採用再循環微生物製備木糖醇的高產率方法
2023-06-18 14:18:46 4
專利名稱：採用再循環微生物製備木糖醇的高產率方法
技術領域：
本發明涉及一種通過在真空微量過濾生物反應器中對濃縮菌株進行再循環培養，由木糖連續生產木糖醇的高產率工藝。
背景技術：
木糖醇由化學家Emil Fisher於1981年首次報導，其為具有五個碳原子的糖醇，自1960年就被用作甜料。木糖醇在天然植物中被發現存在的量很少，例如水果，蔬菜以及蘑菇，並且是哺乳動物碳水化合物新陳代謝的媒介。此外，由於其甜度與蔗糖相等，並且其在分解時吸收熱量，木糖醇在口腔中使人感覺涼爽及清新的感覺。因此，木糖醇用作不含糖的糖果產品的原料。特別的，由於其在攝入後不需要胰島素起代謝作用，木糖醇可用作糖尿病患者的糖替代品。
木糖醇可通過抑制引起牙齒腐蝕的鏈球菌屬突變體的生長來防止產生齲齒，因此，木糖醇用作牙膏的原料。此外，木糖醇不參與梅拉德反應(Maillard反應)，而且是一種單糖，因此與蔗糖不同，不經過轉化。因此木糖醇不存在降解的風險，即使是在酸性環境下使用。此外，木糖醇具有低至95℃的沸點，因而可在不變性的情況下達到其沸點。因此，當用作糖衣時，木糖醇不特別要求溶解於水中。
木糖醇通過對取自植物的半纖維素的水解產物進行化學還原進行工業生產，例如白樺樹、玉米棒子等，或者採用微生物菌株將所述水解產物生物轉化成木糖醇。然而，關於化學生產方法，木糖或木糖醇從其它由半纖維素碎片衍生的水解產物中的分離和純化很困難，並且木糖或木糖醇的產量低至50-60％。而且，引起一些問題，例如高溫高壓反應的風險以及由於鹼的使用而帶來的廢物處理問題。為了解決這些問題，已經報導了採用微生物菌株進行工業規模的木糖醇生產。採用微生物菌株進行木糖醇生產具有成本效益，並能夠選擇性地將木糖轉化成木糖醇，從而有利於木糖醇的分離和純化。然而，其缺點在於，木糖醇產率低至2.0-3.0g/l-h，而且微生物菌株只能使用一次。由於這種原因，一旦培養結束，常規的木糖醇生產技術涉及用於再培養的製備步驟，例如洗滌與滅菌，從而使生產成本增加。
在使用假絲酵母菌屬菌株的木糖醇生產中，主要含有木糖的木糖或者半纖維素水解產物被用作碳源。作為氮源，使用含有各種維生素的複合氮源，例如酵母提取物、麥芽提取物、大豆粗粉等。這是因為假絲酵母菌屬菌株是相對複雜的營養缺陷型，因而在化學合成培養基中幾乎不產生木糖醇。在這方面，昂貴的複合培養基的使用就變成了增加木糖醇成本原因。
因此，為了解決上述採用微生物菌株的木糖醇生產問題，本發明開發了一種在化學成分確定的培養基中通過培養的微生物菌株的培養物來生產木糖醇的工藝。根據這種工藝，所述微生物菌株在從培養物中分離之後濃縮並進行再循環。這種木糖醇生產工藝可用於自動化的連續培養系統，由於簡化了培養過程並連續生產木糖醇，從而使生產成本降低。本申請的發明人由此完成了本發明。
發明內容
考慮到這些問題，本發明提供了一種化學成分確定的培養基，其用於產生木糖醇的假絲酵母菌屬菌株的培養。
本發明還提供了一種採用微生物菌株高產量生產木糖醇的工藝，其中菌株和培養濾液從培養物中分離，並且菌株被濃縮用於再循環。
按照本發明的一個方面，提供了一種用於發酵培養假絲酵母菌屬菌株的化學成分確定的培養基，其包括1-10g/l的尿素，1-10g/l的二磷酸鉀、0.01-1g/l的硫酸鎂，0.1-10mg/l的MnSO4·4H2O，0.1-10mg/l的CoCl2·6H2O，0.1-10mg/l的NaMoO4·2H2O，0.1-10mg/l的ZnSO4·7H2O，0.1-10mg/l的AlCl3·6H2O，0.1-10mg/l的CuCl2·2H2O，0.01-5mg/l的H3BO3，1-100mg/l的FeSO4·7H2O，0.1-10mg/l的抗壞血酸，1-100mg/l的生物素，1-100mg/l的膽鹼，和0.1-10mg/l的維生素B6。
