一種聚合血紅蛋白修飾方法
2023-06-04 22:44:06
專利名稱：一種聚合血紅蛋白修飾方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，特別是一種聚合血紅蛋白修飾方法。
背景技術：
以輸入全血為主要手段的傳統輸血方式在醫療救護方面發揮了極為重要的作用，但同時其自身也存在難以克服的各種缺點，主要表現在輸入前需進行交叉配型、存在多種病毒交叉感染的危險、血源緊張、貯存期較短且需要特殊的設施。為了解決上述矛盾，人們早在19世紀末就開始了有關紅細胞代用品的研究。紅細胞代用品是指具有擴充血容積、維持血管內外滲透壓平衡並且有載氧功能，用以代替人紅細胞的各種氧載體的總稱。血液代用品的研製經歷了從最初無載氧功能的血管擴容劑，如高滲鹽溶液、羥乙基澱粉溶液、明膠等到目前具有攜氧功能的各種載體溶液。目前正在研製的各類產品與全血比較具有諸多優點，如來源廣泛、安全潔淨、可長期保存、輸入人體前無需進行交叉配型，特別適用於戰爭、自然災害、以及其他突發事件中大量出血病人的急救。血紅蛋白是人體內的物質，它的溶液作為紅細胞代用品比化學合成物質更具優越性。但是，未經修飾的血紅蛋白溶液也存在一些問題，如一是未經修飾的血紅蛋白在體內由四聚體裂解為二聚體和單體並從腎臟濾過，形成血紅蛋白尿，造成腎損害；二是在血紅蛋白的提取過程中，由於2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的丟失，使血紅蛋白的氧結合力提高，不利於向組織有效供氧；三是未修飾的血紅蛋白在血漿中膠體滲透壓較高，而且循環半衰期短。
以血紅蛋白為基礎的血液代替品的研究主要集中於延長循環半衰期、降低氧結合力和穩定四聚體結構等方面。通常採用交聯、聚合、脂質體包埋和化學修飾等方法或將幾種方法結合在一起達到此目的。美國Northfield公司用5『-磷酸吡哆醛(PLP)修飾後，用戊二醛聚合的產品已經進入III期臨床實驗。Shirley L.等人，在HemoglobinPolymerization，Methods in enzymology，V(231)，287-308，中指出交聯聚合會使血紅蛋白對氧結合力大大提高，而修飾則會降低氧結合力，所以終產品對氧的結合力將是這兩種作用平衡之後的結果。
在體內，2，3-DPG顯著影響血紅蛋白對氧的結合力。血紅蛋白結合2，3-DPG後O2的結合力降低，氧結合曲線右移，P50增至26mmHg以上。紅細胞內的2，3-DPG有著重要的生理意義，對血紅蛋白的運O2有重要貢獻，血紅蛋白對O2的結合力與紅細胞內的2，3-DPG濃度成反比，因而，紅細胞中2，3-DPG濃度愈高，血液流經組織毛細血管時釋放的O2量也愈多，結合O2能力降低反而有利於輸送O2，人體可通過紅細胞中2，3-DPG濃度改變來調節組織的獲氧量，這對人體在某些缺氧情況下的代償有重要意義。
在體外，在純化過程中2，3-DPG大量丟失，而且聚合過程也會使血紅蛋白對氧結合力大大增加，採用PLP化學修飾血紅蛋白是解決2，3-DPG丟失、氧結合增加的方法之一，從四十年代到現在已經發展了幾十年。目前已發現併合成了許多修飾交聯劑和方法，磷酸吡哆醛(PLP)是其中的一種，它是2，3-DPG的類似物，可以與血紅蛋白β-亞基N-末端的纈氨酸(Val)反應生成希夫鹼，降低血紅蛋白的結合力，提高了血紅蛋白的P50。
5『-磷酸吡哆醛(PLP)可與Hb的亞基N末端的纈氨酸發生羥醛縮合生成亞胺，再經NaBH4還原生成胺鍵。反應如圖1。
據報導，PLP修飾無基質純化血紅蛋白後，可將其P50從10-12mmHg提高到30-32mmHg，這說明用PLP修飾後可降低血紅蛋白的氧結合力，提高其P50，恢復其給組織供氧的能力。但所查閱文獻中對血紅蛋白的PLP修飾都放在聚合步驟之前(前修飾)，無人嘗試過將修飾步驟放在聚合步驟之後(後修飾)。由於PLP售價很高，前修飾比後修飾用量大5-10倍左右，因此在保證血紅蛋白對氧的結合力的條件下改進工藝，將會節省成本，具有很大的經濟效益。
發明內容
本發明的目的在於提供一種聚合血紅蛋白修飾方法，它針對上述情況，發明一種操作簡便、成本低廉、高效的修飾工藝。
本發明的技術方案一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特徵在於它包括以下步驟(1)在0～4℃條件下，以天然紅細胞為原料得到純化血紅蛋白，在通氮及加還原劑保護下，先經同型雙功能試劑進行聚合，再用修飾劑進行修飾；(2)加入修飾劑後加入穀胱甘肽等還原劑防止高鐵血紅蛋白生成。
上述步驟(1)中製備所用的原料天然紅細胞來源為人胎盤血或過期的庫存人血。
上述步驟(1)中先對純化血紅蛋白進行聚合，所用雙功能試劑為戊二醛。
上述步驟(1)中對聚合後血紅蛋白進行修飾，所用修飾劑為5』-磷酸吡哆醛(PLP)。
上述步驟(1)中5』-磷酸吡哆醛與血紅蛋白的摩爾比為4-8∶1。
