紅腰子豆素和它的製備方法及其用途的製作方法
2023-06-05 08:41:26
專利名稱：紅腰子豆素和它的製備方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬製藥領域，涉及來源於植物種子提取的植物糖蛋白的分離純化技術及其應用。
背景技術：
Rigas等採用硫酸銨沉澱技術最先從菜豆中分離植物血球凝集素提取物(Rigas D.A.et al.，1955，J.Biol.Chem.212609)，但提取物較粗。Allen等首先將植物血球凝集素提取物用離子交換層析方法分離為刺激淋巴細胞分裂和低紅細胞凝集活性的L-PHA(白細胞凝集素)和既有刺激淋巴細胞分裂又有促紅細胞凝集活性的蛋白混合物H-PHA(Allen，L.W.，et al.，1969，Proc Natl.Acad.Sci.USA，63334)。Dahlgren等根據PHA的不同的凝集活性，分離出只凝集白細胞的L-PHA和白細胞和紅細胞均凝集的E-PHA(Dahlgren，K.et al.，1970，Arch.Biochem.Biophys.，137306)。Weber等測定出L-PHA和E-PHA的分子量分別為150000和140000，各由四個分子大小相似的亞基構成(Weber，T.H.et al.，1972，Biochem.Biophys.Acta，26394)。根據提取方法的不同，PHA的製品分為PHA-M和PHA-P，前者為鹽水浸出物，為PHA的糖蛋白形式；後者為酸浸出物，為PHA的蛋白形式。我國的丁邦裕等(1991年)用pH值為2的酸性水抽提江蘇豌豆種子粉後，硫酸銨分級沉澱得PHA的一種同工凝集素PHA-P(生物化學雜誌，1991，726)；CN1230891A公開了一種凝集素在製備控制黏膜細胞增殖、減輕和/或治療因細胞-損傷劑引起的損傷以及減輕和/或治療代謝性疾病之藥物中的應用，其凝集素包括天然的和化學合成的，而該專利是來自菜豆、大豆、刀豆、小麥胚芽、蓮花種子、洋蔥、兵豆、番茄、馬鈴薯提取分離的一種凝集素；CN1240670A公開了一種植物血球凝集素的分離純化技術，它是用植物菜豆為原料，用鹽溶液抽提和強陽離子柱層析兩個步驟，採用一根強陽離子柱S-Sepharose Fast Flow(SSFF)獲得了高純度PHA-E，純度可達95％以上，PHA-E是一種紅細胞凝集素，其等電點為6.5，分子量約為33kD，血細胞凝集活性最低為13μg/ml。
CN1439425公開了一種植物血球凝集素(PHA-P)，用於製備抗癌藥物，PHA-P是一類含糖量為23.1％的糖蛋白；但上述的這些文獻報導，都是實驗室的研究，植物血球凝集素至今還未成為工業醫藥產品，應用於臨床。由於不同植物中的植物血球凝集素PHA的組成差異較大，作用也會不同。
發明內容
本發明的目的是尋找從紅腰子豆植物提取一種活性成分，分離純化紅腰子豆素的方法，用於促進淋巴細胞分裂生長和分化，適用於工業生產，應用於製備藥物。
為達到本發明的目的所採用的技術方案從豆科(Legaminosae)菜豆屬(Phaseolus)的紅腰子豆(Phaseolus vuigaris)植物的種子提取的由四個蛋白亞基組成的糖蛋白，每個蛋白亞基的平均分子量為29.5～30.5kD；紅腰子豆素平均分子量為119～121kD。所述四個蛋白亞基可以相同，也可以不同，其中，一種亞基的N端胺基酸序列可以為Ser-Asn-Asp-Ile-Tyr-Phe-Asn-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg，另一種亞基的N端胺基酸序列可以為Ala-Ser-Gln-Thr-Ser-Phe-Ser-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg。