按照本發明的另一方面，提供了一種通過將假絲酵母菌屬菌株再循環培養來高產量生產木糖醇的工藝，其包括將菌株接種在含木糖的培養基中，並在生物反應器中培養在木糖培養基中的菌株；從所述生物反應器中釋放培養物並將新配製的含木糖培養基引入到所述生物反應器中；從所述培養物中分離菌株和培養濾液；以及將菌株再循環到生物反應器中並從培養濾液中回收木糖醇。
所述假絲酵母菌屬菌株可以是熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)或者其變異菌株。
在本發明中使用的所述含木糖的培養基可以是上述化學成分確定的培養基(此後簡單稱之為「化學培養基」)，或者含有例如酵母提取物、麥芽提取物和大豆粗粉的複合氮源的複合培養基。然而，考慮到效率成本，例如生產成本，優選採用化學培養基。此時，木糖或者主要包括木糖的半纖維素水解產物用作碳源。
為了利於菌株的生長，所述化學培養基可輔以1-200mg/l葉酸，1-100mg/l的環己六醇，1-100mg/l的尼克酸，0.1-10mg/l的對氨基苯甲酸(p-aminobezoicacid)，1-100mg/l的泛酸，10-1000mg/l的核黃素，和1-100mg/l的維生素B1。
在本發明的生產工藝中，所述菌株通過補料分批培養法或分批培養法進行培養。
關於菌株的補料分批培養法，優選地，在培養基中逐漸補充木糖作為碳源，使木糖的濃度保持在40-50g/l(以培養基為基礎)的水平。此時，以400-600rpm的速度進行攪拌。
同時，通過真空微量過濾系統或者離心將釋放的培養物分離成菌株和培養物濾液。特別地，利用自動系統，優選使用真空微量過濾系統。真空微量過濾系統可以獨立地與生物反應器連接或者安裝於生物反應器中。
將從培養物中分離的菌株濃縮並再循環。優選地，所述菌株濃縮到濃度為10-100g/l培養基。
此後，將參照附圖，更詳細的描述按照本發明的用於高產量生產木糖醇的工藝的優選實施例。
然而，提供的這些實施例僅用於說明，而不限定本發明。
首先，本發明的整個生產工藝將參照圖4簡要描述，其圖示了裝備有真空微量過濾系統的生物反應器。
參見圖4，在生物反應器10中培養微生物菌種。通過蠕動泵20將產生的培養物傳送到微量過濾系統30中。此時，為了方便過濾，強迫性地將空氣經進氣口(未顯示)供應到微量過濾系統30中。在供給空氣過程中，當與固定在微量過濾系統30兩側上的中空纖維膜(未顯示)連接的真空泵40運轉時，在微量過濾系統30中通過壓滴引起壓差。由於所述壓差，允許培養物通過固定在微量過濾系統30兩側上的中空纖維膜。此時，沒有通過中空纖維膜的菌株濃縮在中空纖維膜的下部，然後通過用於再培養的蠕動泵20再循環到生物反應器10中。通過中空纖維膜的培養濾液通過真空泵40傳送到培養罐50中，由此通過通用純化工藝來產生木糖醇。
同時，當微量過濾系統30中的過濾完成時，以與培養物流動方向相反的方向將少量新鮮培養基加入到中空纖維膜中，以從中空纖維膜中除去菌株。然後，通過蠕動泵20將菌株再循環到生物反應器10中，並通過供給空氣使中空纖維膜恢復到以前的狀況。其後，在含有新鮮培養基的生物反應器10中再次進行培養，作為參照，數字11。
培養狀態通過底物(木糖)濃度，產物(木糖醇)濃度以及轉換成乾重的菌株濃度來確定。此時，優選按照標準曲線法採用濁度計(tubidimeter)來測定菌株濃度。
附圖簡述
圖1是表示木糖醇產率與熱帶假絲酵母細胞在本發明的化學培養基中的補料分批培養時間關係的曲線圖；圖2是表示木糖醇產率與熱帶假絲酵母細胞在複合培養基中的補料分批培養時間關係的曲線圖；圖3是表示對在本發明的化學培養基中初級培養的熱帶假絲酵母細胞進行離心，木糖醇產率與再循環培養時間關係的曲線圖；圖4是表示按照本發明的優選實施例的通過細胞再循環用於高產量木糖醇生產的儀器的模式圖(生物反應器10；蠕動泵20；微量過濾系統30；中空纖維膜32；真空泵40；培養罐50；壓縮機60；出風口12、31)；圖5是表示對在本發明的化學培養基中初級培養的熱帶假絲酵母細胞進行真空微量過濾，木糖醇產率與再循環培養時間關係的曲線圖；圖6是表示對在複合培養基中初級培養的熱帶假絲酵母細胞進行真空微量過濾，木糖醇產率與再循環培養時間關係的曲線圖；以及圖7是表示對在本發明的化學培養基中初級培養的熱帶假絲酵母細胞進行壓縮微量過濾，木糖醇產率與再循環培養時間關係的曲線圖。