上述步驟(2)中，加入5』-磷酸吡哆醛反應0.5-1.5小時之後，再加入穀胱甘肽。
上述步驟(2)中，加入穀胱甘肽濃度為2％。
上述步驟(2)中，加入穀胱甘肽終濃度按重量/體積比為0.1～0.5％。
本發明的工作原理為通過對比研究血紅蛋白先用PLP修飾後聚合，以及先聚合後PLP修飾兩種工藝所得產品的P50，從而找出一種合適的修飾工藝。而且，在此過程中加入還原劑以抑制高鐵血紅蛋白的生成，但還原劑的加入順序也會顯著影響PLP的修飾效果。
本發明的技術效果在於在優選合適修飾工藝上做了大量研究，結果表明，前修飾與後修飾P50分別為13.80mmHg和15.07mmHg，無顯著差別，但PLP用量後者比前者少5-10倍。穀胱甘肽等還原物質在PLP之前加入及之後加入P50分別為14.50mmHg和22.11mmHg，兩種加入方式高鐵血紅蛋白含量分別為6.8％和6.6％，而在修飾前高鐵血紅蛋白含量分別為7.8％和8.0％，可以看出，在加入PLP之前和之後加入還原物質對高鐵無顯著影響，但後加入組P50顯著提高。因此，在總結大量實驗結果的基礎上，我們提出將PLP修飾放於聚合之後，而且在加入PLP之後將防止高鐵生成的還原物質加入，這樣既能控制高鐵血紅蛋白的生成，又能保證P50值在合適範圍，而且能大大降低生產成本。
圖1為5『-磷酸吡哆醛(PLP)可與Hb的亞基N末端的纈氨酸發生羥醛縮合生成亞胺，再經NaBH4還原生成胺鍵的圖示。
具體實施例方式以下將通過具體實施方式
的形式再對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅局限於以下的具體實施方式
，凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
實施例1PLP前修飾和後修飾I將從胎盤血(或成人外周血)中純化出的血紅蛋白，在0～4℃的低溫條件下，通入不含氧的高純氮等惰性氣體，流量為每分鐘1～5L，持續15～30分鐘，並按10萬～100萬單位/1000毫升量加入青黴素和/或鏈黴素等常規抑菌藥物並充分混合均勻；將PLP用1M的Tris-Hcl溶解，濃度為2％，PH＝7.3-7.4，按與血紅蛋白摩爾比4∶1-8∶1加入，繼續通高純氮等惰性氣體反應0.5-1.5小時後，按重量/體積比為0.1～0.5％加入2％濃度的穀胱甘肽作為抗氧化劑，再通高純氮等惰性氣體反應1-2小時後，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解於10-3M氫氧化鈉)終止，反應3-6個小時。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為10KD的超濾膜按常規方式進行超濾處理，使濃度至4-6g/dl，0.22um除菌過濾。按5-9∶1加入1％的戊二醛，通氮反應0.5小時，用10-15倍體積等滲PBS(PH＝7.3-7.4)進行以截留分子量為100KD的超濾膜按常規方式進行超濾處理，濃縮至10-12g/dl，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解於10-3M氫氧化鈉)終止，反應3-6個小時。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為100KD的超濾膜按常規方式進行超濾處理，使濃度至4-6g/dl，0.22um除菌過濾，取樣進行P50檢測。
II將從胎盤血(或成人外周血)中純化出的血紅蛋白，在0～4℃的低溫條件下，通入不含氧的高純氮等惰性氣體，流量為每分鐘1～5L，持續15～30分鐘，並按10萬～100萬單位/1000毫升的量加入青黴素和/或鏈黴素等常規抑菌藥物並充分混合均勻，再通高純氮等惰性氣體0.5-1小時。按5-9∶1加入1％的戊二醛，通氮反應0.5小時，用10-15倍體積等滲PBS(PH＝7.3-7.4)進行以截留分子量為100KD的超濾膜按常規方式進行超濾處理，濃縮至10-12g/dl，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解於10-3M氫氧化鈉)終止，反應3-6個小時。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為100KD的超濾膜按常規方式進行超濾處理，濃縮至8-10g/dl，0.22um除菌過濾。將PLP用1M的Tris-Hcl溶解，濃度為2％，PH＝7.3-7.4，按與血紅蛋白摩爾比4∶1-8∶1加入，繼續通高純氮等惰性氣體反應1-2小時後，按重量/體積比為0.1～0.5％加入2％濃度的穀胱甘肽作為抗氧化劑，再通高純氮等惰性氣體反應1-2小時後，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解於10-3M氫氧化鈉)終止，反應3-6個小時。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為100KD的超濾膜按常規方式進行超濾處理，使濃度至4-6g/dl，0.22um除菌過濾。取樣進行P50檢測。
