鏈格孢菌代謝產物在防治黃瓜立枯病菌中的應用的製作方法

2023-06-05 06:51:56 3

專利名稱：鏈格孢菌代謝產物在防治黃瓜立枯病菌中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及生防內生真菌一鏈格孢菌 (Alternaria alternata)的培養及其代謝產物的應用。
背景技術：
植物體內都存在大量的內生真菌，內生真菌最早發現於牧草，後來又在木本植物、 草本植物、禾本植物、苔蘚、地衣、海藻等植物中被發現。迄今的研究表明，植物內生真菌可增強宿主的抗病性、提高植物的生產力、抗逆抗蟲等。發揮這些作用是由於內生真菌在植物體內繁殖和生長，並在體內產生有生物活性的次生代謝產物。因此，內生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑，在生態農業和生物農藥研製方面具有重要的用途。近年來植物內生真菌已引起了微生物學家、生態學家、植物保護學家的廣泛興趣，逐漸成為國內外研究的熱點。目前微生物源生物化學農藥的研究和開發在我國十分活躍，但微生物資源及其應用潛力尚沒有得到充分的發揮，而植物內生真菌即是這樣一類有待開發的新興微生物資源。目前對植物病害的防治，主要採用化學農藥殺滅病原菌，但化學農藥對人畜的毒副作用和殘留問題至今仍難以有效的解決。利用內生真菌產生的抗病原真菌的活性物質進行植物病原真菌病害的生物防治，則具有周期短、易於研究、便於生產和低毒等優點。本發明從樟樹中分離到一株生防內生真菌，並對該菌株發酵代謝產物進行了抑菌作用研究。該發明為微生物源農藥的進一步研製和開發提供優良的出發菌株。