本發明所說的紅腰子豆素的製備方法，是用紅腰子豆經過粉碎後，用1％的氯化鈉溶液浸提12～16小時，離心取上清液，用10％～30％的醇醚混合液沉澱，離心得到紅腰子豆素的粗提取物，真空冷凍乾燥後用1％～5％的氯化鈉溶解，經二乙胺基乙基纖維素離子交換層析柱，收集紅腰子豆素的洗脫液，真空冷凍乾燥，即得到紅腰子豆素。
用上述方法製得的紅腰子豆素經過聚丙烯醯胺電泳檢測、十二烷基硫酸鈉(SDS)變性電泳檢測、蛋白質分子量測定等檢測分析表明紅腰子豆素是由四個平均分子量為29.5～30.5kD蛋白亞基組成的糖蛋白，通過胺基酸序列測定表明紅腰子豆素有兩種不同N端胺基酸序列的蛋白亞基；並經生物活性檢測，用人體血液體外培養觀察其對淋巴細胞轉化率的作用，可見本發明所提供的紅腰子豆素能促進人體血液中淋巴細胞轉化，其轉化率大於60％，在其對淋巴細胞發揮藥效作用劑量範圍內對人體紅細胞沒有凝集作用。
紅腰子豆素生物活性檢測方法1.材料和方法1.1材料檢測樣品108II血源正常輸血員血液培養液RPMI-1640培養液(自配、不含小牛血清)。
1.2方法按以下步驟進行操作血液放置37℃恆溫箱自然沉降；→紅腰子豆素樣品用無菌生理鹽水配成1mg/ml濃度，取0.1毫升稀釋至1毫升，再取0.15毫升加入含有0.5毫升血漿的1640培養液2.5毫升中，使其最終濃度為10μg/ml，設不加紅腰子豆素對照管；→放置37℃二氧化碳培養箱培養72小時；→終止培養，將培養管放於離心機離心1000轉/10分鐘；→吸取沉澱的細胞塗片；→Wright染液染色；→油鏡下計數200個淋巴細胞中轉化細胞的百分率。
2.結果在紅腰子豆素刺激下，小淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，在鏡下可見分裂相的淋巴母細胞。計數200個淋巴細胞的進入分裂生長狀態數目，減去對照管的相應數目，即可獲得淋巴細胞的轉化率。一般來說，在劑量為5～10μg/ml的紅腰子豆素時，淋巴細胞的轉化率有60％～70％。
用本發明提供的紅腰子豆素用途之一，可製備含有紅腰子豆素和藥學上可接受的賦形劑，製成凍乾粉針劑、小水針劑。
1、凍乾粉針劑的製備配方紅腰子豆素 10g氯化鈉 10g甘露醇 30g操作方法用1％的氯化鈉溶液溶解成為每毫升含有紅腰子豆素10毫克的溶液，按GMP要求和凍乾粉劑的通常製備方法，製成每支為5毫克或10毫克的注射用凍乾粉針，按生物製品質量檢驗的要求檢定合格後即可。在凍乾粉針劑中還可以加入適量的甘露糖、乳糖或其它的一些藥用輔料。
2、水針劑的製備配方紅腰子豆素 10g氯化鈉 10g蒸餾水 加至1000ml操作方法用藥用生理鹽水溶解成為每毫升含有紅腰子豆素5毫克或10毫克的溶液→按GMP要求和水針劑的通常製備方法，製成每支為5毫克或10毫克的注射用水針劑→質量鑑定合格後即可獲得成品。
本發明所提供的紅腰子豆素的用途之二，可用於製備提高機體免疫力的藥物。
下面用本發明提供的紅腰子豆素進行體外免疫學試驗，說明其在醫藥領域中用於提高機體免疫力的用途。
1、機體免疫力的測定——淋巴細胞轉化試驗對於人體來說，正常人體外周血淋巴細胞的轉化率≥55％，而免疫力低下的人體的外周血淋巴細胞轉化率一般＜50％。用淋巴細胞轉化試驗測定人體免疫力狀態的方法同前述的「紅腰子豆素生物活性檢測方法」。
2、紅腰子豆素對提高人體免疫力的臨床觀察使用方法細胞免疫功能低下者20例，每日靜脈滴注紅腰子豆素15毫克(溶於5％葡萄糖生理鹽水)。結果使用紅腰子豆素治療，細胞免疫功能恢復較快，14例有效的患者在治療前的平均淋巴細胞轉化率為38％，治療後上升到57％。細胞免疫功能恢復正常(淋巴細胞轉化率大於55％)12例，細胞免疫功能有提高者4例，其餘5例無變化。表明紅腰子豆素對提高免疫力有較好的效果。
紅腰子豆素的用途之三，是用於製備治療貧血和再生障礙性貧血的藥物中的應用。
紅腰子豆素的用途之四，是用於製備治療和預防白細胞減少的藥物中的應用。
紅腰子豆素的用途之五，是用於製備治療和預防淋巴細胞低下的藥物中的應用。