具體實施例方式
實驗實施例木糖和木糖醇的濃度採用裝配有Sugar-Pak I柱(Millipore，USA)的HPLC(Shimadzu C-R6A，Japan)折光率探測器(Shimadzu RID-6A，Japan)來測定。此時，用作溶劑的水可以在70℃以0.6ml/min的速率流動。細胞濃度通過在600nm下採用濁度計測定濁度，並將該值與事先製備的標準曲線的值進行比較，在所述標準曲線中濁度與細胞乾重相關。溶解的氧濃度採用溶解氧電極(極譜型，Ingold Switzerland)來測定。
實施例1化學培養基種子培養將發表的熱帶假絲酵母細胞接種於裝在250ml燒瓶中的50ml生長培養基上，在240rpm 30℃的條件下培養10小時。
主培養物將種子培養物引入到裝有2L化學培養基的7L發酵罐(Biotron Ltd)中並培養，所述化學培養基包括150g/l木糖，5g/l尿素，5g/l的二磷酸鉀，0.2g/l的硫酸鎂，金屬鹽(7mg/l的MnSO4·4H2O，4mg/l的CoCl2·6H2O，2mg/l的NaMoO4·2H2O，2mg/l的ZnSO4·7H2O，1mg/l的AlCl3·6H2O，2mg/l的CuCl2·2H2O，0.5mg/l的H3BO3，40mg/l的FeSO4·7H2O)，以及維生素(5mg/l的抗壞血酸，10mg/l的生物素，25mg/l的膽鹼，50mg/l的葉酸，10mg/l的環己六醇，25mg/l的尼克酸，1mg/l的對氨基苯甲酸(p-aminobezoic acid)，5mg/l的泛酸，1mg/l的維生素B6，100mg/l的核黃素，25mg/l的維生素B1)。補料分批培養以下述方式進行在發酵期間，將1L含有510g木糖的溶液連續補充到發酵培養基中，使最終培養物的體積保持在3L，也就是說，是加入的木糖總濃度保持在270g/l。發酵條件如下攪拌速度為400rpm，整個發酵過程中的pH為5.0，發酵溫度為30℃，並且通風速率為1.0vvm。測定相對於發酵時間的木糖醇產率，結果顯示於圖1中。參見圖1，發酵120小時後，從270g/l木糖得到240g/l木糖醇。結果，由木糖生產木糖醇的收率為89％，木糖醇的產率為2.0g/l-h。這些結果顯示就木糖醇生產而言，可採用便宜的化學成分確定的培養基代替傳統的木糖醇生產培養基。
比較實施例1複合培養基種子培養將發表的熱帶假絲酵母KCTC 7221細胞接種於裝在250ml燒瓶中的50ml生長培養基上，在240rpm 30℃的條件下培養10小時。
主培養將種子培養物引入裝有2L的複合培養基的7L發酵罐中並培養，所述複合培養基由150g/l木糖，10g/l酵母提取物，5g/l的二磷酸鉀，0.2g/l的硫酸鎂組成。補料分批培養以下述方式進行在發酵期間，將1L含有510g木糖的溶液連續補充到發酵培養基中，使最終培養物的體積保持在3L，也就是說，是加入的木糖總濃度保持在270g/l。發酵條件如下攪拌速度為400rpm，整個發酵過程中的pH為5.0，發酵溫度為30℃，並且通風速率為1.0vvm。測定相對於發酵時間的木糖醇產率，結果顯示於圖2中。參見圖2，發酵108小時後，從270g/l木糖得到230g/l木糖醇。結果，由木糖生產木糖醇的收率89％，木糖醇的產率為2.0g/l-h。