實施例2穀胱甘肽的加入順序I將從胎盤血(或成人外周血)中純化出的血紅蛋白，在0～4℃的低溫條件下，通入不含氧的高純氮等惰性氣體，流量為每分鐘1～5L，持續15～30分鐘，按10萬～100萬單位/1000毫升的量加入青黴素和/或鏈黴素等常規抑菌藥物並充分混合均勻，再通高純氮等惰性氣體0.5-1小時按重量/體積比為0.1～0.5％加入2％濃度的穀胱甘肽作為抗氧化劑。將PLP用1M的Tris-HCl溶解，濃度為2％，PH＝7.3-7.4，按與血紅蛋白摩爾比4∶1-8∶1加入，繼續通高純氮等惰性氣體反應2-3小時。按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解於10-3M氫氧化鈉)終止反應3-6個小時。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為10KD的超濾膜按常規方式進行超濾處理，濃縮至8-10g/dl，0.22um除菌過濾，取樣進行P50檢測。
II將從胎盤血(或成人外周血)中純化出的血紅蛋白，在0～4℃的低溫條件下，通入不含氧的高純氮等惰性氣體，流量為每分鐘1～5L，持續15～30分鐘，並按10萬～100萬單位/1000毫升的量加入青黴素和/或鏈黴素等常規抑菌藥物並充分混合均勻，再通高純氮等惰性氣體0.5-1小時。將PLP用1M的Tris-Hcl溶解，濃度為2％，PH＝7.3-7.4，按與血紅蛋白摩爾比4∶1-8∶1加入，繼續通高純氮等惰性氣體反應1-2小時後，按重量/體積比為0.1～0.5％加入2％的穀胱甘肽作為抗氧化劑，再通高純氮等惰性氣體反應1-2小時後，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解於10-3M氫氧化鈉)終止，反應3-6個小時。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為10KD的超濾膜按常規方式進行超濾處理，濃縮至8-10g/dl，0.22um除菌過濾，取樣進行P50檢測。
由上述方法製備的血紅蛋白P50檢測結果如表1所示。
表1 血紅蛋白P50檢測結果
權利要求
1.一種用於聚合血紅蛋白修飾的方法，其特徵在於它包括以下步驟(1)在0～4℃條件下，以天然紅細胞為原料得到純化血紅蛋白，在通氮及加還原劑保護下，先經同型雙功能試劑進行聚合，再用修飾劑進行修飾；(2)加入修飾劑後，加入穀胱甘肽等還原劑防止高鐵血紅蛋白生成。
2.根據權利要求1所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特徵在於製備所用的原料天然紅細胞來源為人胎盤血或過期的庫存人血。
3.根據權利要求1所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特徵在於先對純化血紅蛋白進行聚合，所用雙功能試劑為戊二醛。
4.根據權利要求1所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特徵在於對聚合後血紅蛋白進行修飾，所用修飾劑為5』-磷酸吡哆醛。
5.根據權利要求1所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特徵在於在加入5』-磷酸吡哆醛之後再加入穀胱甘肽等還原劑。
6.根據權利要求4所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特徵在於PLP與血紅蛋白的摩爾比為4-8∶1。
7.根據權利要求5所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特徵在於在加入5』-磷酸吡哆醛反應0.5-1.5小時之後再加入穀胱甘肽。
8.根據權利要求5所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特徵在於加入穀胱甘肽終濃度按重量/體積比為0.1～0.5％。
全文摘要
本發明涉及的是用於聚合血紅蛋白的修飾方法，其特徵在於在0～4℃及通氮等條件下，由天然紅細胞得到純化血紅蛋白，將其先經同型雙功能試劑聚合，再用5』－磷酸吡哆醛修飾。修飾過程中，穀胱甘肽應在加入PLP之後0.5－1.5小時之後加入。此工藝既能控制高鐵血紅蛋白的生成，又能保證P
文檔編號A61P7/08GK1990039SQ20051013602
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日 優先權日2005年12月28日
發明者楊成民, 李鳳娟, 張鴻輝, 梁偉光, 李洪英, 許麗麗, 李燊, 王勁峰, 楊曉明 申請人:天津協和生物科技發展有限公司