下面用動物試驗證明紅腰子豆素用於製備治療貧血和再生障礙性貧血和白細胞減少症的藥物中的應用，特別是對淋巴細胞減少的白細胞減少症效果更好1、紅腰子豆素對再生障礙性貧血、白細胞減少、淋巴細胞減少的小鼠模型藥效試驗一、材料和方法1、動物Balb/c小鼠，8～12周齡，體重16～20g，雄性；DBA/2小鼠，8～12周齡，雌雄不拘，由中山大學實驗動物中心提供。
2、藥物及其對照紅腰子豆素凍乾粉針1mg/瓶，陽性藥物對照為環孢素A(CSA)，陰性對照為生理鹽水。
3、造模方法電離輻射損傷模型，破壞全身造血組織(包括淋巴細胞系統、紅細胞系統、粒細胞系統和單核細胞及巨噬細胞系統)(1)輻射根據華南農大輻照中心所檢定的60Co輻射強度(0.5Gy/min)，共照射6Gy/12min。
(2)免疫細胞輸入取DBA/2小鼠胸腺細胞，4h內將細胞尾靜脈注射照射後的Balb/c小鼠，輸入量為1×106個細胞/只。
(3)藥物注射紅腰子豆素凍乾粉針和環孢素A(CSA)按預定劑量(0.05mg/只/天)進行。
4、小鼠分組及處理將小鼠隨機分組，每組15隻，分別為正常組(Con-)未照射動物腹腔注射生理鹽水，0.2ml/天；模型組(Con+)造模後處理同正常組；紅腰子豆素組造模後腹腔注射紅腰子豆素，注射體積0.2ml/天；CSA組造模後腹腔注射環孢素A注射體積0.2ml/天(劑量約為人的50倍)。
5檢測指標實驗結束時每組隨機檢測10隻動物。測定小鼠的血紅蛋白，對紅細胞、白細胞、淋巴細胞、血小板和骨髓有核細胞數(BMNC)計數。
6數據處理取10隻動物的檢測結果的平均值。統計處理主要數據以均值±標準差表示，進行t檢驗，p＜0.05為顯著。*為紅腰子豆素和模型組比較具有顯著差異。
二、結果和分析各組小鼠的血紅蛋白、紅細胞、白細胞、血小板和骨髓有核細胞數的檢測結果如下表。
藥物處理血紅蛋白 紅細胞白細胞 淋巴細胞血小板 骨髓有核細(g/L) (1011/L) (109/L)(108/L)(109/L) 胞數(105)正常組 170±7.4 5.15±1.127.5±0.9 680.3±11.2 641.3±5.2 110.2±10.3
模型組 83±8.0 1.32±0.310.51±0.12 110.2±10.3 8.0±0.9 0.99±0.26紅腰子豆素 151±10.5*3.98±0.83*1.16±0.32*231.5±23.3*171.2±10.3*45.10±0.53*處理組CSA組 119±10.6*2.65±0.62*1.17±0.06*220±14.6*181.9±14.5*20.91±1.23*由此可見，紅腰子豆素對再生障礙性貧血小鼠的血紅蛋白、紅細胞、白細胞、淋巴細胞、血小板和骨髓有核細胞有顯著的恢復和治療作用，對白細胞減少(低下)、淋巴細胞減少(低下)有顯著的治療效果。
2、紅腰子豆素對骨髓抑制小鼠模型藥效試驗一、材料和方法1.動物昆明鼠18～22g，每組15隻，8～12周齡。雌雄不拘，由中山大學實驗動物中心提供。
2.藥物和對照紅腰子豆素凍乾粉針1mg/瓶3.造模方法環磷醯胺175mg/kg腹腔注射小鼠每日一次，連續三次分組正常組注射生理鹽水0.2ml/次造模組陰性對照造模後尾靜脈注射生理鹽水0.2ml/次高劑量組造模後尾靜脈注射紅腰子豆素0.1mg/只/次中劑量組造模後尾靜脈注射紅腰子豆素0.05mg/只/次低劑量組造模後尾靜脈注射紅腰子豆素0.025mg/只/次注射體積0.2ml/次於造模後尾靜脈注射紅腰子豆素，每三日注射一次，共注射三次。在最後一次紅腰子豆素後的第四日處理動物進行觀察。
4.檢測指標各組小鼠分別於注射當天、第5天、第10天測定血紅蛋白(HGB)，對其紅細胞、白細胞、血小板計數。採用尾靜脈採血方法。造模後第5天，每組處死2隻小鼠進行骨髓細胞學檢查。造模後第15天，全部處死小鼠，進行骨髓細胞培養和骨髓細胞學檢查紅系祖細胞(BFU-E)、粒巨系祖細胞(CFU-GM)。
5.數據處理主要數據以均值±標準差表示，進行t檢驗，p＜0.05為顯著。
*為各組和模型組比較具有顯著差異。