實施例2通過離心對細胞進行再循環培養在與實施例1中相同的化學培養基中進行培養，在木糖即將耗盡之前，立即將培養物以5000rpm的速度離心20分鐘。將收集的細胞接種到2L的新配製的化學培養基上並進行再培養。此時，培養條件與實施例1中相同，並且木糖和木糖醇的濃度以與上述實驗實施例相同的方式進行測定。
離心之前2L初級培養物含有218g/l的木糖醇。此時，木糖醇產率為2.3g/l-h，並且木糖醇相對木糖的收率為74％。作為14輪再循環的結果，通過離心，從28L全培養物中得到3076g木糖醇，木糖醇的產率和收率分別為5.4g/l-h和82％(見圖3)。
與初級培養相比，通過離心14輪再循環培養後的產量、產率和木糖醇的收率，分別增加了14倍、2.4倍和8％。
通過上述結果，可以看出，與傳統的分批培養相比，通過本發明的細胞再循環，木糖醇的生產效率是非常顯著的。
實施例3通過真空微量過濾對細胞進行再循環培養(化學培養基)
在含有與實施例1相同的化學培養基的生物反應器中進行培養之後，在木糖即將耗盡之前，將培養物轉移到與生物反應器連接的真空微量過濾系統中，以分離耗盡的細胞和培養物濾液。用過的細胞再循環到含有2L新配製的化學培養基的生物反應器中並進行再培養。培養條件與實施例1相同(見圖4)。
此時，為真空微量過濾系統提供聚乙烯製成的中空纖維膜(孔隙率為0.45μm，Mitsubishi Rayon，Japan)。所述中空纖維膜與真空微量過濾系統兩側的矽管都連接。通過真空纖維膜，在由泵建立的真空中進行微量過濾。在與上述實驗實施例相同的方式測定木糖醇的濃度。
離心之前2L初級培養物含有194g/l的木糖醇。此時，木糖醇產率為2.0g/l-h，並且木糖醇相對木糖的收率為72％。作為通過微量過濾的8輪再循環培養的結果，從16L全培養物中得到2026g木糖醇，木糖醇的產率和收率分別為5.8g/l-h和87％。與初級培養相比，通過微量過濾8輪再循環培養後的產量、產率和木糖醇的收率，分別增加了10.4倍、2.9倍和15％。(見圖5)。
比較實施例2通過真空微量過濾對細胞進行再循環培養(複合培養基)在含有與比較實施例1相同的複合培養基的生物反應器中，在與實施例1中相同的培養條件下進行培養之後，在木糖即將耗盡之前，將培養物轉移到與生物反應器連接的真空微量過濾系統中，以分離耗盡的細胞和培養物濾液。分離的細胞再循環到含有2L新配製的化學培養基的生物反應器中並再培養。此時，使用的真空微量過濾系統與實施例3中相同。
微量過濾之前2L初級培養物含有118g/l的木糖醇。此時，木糖醇產率為2.5g/l-h，並且木糖醇相對木糖的收率為79％。作為通過微量過濾的7輪再循環培養的結果，從14L全培養物中得到972g木糖醇，木糖醇的產率和收率分別為5.4g/l-h和85％。與初級培養相比，通過微量過濾，8輪再循環培養後的產量、產率和木糖醇的收率，分別增加了8.2倍、2.2倍和6％。(見圖6)。
通過實施例3與比較實施例2的比較結果可以看出，化學培養基比複合培養基更適於再循環培養。
比較實施例3通過真空微量過濾對細胞進行再循環培養(化學培養基)在含有與實施例1相同的複合培養基和培養條件下培養之後，在木糖即將耗盡之前，採用加壓微量過濾系統(孔隙率為0.65μm，AmershamBiosciences，CFP-6-D-4MA)，以實施例3中相同的方式將用過的細胞和培養物濾液分離，用過的細胞進行再循環，回收培養物濾液以測定培養物濾液中的木糖醇濃度。
如圖7所示，微量過濾之前2L初級培養物含有110g/l的木糖醇。此時，木糖醇產率為2.3g/l-h，並且木糖醇相對木糖的收率為73％。作為通過微量過濾的2輪再循環培養的結果，從4L全培養物中得到179g木糖醇，木糖醇的產率和收率分別為2.7g/l-h和60％。與初級培養相比，通過微量過濾，2輪再循環培養後木糖醇產品的產量，和產率分別增加了1.6倍、1.2倍，但木糖醇的收率減少了13％。
通過上述結果可以判斷，在加壓微量過濾系統中通過加壓會使一些細胞破碎。
