體。在實施方案中，野生型酸性a-澱粉酶源自川地麴黴的菌林。真菌雜合a-澱4分酶在優選實施方案中，真菌酸性a-澱粉酶是雜合a-澱粉酶。真菌雜合a-澱粉酶的優選實例包括WO2005/003311或美國專利申請發明者蘭迪·戴因哈默,賴克·M·費斯特森申請人:諾維信北美公司;諾維信公司