各組外周血象變化組別 只數 WBC(×109/L) RBC(×1012/L) HGB(g/L) PLT(×109/L)小劑量組 9 3.5±0.9*5.1±0.7*93.9±14.4*534.2±110.4*中劑量組 11 4.0±0.5*4.7±0.4*92.8±4.4*467.9±43.3*高劑量組 11 4.2±0.7*5.3±0.4*97.7±6.4*504.1±76.0*造模組8 3.0±0.63.3±0.8 49.2±10.6239.8±79.0正常組13 5.4±1.6*4.6±0.7*80.2±7.4*724.8±104.3*各組骨髓細胞學變化組別 只數 粒紅有核細胞數形態描述小劑量組 9 0.90±0.12 5.5±0.2*骨髓增生活躍，可見幼紅及巨核細胞中劑量組 11 1.40±0.11*8.6±0.5*骨髓增生活躍，多見幼紅及巨核細胞高劑量組 11 1.80±0.09*12.1±0.2*骨髓增生活躍，易見幼紅及巨核細胞造模組8 0.75±0.16 1.3±0.3骨髓增生活躍，可見少許幼紅，偶見巨核細胞正常組13 2.08±0.14*15.3±0.7 骨髓增生明顯活躍，易見幼紅及巨核細胞各組BFU-E、CFU-GM培養組別 只數 BFU-E CFU-GM小劑量組 9 14.70±7.35*7.91±1.73*中劑量組 11 11.90±4.64*12.0±5.0*高劑量組 11 13.66±3.12*9.7±2.1*造模組8 1.60±1.2 0.63±0.45正常組13 2.18±1.72 6.8±1.7由此可見，紅腰子豆素對骨髓抑制小鼠的血紅蛋白、紅細胞、白細胞、血小板和骨髓有核細胞有顯著的恢復和治療作用。說明體外可刺激小鼠紅系、粒巨系祖細胞增殖及分化作用。說明紅腰子豆素可加速損傷骨髓造血功能的恢復，可用於製備貧血藥物。
3、紅腰子豆素製劑對再生障礙性貧血的療效觀察用紅腰子豆素製劑治療再生障礙性貧血12例，其中有效7例，有效率達58％。使用方法為一次用紅腰子豆素15～20毫克(根據體重增減用藥量)，溶於生理鹽水後再與10％的葡萄糖液混合，靜脈滴注，兩個星期為一個療程。病人治療時間為2個月到12個月不等。對於有療效的病例，一般用藥2～3個療程後，可顯著減少輸血次數，血紅蛋白、紅細胞和白細胞數逐步恢復正常。4、紅腰子豆素對慢性苯中毒引起的白細胞減少療效觀察方法10例職業性的慢性苯中毒者，每日一次以紅腰子豆素15毫克加入10％的葡萄糖靜脈滴注，連續14天為一個療程。
結果經過一個療程後，8例患者的白細胞顯著升高，升高的幅度為10％～48％，平均達29％；10例患者的淋巴細胞轉化率均明顯提高，提高率為27％～53％，平均提高38％；患者的自覺症狀都有不同程度的改善。
本發明的積極效果是1.從豆科植物紅腰子豆種子用簡單的提取分離技術得到了一種純度較高的糖蛋白，植物資源易得，工藝簡單，適於工業化批量生產。
2.本發明所提供的產品可用於製備提高機體免疫力、貧血和再生障礙性貧血、預防白細胞減少、治療和預防淋巴細胞低下的藥物。
3、本發明所提供的紅腰子豆素能促進人體血液中淋巴細胞轉化，其轉化率大於60％，在其對淋巴細胞發揮藥效作用劑量範圍內對人體紅細胞沒有凝集作用。
下面通過實施例和附圖詳細說明本發明的技術方案
圖1、為紅腰子豆素的離子柱分離純化色譜圖。
圖2、為紅腰子豆素的分子篩純化色譜圖。
圖3、為紅腰子豆素的凝膠電泳掃描圖。
圖4、為紅腰子豆素的SDS-PAGE電泳圖。
圖5、為紅腰子豆素的質譜分析圖。
具體實施例方式
實施例1紅腰子豆素的製備取廣東江門產紅腰子豆種子洗淨晾乾，用粉碎機粉碎，過50目網篩後，稱取500克，用1％的氯化鈉溶液5倍重量溶液浸提12小時，3000rpm離心15分鐘取上清液，用70％的乙醇沉澱，再用10％乙醚沉澱，取上清經3000rpm離心15分鐘取沉澱，即為紅腰子豆素的粗提取物約25g，真空冷凍乾燥後每次用10g粗粉加2％的氯化鈉溶液溶解後以30kD超濾膜超濾後進行DEAE-Sepharose離子交換分離，以15mmol/L pH6.5磷酸鹽緩衝液(A液)平衡離子交換柱，進樣後，將A液和B液(B液中含有1mol/L NaCl的溶液)以0.01～0.05mol/L NaCl梯度進行洗脫，流速為5ml/min，276nm波長檢測，收集含紅腰子豆素洗脫液，見圖1中箭頭所示。在-40℃真空冷凍乾燥。