實施例4在含有與實施例1相同的培養基和培養條件下進行培養，同時在2-5L的範圍內改變培養基的體積。在真空微量過濾系統中將細胞濃縮到不同密度然後再循環。
將濃縮的細胞接種到新配製的化學培養基上(每個2L)並再次培養8小時。測定相對於細胞密度的木糖醇的總產率和具體產率，結果概述於下表1中。
此時，通過將8小時累計的木糖醇濃度除以8小時來計算木糖醇的總產率，通過總產率除以使用的細胞濃度來計算木糖醇的單位生產率。
結果，當細胞濃度為35g/l時，木糖醇產率為10.2g/l，收率為85％，得到最好的結果。
圖1
從表1中可以看出，與48小時平均產生97g/l木糖醇(總產率為2.0g/l-h)的普通培養相比，濃縮細胞通過真空微量過濾進行的再循環培養可提供高5倍的木糖醇產率和高10％的木糖醇收率。
工業實用性通過上述描述，很明顯，本發明提供了一種高產量的從木糖連續生產木糖醇的工藝，其通過將微生物菌株在化學成分確定的培養基中培養，在真空微量過濾生物反應器或者離心機中濃縮菌株，並對濃縮的菌株進行再循環。
因此，本發明的生產工藝可應用於自動化生產系統，並降低了培養前的準備過程的成本，這與普通發酵工藝不同，從而能夠大規模生產廉價的木糖醇。
權利要求
1.一種用於假絲酵母菌屬菌株發酵培養的化學成分確定的培養基，其特徵在於包括1-10g/l的尿素，1-10g/l的二磷酸鉀、0.01-1g/l的硫酸鎂，0.1-10mg/l的MnSO4·4H2O，0.1-10mg/l的CoCl2·6H2O，0.1-10mg/l的NaMoO4·2H2O，0.1-10mg/l的ZnSO4·7H2O，0.1-10mg/l的AlCl3·6H2O，0.1-10mg/l的CuCl2·2H2O，0.01-5mg/l的H3BO3，1-100mg/l的FeSO4·7H2O，0.1-10mg/l的抗壞血酸，1-100mg/l的生物素，1-100mg/l的膽鹼，和0.1-10mg/l的維生素B6。
2.一種通過將假絲酵母菌屬菌株再循環培養來高產量生產木糖醇的工藝，其特徵在於包括下列步驟將菌株接種在含木糖的培養基中，並在生物反應器中培養所述含在木糖培養基中的所述菌株；從所述生物反應器中釋放培養物並連續的將新配製的含木糖培養基引入到所述生物反應器中；從所述培養物中分離菌株和培養濾液；以及將所述菌株再循環到所述生物反應器中並從所述培養濾液中回收木糖醇。
3.根據權利要求2所述的工藝，其特徵在於其中所述假絲酵母菌屬菌株可以是熱帶假絲酵母Candida tropicalis或者其變異菌株。
4.根據權利要求2所述的工藝，其特徵在於使用的所述含木糖的培養基可以是權力要求1中的化學成分確定的培養基或者複合培養劑。
5.根據權利要求2所述的工藝，其特徵在於通過補料分批培養或者分批培養進行所述培養。
6.根據權利要求5所述的工藝，其特徵在於在補料分批培養中，培養基逐漸補充木糖，使木糖的濃度以培養基為基礎保持40-50g/l。
7.根據權利要求2、4、5和6中的任何一項所述的工藝，其特徵在於其中所述培養以400-600rpm的攪拌速度進行攪拌。
8.根據權利要求2所述的工藝，其特徵在於通過真空微量過濾系統或離心從培養物中分離菌株和培養物濾液。
9.根據權利要求2或8所述的工藝，其特徵在於將分離的菌株濃縮到濃度為10-100g/l並再循環。
全文摘要
本發明提供一種以高產量和產率連續生產木糖醇的工藝，所述工藝採用裝有用於假絲酵母菌屬菌株的發酵培養基的真空微量過濾生物反應器，所述培養基包括5－300g/l的木糖，1－10g/l的尿素，1－10g/l的二磷酸鉀、0.01－1g/l的硫酸鎂，0.1－10mg/l的MnSO
文檔編號A23L1/236GK1890363SQ200480036526
公開日2007年1月3日 申請日期2004年11月22日 優先權日2003年12月8日
發明者吳德根, 金澤範, 金政勳, 金成俌, 樸承源, 金舜哲 申請人:Cj株式會社