發明內容
本發明的目的是針對化學農藥不安全與微生物源農藥種類較少的不足，提供一種從樟樹中分離篩選出的內生真菌-鏈格孢菌(Alternaria alternata)；本發明的另一目的是提供利用該菌株代謝產物防治植物真菌病害的方法。本發明鏈格孢菌的分離、篩選與鑑定是於2008年6月在浙江杭州天目山採集的樟樹莖中，經分離、純化、培養、發酵和活性測定等步驟獲得並保存；經微生物分類學鑑定為鏈格孢菌(Alternaria alternata), 定名為鏈格孢菌(Alternaria alternata) 31。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號CGMCCNo. 4508。鏈格孢菌31，其固體培養特徵為菌落在PDA平板上28°C培養6_7天擴展至直徑為9cm，初期淺灰色稀疏，菌絲沿培養基表面匍匐生長，中間灰黑色，邊緣灰白色，反面黑色， 菌絲具隔，分枝。顯微形態特徵分生孢子梗單生；分生孢子橢圓形，圓形。本發明所述的鏈格孢菌31，經發酵提取可獲得對部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代謝產物。本發明目的通過以下技術方案來實現一種防治黃瓜立枯病、番茄灰黴病或西瓜枯萎病等植物真菌病害微生物代謝產物的製備方法，按以下步驟進行(1)菌種的活化培養將分離保存的鏈格孢菌31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28°C 士 1°C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為4mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用； (2)發酵培養發酵培養液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，可溶性澱粉 20g，麩皮 10g，蛋白腖 8g，NH4NO3 3g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 lg，每 300mL 三角瓶裝發酵培養液60mL ；配製後121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取1直徑為 4mm菌餅，在28°C 士 1°C條件下，搖床轉速180轉/分鐘，發酵培養126h ；(3)發酵物提取發酵完畢，離心收集發酵上清液，用常規有機溶劑萃取經真空濃縮後獲得浸膏，用於抑菌活性測定。本發明的有益效果一是本發明從植物樟樹莖中分離篩選出代謝物對部分植物真菌病害病原菌具有較強抑制作用的鏈格孢菌31，這為農業上防治植物真菌病害病原菌提供了一種微生物菌株；二是本發明提供了利用鏈格孢菌31發酵獲得活性代謝產物的方法；該代謝產物可應用於植物真菌病害的防治，為農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。
具體實施例方式實施例1 (鏈格孢菌31的分離與篩選)本發明於2008年6月在浙江杭州天目山採集樟樹莖，經表面消毒、內生真菌分離、 培養、發酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌活性菌株的篩選等步驟，從中獲得鏈格孢菌31，保存。鏈格孢菌31抑菌活性測定取經0. 22 μ m膜過濾的發酵上清液ImL於無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻，冷卻後在每個培養基平面分別放1個直徑為4mm的黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)或西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium) 或番茄灰黴病菌(Botrytis cinerea)等供試菌菌餅，菌餅接於培養皿中央(培養皿直徑為 9cm)，置培養箱中28°C培養72h，以無菌水處理作為對照，重複3次；採用十字交叉法測定菌
落直徑，以下列公式計算抑制率
菌絲生長抑制
對照菌落直徑-4測定結果表明鏈格孢菌31代謝產物對黃瓜立枯病菌、西瓜枯萎病菌和番茄灰黴病菌的抑制率分別為90. 9%、87. 5%和84. 6%。實施例2 (鏈格孢菌31發酵代謝產物的製備方法)按以下步驟進行(1)菌種的活化培養將分離保存的鏈格孢菌31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28°C 士 1°C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為4mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；(2)發酵培養發酵培養液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，可溶性澱粉 20g，麩皮 10g，蛋白腖 8g，NH4NO3 3g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 lg，每 300mL 三角瓶裝發酵培養液60mL ；配製後121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取1直徑為 4mm菌餅，在28°C 士 1°C條件下，搖床轉速180轉/分鐘，發酵培養126h ； (3)發酵物提取發酵完畢後離心收集發酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇萃取物，供抑菌活性測定。以下實施例3、4中所述的鏈格孢菌31代謝產物均為實施例2所制產品；所述產品的百分含量均為質量/體積百分比。實施例3 (鏈格孢菌31代謝產物對黃瓜立枯病菌、西瓜枯萎病菌和番茄灰黴病菌的抑制作用)(1)準確稱取鏈格孢菌31代謝產物0. 18g，並加入IOmL體積的無菌水，超聲波震蕩充分溶解，最終配置成濃度為18g/L的母液；(2)抑菌活性測定取上述母液分別稀釋成濃度為1800mg/L和900mg/L的溶液， 取各濃度溶液ImL於無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻(鏈格孢菌 31代謝產物終濃度為180mg/L和90mg/L)，冷卻後在每個培養基平面分別放1個直徑為4mm 的西瓜枯萎病菌或黃瓜立枯病菌或番茄灰黴病菌菌餅，菌餅接於培養皿中央(培養皿直徑為9cm)，置培養箱中28°C培養36h，以常規化學藥劑和無菌水處理作為對照，重複3次；採
用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率
權利要求
1.鏈格孢菌(Alternariaalternata) 31代謝產物防治黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)的應用。
2.權利要求1所述的應用，其中鏈格孢菌31代謝產物由以下方法獲得鏈格孢菌31經斜面活化培養、發酵培養獲得發酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇萃取物，所述的鏈格孢菌31已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為CGMCC No. 4508。
全文摘要
本發明涉及微生物技術領域，本發明所述的樟樹內生真菌是從浙江杭州天目山採集的樟樹植物活體中採用內生真菌分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑑定，命名為鏈格孢菌(Alternaria alternata)31，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號CGMCC No.4508。本發明最顯著的特徵是該菌株液體發酵能夠產生對植物真菌病害病原菌如黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium)和番茄灰黴病菌(Botrytis cinerea)等有抑制作用的活性代謝產物，是農業上重要的微生物資源。
文檔編號A01P3/00GK102204570SQ20111008820
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日
發明者俞曉平, 申屠旭萍, 董勝張, 邊亞琳, 郝培應, 馬正 申請人:中國計量學院