然後對含有紅腰子豆素的收集峰進行分子篩凝膠過濾，脫鹽或以5～10kD截留分子量超濾膜超濾濃縮脫鹽，如圖2所示，經過真空冷凍乾燥，即獲得紅腰子豆素純品289mg。通過反相C18的HPLC或變性電泳分析測定紅腰子豆素的純度≥97％。
取本品進行非變性電泳(PAGE)檢測方法按通用的聚丙烯醯胺電泳方法。分離膠為10％，濃縮膠為4％。以卡馬斯亮藍染色。用Bio-Rad的Gel Doc 2000成像系統進行分析。
電泳的結果如圖3所示，表明紅腰子豆素在非變性電泳中呈現為一條較寬的蛋白質帶，這是一種典型的糖蛋白分子的不均一性的電泳行為(與其SDS-PAGE對照)。
取本品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳檢測檢測方法1.制膠貯液配製1)丙稀醯胺貯液14.55g丙稀醯胺+0.45gN，N′-甲叉雙丙稀醯胺，先用40ml雙蒸水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸水稀釋至50ml，過濾。用棕色瓶可在4℃保存一個月。
2)濃縮膠緩衝液貯液(0.1mol/L Tris-HCL，pH6.8)6.06g Tris溶解在40ml雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調節至pH6.8，再用雙蒸水加至50ml，4℃保存。
3)分離膠緩衝液貯液(1.5mol/L Tris-HCL，pH8.8)9.08g Tris溶解在40ml雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調節至pH8.8，再用雙蒸水加至50ml，4℃保存。
4)10％SDS25gSDS，用雙蒸水溶解至250ml，室溫保存。
5)10％過硫酸銨0.1g過硫酸銨+1ml雙蒸水，使用前新鮮配製。
6)10％TEMED0.1ml TEMED+0.9ml雙蒸水。
SDS不連續電泳用的凝膠配方(垂直電泳用)貯液凝膠終濃度T＝3％T＝10％單體貯液(ml)3.4 10濃縮膠緩衝液貯液(ml)2.4 -分離膠緩衝液貯液(ml)- 7.510％SDS 0.2 0.3雙蒸水 1412.210％過硫酸銨101010％TEMED 10102.電泳電泳緩衝液常用Tris-甘氨酸系統(0.025mol/L Tris，0.192mol/L甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3)，加樣(恆電流2mA)，濃縮電泳(恆電流10mA，時間30min)，分離電泳(恆電壓300V，時間45min)共約2小時。上樣量不小於10ug。
3.染色考瑪斯亮藍染色染色液在980ml 2％磷酸中加入100g過硫酸銨，直到完全溶解。再加1g考瑪斯亮藍G-250(溶在20ml水中)，不需過濾，使用前振搖。
固定將凝膠放在12％三氯醋酸中固定1小時。
染色取160ml染色液，在染色時加40ml甲醇。染色過夜。
漂洗染色後用漂洗液(10％醋酸、5％甲醇水溶液)漂洗24小時以上。隨後用水反覆浸泡至無醋酸味。
電泳的結果如附圖4所示，左帶為紅腰子豆素，右帶為蛋白質分子量標準。紅腰子豆素在SDS-PAGE下呈現為均一的蛋白質帶，通過與蛋白質分子量標準的比較表明紅腰子豆素的蛋白亞基的分子量為30kD左右。由PAGE和SDS-PAGE的比較表明，紅腰子豆素的糖基化鏈有較大的不均一性。
取本品進行質譜分析，測定其分子量質譜分析在Bruke公司ProFlex III MALDI TOF質譜儀上進行，採用陽離子工作模式。基質為CCA(a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)飽和液，基質溶解液為50％的乙腈和50％的溶解有0.1％TFA的雙蒸水。按1∶20將樣品溶液和基質溶液混合後點樣，室溫下自然乾燥，進行質譜分析。
質譜分析結果如圖5所示，由此表明紅腰子豆素的蛋白亞基的平均分子量為29.3～30.5kD，結合電泳的分析數據表明天然的紅腰子豆素的平均分子量為約120kD左右。通過質譜分析可以推測紅腰子豆素的糖基化鏈的不均一性是比較大的，並且其蛋白亞基之間的分子量有一定差異。
取本品進行胺基酸序列測定胺基酸序列測定在Applied Biosystem 491 Pulse Liquid Phase測序儀上自動進行。苯異內醯硫脲(PTH)胺基酸用PTH C18柱在Applied Biosystem的140C分析儀上進行反相HPLC。
胺基酸序列結果確定如下一種亞基的N端胺基酸序列為Ser-Asn-Asp-Ile-Tyr-Phe-Asn-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg另一種亞基的N端胺基酸序列為Ala-Ser-Gln-Thr-Ser-Phe-Ser-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg
用本品測定其對人體外周血淋巴細胞的促分裂作用測定方法1.淋巴細胞的分離(參見薛慶善.2001.體外培養的原理與技術.科學出版社.590-592)2.淋巴細胞的培養(參見薛慶善.2001.體外培養的原理與技術.科學出版社.610-611)及參照前述「淋巴細胞轉化試驗」的方法1)用含10％小牛血清培養基將純化的淋巴細胞配成密度為5×105～1×106個/ml的懸液。加入紅腰子豆素至終濃度10μg/ml。
2)將細胞懸液加入25cm2培養瓶，每瓶12ml。
3)至飽和溼度、37℃、5％CO2培養箱培養3天。
3.Wright染液染色和觀察離心收集培養的細胞，塗片後Wright染色液染色，在顯微鏡中觀察細胞的分化情況。
結果在鏡下可見分裂相的淋巴母細胞，加入紅腰子豆素的淋巴細胞轉化率為65％；未加紅腰子豆素的對照，處於分裂相的淋巴母細胞很少，淋巴細胞轉化率為52％。
實施例2取廣東的紅腰子豆種子洗淨晾乾，用粉碎機粉碎，過50目網篩後，稱取400克，用1％的氯化鈉溶液7倍重量溶液浸提16小時，3000rpm離心15分鐘取上清液，用70％的乙醇沉澱，再用20％乙醚沉澱，取上清經3000rpm離心15分鐘取沉澱，即為紅腰子豆素的粗提取物約20.3g，真空冷凍乾燥後，每次將粗提取物10g用1％的氯化鈉溶液溶解後以30kD超濾膜超濾後進行DEAE-Sepharose離子交換分離，以15mmol/LPH6.5磷酸鹽緩衝液(A液)平衡離子交換柱，進樣後，將A液和B液(B液中含有1mol/L NaCl的溶液)以0.01～0.05mol/L NaCl梯度進行洗脫，流速為5ml/min，276nm波長檢測，收集含紅腰子豆素洗脫液在-40℃真空冷凍乾燥。
然後對含有紅腰子豆素的收集峰進行分子篩凝膠過濾脫鹽或以5～10kD截留分子量超濾膜超濾濃縮脫鹽，經過真空冷凍乾燥，即獲得紅腰子豆素純品400mg。通過反相C18的HPLC或變性電泳分析測定紅腰子豆素的純度≥97％。淋巴細胞轉化率為67％。
實施例3取廣東的紅腰子豆種子洗淨晾乾，用粉碎機粉碎，過50目網篩後，稱取400克，用1％的氯化鈉溶液8倍重量溶液浸提16小時，3000rpm離心15分鐘取上清液，用70％的乙醇沉澱，再用30％乙醚沉澱，取上清經3000rpm離心15分鐘取沉澱，即為紅腰子豆素的粗提取物約20.3g，真空冷凍乾燥後，將10g粗提取物用5％的氯化鈉溶液溶解後以30kD超濾膜超濾後進行DEAE-Sepharose離子交換分離，以15mmol/LPH6.5磷酸鹽緩衝液(A液)平衡離子交換柱，進樣後，將A液和B液(為B液中含有1mol/L NaCl的溶液)以0.01～0.05mol/L NaCl梯度進行洗脫，流速為5ml/min，276nm波長檢測，收集含紅腰子豆素洗脫液在-40℃真空冷凍乾燥。
然後對含有紅腰子豆素的收集峰進行分子篩凝膠過濾脫鹽或以5～10kD截留分子量超濾膜超濾濃縮脫鹽，經過真空冷凍乾燥，即獲得紅腰子豆素純品385mg。通過反相C18的HPLC或變性電泳分析測定紅腰子豆素的純度≥97％。淋巴細胞轉化率為68％。
序列表110廣州拜迪生物醫藥有限公司120紅腰子豆素和它的製備方法及其用途1602210121120212PRT4001亞基A的N端胺基酸序列為Ser Asn Asp Ile Tyr Phe Asn Phe Gln Arg Phe Asn15 10Glu Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg15 20210221120212PRT4002亞基B的N端胺基酸序列為Ala Ser Gln Thr Ser Phe Ser Phe Gln Arg Phe Asn15 10Glu Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg。
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權利要求
1.一種紅腰子豆素，其特徵是從豆科(Legaminosae)菜豆屬(Phaseolus)的紅腰子豆(Phaseolus vuigaris)植物的種子提取的由四個蛋白亞基組成的糖蛋白，每個蛋白亞基的平均分子量為29.5～30.5kD；紅腰子豆素平均分子量為119～121kD。
2.根據權利要求1所說的紅腰子豆素，其特徵是所述的四個蛋白亞基中，一種亞基的N端胺基酸序列為Ser-Asn-Asp-Ile-Tyr-Phe-Asn-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg，另一種亞基的N端胺基酸序列為Ala-Ser-Gln-Thr-Ser-Phe-Ser-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg。
3.根據權利要求1所說的紅腰子豆素的製備方法，其特徵是用紅腰子豆種子經過粉碎後，用1％的氯化鈉溶液浸提12～16小時，離心取上清液，用10％～30％的醇醚混合液沉澱，離心得到紅腰子豆素的粗提取物，真空冷凍乾燥後用1％～5％的氯化鈉溶解，經二乙胺基乙基纖維素離子交換層析柱，收集紅腰子豆素的洗脫液，真空冷凍乾燥，即得到紅腰子豆素。
4.根據權利要求1所述的紅腰子豆素的用途，其特徵在於製備含有紅腰子豆素的凍乾粉針劑、小水針。
5.根據權利要求1所述的紅腰子豆素的用途，其特徵在於製備提高機體免疫力的藥物。
6.根據權利要求1所述的紅腰子豆素的用途，其特徵在於製備治療貧血和再生障礙性貧血的藥物。
7.根據權利要求1所述的紅腰子豆素的用途，其特徵在於製備治療和預防白細胞減少的藥物。
8.根據權利要求7所述的紅腰子豆素的用途，其特徵在於製備治療和預防淋巴細胞低下的藥物。
全文摘要
紅腰子豆素和它的製備方法及其用途，屬於製藥領域，涉及來源於植物種子提取的植物糖蛋白的分離純化技術及其應用。它是從紅腰子豆經過粉碎後，用1％的氯化鈉溶液浸提，離心取上清液，用醇醚混合液沉澱，離心得到的粗提取物，真空冷凍乾燥後用氯化鈉溶解，經二乙胺基乙基纖維素離子交換層析柱，收集紅腰子豆素的洗脫液，真空冷凍乾燥，得到紅腰子豆素，它是一種由四個蛋白亞基組成的糖蛋白，每個蛋白亞基的平均分子量為29.5～30.5kD；紅腰子豆素平均分子量為119～121kD，用於製備提高機體免疫力、貧血和再生障礙性貧血、預防白細胞減少、治療和預防淋巴細胞低下的藥物。
文檔編號A61P37/00GK1594360SQ200410027839
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月30日 優先權日2004年6月30日
發明者張曉元, 李素芬, 周豔霞, 丘力功 申請人:廣州拜迪生物醫藥有限公司